異戊二烯合成酶研究進展

茍艷，劉忠川，王剛剛

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異戊二烯合成酶研究進展

茍艷1,2,3，劉忠川1,2，王剛剛1,2

1 中國科學院成都生物研究所中國科學院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川成都 610041 2 中國科學院成都生物研究所環(huán)境微生物四川省重點實驗室，四川成都 610041 3 中國科學院大學，北京 100049

茍艷, 劉忠川, 王剛剛. 異戊二烯合成酶研究進展. 生物工程學報, 2017, 33(11): 1802–1813.Gou Y, Liu ZC, Wang GG. Advances in isoprene synthase research. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1802–1813

異戊二烯(Isoprene) 的排放具有特殊的生物學功能，對大氣環(huán)境具有重要影響，另外，異戊二烯也是一種具有廣泛用途的化合物。在生物體內(nèi)，異戊二烯是由異戊二烯合成酶(Isoprene synthase，Isps) 催化烯丙基二磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP) 脫去焦磷酸 (Pyrophosphate) 而生成的。因此，作為異戊二烯合成過程中的關(guān)鍵酶，Isps在異戊二烯的自然排放和生物合成過程都發(fā)揮著重要的作用，對Isps的研究具有非常重要的意義。到目前為止，已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了該酶，研究表明，來源于不同生物的異戊二烯合成酶具有保守的結(jié)構(gòu)特征和相似的生化性質(zhì)。文中就Isps的最新研究進展進行綜述，包括比較分析不同生物來源Isps的生化特征和結(jié)構(gòu)特征，探討催化機制，并對該酶在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用進行展望。

異戊二烯，異戊二烯合成酶，生化特征，結(jié)構(gòu)特征，催化機制

異戊二烯 (2-甲基-1,3-丁二烯，isoprene) 是一種揮發(fā)性的五碳萜類化合物。1957年，Sanadze等第一次發(fā)現(xiàn)了木本植物排放異戊二烯，此后，人們發(fā)現(xiàn)其他生物也具有這種能力，包括動物、真菌、細菌等[1-3]。異戊二烯的排放是大氣中碳氫化合物最主要的生物來源，據(jù)估計，全球異戊二烯在大氣中的年均自然排放量約幾百兆克，與大氣中各種來源的甲烷排放量相當[4]。生物排放異戊二烯的過程對其自身具有一定的保護作 用[5-7]，但同時會對大氣帶來不良影響[8-9]，另外，異戊二烯還是一種具有重要用途的化工原料，被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、能源等領(lǐng)域[5]。

異戊二烯是最簡單的類異戊二烯家族成員,所以人們推斷它可能來源于類異戊二烯的生物合成途徑中共有的五碳中間代謝物。Sanadze等認為異戊二烯的形成是一個非酶過程，它是由酸催化烯丙基二磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，離子化DMAPP中的焦磷酸基團，產(chǎn)生一個過渡態(tài)的碳正離子而形成異戊二烯[10]。直到1991年，Sliver等在山楊michx.的樹葉中發(fā)現(xiàn)了異戊二烯合成酶，該酶能夠在中性pH條件下發(fā)揮作用[11]，后來，在其他植物中也分離純化到了Isps，在一些細菌的粗酶液中也檢測到該酶的活性，并證明了在這些生物中，異戊二烯是由Isps催化形成的[12]。

異戊二烯合成酶能夠催化類異戊二烯中間體——烯丙基二磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，生成異戊二烯(Isoprene) 和焦磷酸(Pyrophosphate)，該反應(yīng)依賴二價陽離子[13]。異戊二烯合成酶是自然條件下異戊二烯排放過程的關(guān)鍵酶，其基因表達量和酶活性能夠調(diào)控異戊二烯的排放量，因此，Isps在異戊二烯的排放過程中具有重要的作用。本文就Isps最新研究進展進行綜述，比較分析不同生物來源的Isps的生化特征、結(jié)構(gòu)特征，探討其催化機制，并對該酶在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用進行展望。

