黃芪多糖對低氧環(huán)境中BMSCs成脂分化的影響

伍志偉，劉丹，劉永琦，薛娜，顏春魯，蘇韞

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黃芪多糖對低氧環(huán)境中BMSCs成脂分化的影響

伍志偉1,2，劉丹1，劉永琦1,2，薛娜1，顏春魯1，蘇韞1

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000 2甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000