1 異戊二烯合成酶的生化特征

到目前為止，人們已經(jīng)對多種不同來源的Isps進行了研究，并對它們的生化特征進行分析，包括分子量大小、最適pH、最適溫度、催化反應(yīng)需要的二價陽離子等。從表1可以看出，它們具有一些相似的生化特性，但也有一定的差別：第一，Isps的活性對溫度有很強的依賴性,最適溫度一般為35–40 ℃，在55–60 ℃的范圍快速失活，目前，只有英國櫟Isps的最適溫度達到了50 ℃[14]；第二，大多數(shù)植物來源的Isps最適pH在7.5–8.0之間，例如橡樹、楊樹等[11,13-15]，而苔蘚植物Isps的最適pH在8.6左右[16]，褪色柳Isps的最適pH約為10[17-18]，另外，與植物Isps相比，細菌Isps的最適pH較低，如枯草芽孢桿菌Isps粗酶液的最適pH為6.2[19]；第三，大多數(shù)異戊二烯合成酶催化活性主要依賴于Mg2+和Mn2+[13,15], 但對于苔蘚植物，如曲柄蘚屬植物，它的Isps催化活性相較于Mg2+更加優(yōu)先利用Mn2+[16]；第四，Isps的米氏常數(shù)通常達到mmol/L水平，與單萜合酶、倍半萜合酶的米氏常數(shù)相比要高2–3個數(shù)量級[20]。

另外，已知的所有植物異戊二烯合成酶均位于葉綠體中，但具有兩種不同的存在形式，一種結(jié)合在內(nèi)囊體膜上，另一種處于溶解狀態(tài)。Silver和Kuzma分別在山楊和絨毛豆樹葉的葉綠體中提取出了溶解狀態(tài)的異戊二烯合成酶[13,15]，后來，Wildermuth和Fall又在褪色柳等植物中發(fā)現(xiàn)了緊密結(jié)合在內(nèi)囊體膜上的異戊二烯合成酶，他們使用了多種溶解方法均不能使該酶從膜上脫落下來而保持活性[17-18]。這兩種不同形式的異戊二烯合成酶的性質(zhì)基本類似，只是結(jié)合于膜上的酶具有較高的最適pH (pH 10)[15]。

2 異戊二烯合成酶的結(jié)構(gòu)特征

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找不同來源的Isps及其他萜類合成酶的序列，利用clustal omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) 進行序列比對，比對結(jié)果再用Aline軟件編輯[27](圖1)。序列比對結(jié)果表明，不同來源的Isps之間，以及Isps與其他的萜類合成酶之間均具有較高的序列相似性。例如，來源于不同種類楊樹的異戊二烯合成酶的氨基酸序列具有97%–100%的相似性，而來源于雜交灰楊×樹葉的異戊二烯合成酶 (PcIsps) 與植物單萜合成酶的氨基酸序列具有約50%的相似性。

萜類合成酶 (Terpene synthases，Tps) 是指能夠?qū)⒑愇於┗沽姿岬姆黔h(huán)狀結(jié)構(gòu)前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成萜類分子的一類酶[36]。根據(jù)反應(yīng)機理和產(chǎn)物形式可以將該酶分成兩種類型，分別為Tps-I和Tps-II[37-38]。已知的大多數(shù)萜類合成酶都是Tps-I類型的，也有少數(shù)萜類合成酶同時具有Tps-I和Tps-II兩種類型的功能域。另外，根據(jù)Tps的生化功能、亞細胞定位、底物專一性以及產(chǎn)物的信息和定位，可以將Tps的基因分為7個進化分支，分別為-a、b、c、d、e/f、g、h[39]，這7個進化分支中均具有Ⅰ型酶，而Ⅱ型酶僅限于Tps-c中[38]。其中Isps屬于Ⅰ型萜類合成酶，基因?qū)儆赥ps-b進化分支[25]。

表1 不同來源的異戊二烯合成酶的生化特征比較

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圖1 異戊二烯合成酶以及其他的萜類合成酶之間的氨基酸序列比對

目前僅有PcIsps和PtIsps的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，它們分別來源于雜交灰楊×和美洲山楊的樹葉，且這兩種Isps的氨基酸序列具有98.5%的一致性[5,40]。通過比較這兩種酶的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，它們具有同型結(jié)構(gòu)，都是由兩個α螺旋結(jié)構(gòu)域組成。它們的N末端為α-桶狀的Ⅱ型萜類合酶折疊模式，沒有催化活性；而包含活性位點的C末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域具有Ⅰ型萜類合酶折疊模式，并且兩個單體能夠通過C端催化結(jié)構(gòu)域的相互作用形成二聚體形式。分析PcIsps結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在該酶C端的催化結(jié)構(gòu)域中具有兩個保守的金屬離子結(jié)合基序，一個是富含天冬氨酸的DDXXD序列，另一個是“NSE/DTE”序列 (NDXXSXXXE)，這兩個基序在植物、細菌、真菌來源的萜類環(huán)化酶中保守，異戊二烯合成酶是發(fā)現(xiàn)的第一個具有這兩種基序的非環(huán)化萜類合成酶[5]，而一般的非環(huán)化萜類合成酶具有兩個富含天冬氨酸的序列，如催化類異戊二烯的鏈延伸反應(yīng)的法尼基焦磷酸合酶[41]。

另外，在異戊二烯合成酶C末端的活性位點一般具有兩個保守的苯丙氨酸，它們分別位于活性位點的兩端，通過與底物產(chǎn)生范德華力而使活性口袋減小，從而阻止比DMAPP更大的底物與之結(jié)合。而這些氨基酸殘基并不存在于Tps-b家族的單萜合酶或者其他的萜類合成酶中，因為它們的底物更大，是十碳或者具有更多碳原子的含異戊二烯基的焦磷酸。因此，推測這些氨基酸殘基的作用與底物特異性有關(guān)[5,23,41]。

3 異戊二烯合成酶的催化機制

早在1995年，Silver等就已提出異戊二烯的生物合成是一個由金屬離子(如Mg2+、Mn2+等) 觸發(fā)的DMAPP去焦磷酸過程[13]。通過分析PcIsps與底物類似物DMASPP (DMAPP中磷酸酯鍵的氧原子被替代為硫原子) 以及3個Mg2+形成的復合體 (PcIsps-(Mg2+)3-DMASPP) 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DMASPP與PcIsps活性位點上的氨基酸形成氫鍵，其焦磷酸基團上的氧原子能與Mg2+形成配位鍵；Mg2+通過與金屬離子結(jié)合基序中的氨基酸形成配位鍵而結(jié)合在活性位點 上[5,42-43](圖2)。一般在Ⅰ型萜類合成酶中，當?shù)孜锱c3個金屬離子結(jié)合到活性位點形成復合體后，該酶的活性口袋將由開放狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚]合狀態(tài)，推測這一構(gòu)象變化是為了防止催化過程中形成的碳正離子中間體過早淬滅，從而避免對萜類化合物的形成造成影響[5,44-46]。

圖2 雜交銀灰楊異戊二烯合成酶(PcIsps)活性中心結(jié)合底物類似物(DMASPP)和Mg2+的結(jié)構(gòu)

通過對結(jié)構(gòu)的進一步分析表明，異戊二烯的生物合成是通過烯丙基二磷酸中間體經(jīng)過兩步反應(yīng)得到的(圖3)。在Isps的催化作用下,底物DMAPP形成烯丙基的碳正離子中間體，通過順疊消除機制脫去無機焦磷酸基團(PPi)，然后烯丙基的甲基基團C31再發(fā)生去質(zhì)子化，最終形成產(chǎn)物，這一過程與許多單萜合成酶的起始步驟是一致的。在該催化反應(yīng)過程中，底物甲基基團C31的去質(zhì)子化還需要合適的廣義堿幫助，而有趣的是，在這里提供廣義堿的是離開底物DMAPP的焦磷酸基團。另外，對PcIsps-Mg2+- DMASPP復合體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，DMASPP以七元環(huán)椅式結(jié)構(gòu)結(jié)合到PcIsps上，這個構(gòu)象使DMASPP的α-磷酸基團的氧原子更加接近C31原子，從而表明底物DMASPP對順疊消除機制的幫助[5,47]。另外，Isps在催化過程中具有正協(xié)同作用。Isps單體能夠通過C端催化域的相互作用而形成同型二聚體，在PcIsps研究中發(fā)現(xiàn)，當?shù)孜锱c該酶結(jié)合后，二聚體界面發(fā)生了一定的構(gòu)象變化，在兩個單體之間新形成了2個氫鍵和4個鹽橋。這些結(jié)構(gòu)特點也許正是Isps具有正協(xié)同作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5,48-50]。

4 異戊二烯合成酶與自然界中異戊二烯排放

生物向大氣排放大量的異戊二烯，據(jù)估計每年植物的排放量大約為600兆克/年，相當于生物來源的揮發(fā)性有機化合物(Biogenic volatile organic compound，BVOC) 排放總量的1/3[51]。異戊二烯的排放對這些生物具有一定的作用，但同時也對大氣環(huán)境產(chǎn)生較大的影響，從異戊二烯合成酶發(fā)現(xiàn)以來，科學家們在這方面進行了大量的研究工作。

其一，研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的生物都具有異戊二烯的排放能力，對于研究的主要對象——陸生植物來說，也并不是都具有此能力[52]，據(jù)統(tǒng)計，超過1/3的被子植物和裸子植物，約一半的蕨類植物以及94%的苔蘚植物能夠排放異戊二烯，但它們的排放能力具有差異[53]，這說明異戊二烯的排放對生物來說并不是必需的，或者說具有可替代的途徑。而關(guān)于異戊二烯排放對生物的作用，目前還不是很清楚。對于研究最多的植物而言，也僅僅部分了解，例如，有研究發(fā)現(xiàn)異戊二烯可以與受紫外激發(fā)形成的單線態(tài)氧在體內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)生異丁烯醛和甲基乙烯基酮，這兩種產(chǎn)物的熱穩(wěn)定差，可以從植物體內(nèi)排出，從而防止單線態(tài)氧進一步形成其他的活性氧而損傷植物[54]。另外，也有文獻表明排放異戊二烯可以保護這些植物不受高溫、輻射、臭氧等環(huán)境壓力的破壞；可以穩(wěn)定脂膜以避免熱誘導引起的相變；可以直接或間接地防衛(wèi)草食動物危害植物 等[5-6,55]。通過對異戊二烯合成酶基因進行系統(tǒng)進化分析等研究，了解異戊二烯排放能力的演變，從而有望了解生物排放異戊二烯的具體 作用。

圖3 Isps催化機制(Isps催化生成異戊二烯是通過烯丙基二磷酸中間體經(jīng)過兩步反應(yīng)得到，首先是DMAPP通過順疊消除機制而脫去焦磷酸基團，然后是C31去質(zhì)子化形成異戊二烯)

其二，每年大量異戊二烯的排放對大氣化學產(chǎn)生巨大的影響，它通過與羥自由基、氮氧化物等反應(yīng)而提高大氣中的臭氧、有機酸、有機硝酸鹽濃度，延長了溫室氣體甲烷在大氣中的壽命，形成二次有機氣溶膠等[8-9]。通過對異戊二烯合成酶的研究發(fā)現(xiàn)，Isps催化形成異戊二烯的過程受到復雜的調(diào)控，涉及酶的熱動力學、代謝流及其反饋作用、細胞器內(nèi)外的代謝物交換等[56-57]，Isps的活性受到光照、溫度、細胞內(nèi)二氧化碳濃度等因素的影響[52,58-60]。只有對這些調(diào)控因素進行深入研究，研究人員才能更準確地估計異戊二烯的排放率，以及伴隨著異戊二烯排放而給大氣環(huán)境造成的影響[61]。

5 異戊二烯合成酶與人工合成異戊二烯

異戊二烯是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括形成以異戊二烯為基礎(chǔ)的燃料，作為石油派生聚合物的合成前體，應(yīng)用于合成橡膠、農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及黏結(jié)劑生產(chǎn)等[62-65]。目前，異戊二烯主要是通過石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學合成法 (包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解 C5餾分萃取蒸餾法生產(chǎn)。然而，隨著化石資源的日益枯竭，開發(fā)新的異戊二烯合成技術(shù)已成為當前發(fā)展的必然趨勢[65]，而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯具有經(jīng)濟、清潔、可持續(xù)等得天獨厚的優(yōu) 勢[66-67]，因而受到了廣泛關(guān)注和深入研究。

微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)異戊二烯可以分為兩個部分，首先是通過2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑 (Methylerythritol-phosphate pathway，MEP)或者甲羥戊酸途徑 (Mevalonate pathway，MVA)合成前體物質(zhì)DMAPP，DMAPP經(jīng)Isps催化形成異戊二烯。如果合成的DMAPP不能及時轉(zhuǎn)化而過量積累，會對宿主細胞造成毒性。因此，如何提高Isps的催化效率，加快DMAPP轉(zhuǎn)化成異戊二烯的速率成了提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵。

因此，通過蛋白質(zhì)工程改造異戊二烯合成酶是目前研究的重點之一，即對Isps進行修飾改造提高其活性，從而實現(xiàn)在微生物中高效合成異戊二烯[16,68]。目前對楊樹 (Poplar) 和葛藤(Kudzu vine) 兩個植物家族來源的Isps研究較為深入，且已經(jīng)解析了PcIsps和PtIsps的晶體結(jié)構(gòu)。在這些工作的基礎(chǔ)上，通過蛋白質(zhì)工程改造異戊二烯合成酶方面的研究工作已經(jīng)取得了一些成果。如對來源于銀白楊的Isps進行改造，截掉氨基酸序列N末端的L90R突變體的活性明顯提升[69]；柳樹、來源的Isps的S288C突變體也具有比野生型更高的穩(wěn)定性[40]。另外，有研究結(jié)果顯示，將銀白楊來源的Isps在釀酒酵母中表達生產(chǎn)異戊二烯，經(jīng)過一系列代謝調(diào)控優(yōu)化后，在搖瓶條件 下培養(yǎng)24 h異戊二烯產(chǎn)量能達到23.6 mg/L。而在此基礎(chǔ)上，根據(jù)Isps的催化機制和結(jié)構(gòu)信息對其進行定向進化改造，發(fā)現(xiàn)A570T/ F340L突變株生產(chǎn)異戊二烯的產(chǎn)量可以達到50.2 mg/L[70-71]。

除了改造已知的Isps，從自然環(huán)境或者基因庫中發(fā)現(xiàn)新的也是目前的研究熱點之一。例如，發(fā)現(xiàn)豆類中的可用于發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯；在大腸桿菌中異源表達花生能使異戊二烯的產(chǎn)量提高到35 mg/(L·h·)[72]；通過同源性克隆和在基因庫搜索符合楊樹Isps活性位點特征的萜類合酶等方法發(fā)現(xiàn)了9種新的被子植物，并且這些在大腸桿菌中表達后具有活性，其中藍桉樹Isps的m比其他已知的Isps都低[25]；新的研究發(fā)現(xiàn)，甘薯、芒果、杜英的Isps都能在大腸桿菌中表達并具有催化活性，且甘薯來源的Isps產(chǎn)異戊二烯的能力優(yōu)于已知的楊樹、葛藤屬的Isps[73]。另外，除了植物來源的Isps外，人們也致力于發(fā)掘微生物來源的Isps，例如枯草芽孢桿菌的粗酶液具有Isps活性，它的最適pH為6.2，并且所需要的二價陽離子水平很低 (100 mmol/L)[19]，這樣的催化條件與宿主微生物的培養(yǎng)條件更接近。如果能夠鑒定枯草芽孢桿菌的Isps編碼基因，將其表達用于發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯可能會獲得更高的產(chǎn)量。

另外，選擇合適的宿主構(gòu)建微生物細胞工廠對于人工生產(chǎn)異戊二烯具有重要意義。構(gòu)建產(chǎn)異戊二烯的工程菌株首先就要使外源的能夠在該微生物中表達，植物來源的在導入微生物中需要經(jīng)過一些修飾，包括切除定位到葉綠體的信號肽、優(yōu)化密碼子等[20]。目前常用的表達宿主有枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藍細菌以及釀酒酵母[20]。在這些宿主細胞中已經(jīng)存在異戊二烯前體化合物的合成途徑，通過優(yōu)化前體合成途徑和異源表達Isps便可實現(xiàn)異戊二烯合成。

6 結(jié)語

從發(fā)現(xiàn)異戊二烯合成酶到現(xiàn)在已經(jīng)有30多年的歷史，通過研究人員的廣泛研究，使我們對該酶的基本生化特征和結(jié)構(gòu)功能都有了一定的認識。這些研究成果不僅對人們認識大氣中的異戊二烯排放有重要意義，而且對人工合成異戊二烯具有重要的指導作用。由于不同來源的異戊二烯合成酶在結(jié)構(gòu)、生化特征等方面具有多樣性，因此，今后仍需要對異戊二烯合成酶進行深入研究，主要包括：1) 異戊二烯合成酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，基于結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系對酶進一步改造，以提高Isps的催化效率；2) 發(fā)掘新的異戊二烯合成酶，擴大異戊二烯合成酶的基因庫，為微生物發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯提供更多的選擇。只有系統(tǒng)深入地研究異戊二烯合成酶的生化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，才能更好地改造和利用該酶。

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(本文責編 郝麗芳)

Advances in isoprene synthase research

Yan Gou1,2,3, Zhongchuan Liu1,2, and Ganggang Wang1,2

1,,,610041,,2,,,610041,,3,100049,

Isoprene emission can lead to significant consequence for atmospheric chemistry. In addition, isoprene is a chemical compound for various industrial applications. In the organisms, isoprene is produced by isoprene synthase that eliminates the pyrophosphate from the dimethylallyl diphosphate. As a key enzyme of isoprene formation, isoprene synthase plays an important role in the process of natural emission and artificial synthesis of isoprene. So far, isoprene synthase has been found in various plants. Isoprene synthases from different sources are of conservative structural and similar biochemical properties. In this review, the biochemical and structural characteristics of isoprene synthases from different sources were compared, the catalytic mechanism of isoprene synthase was discussed, and the perspective application of the enzyme in bioengineering was proposed.

isoprene, isoprene synthase, biochemical characteristics, structure features, catalytic mechanism

February 13, 2017;

April 19, 2017

Ganggang Wang. Tel/Fax: +86-28-82890828; E-mail: wanggg@cib.ac.cn

Supported by:The 100 Talents Program of the Chinese Academy of Sciences(CAS).

中國科學院百人計劃項目資助。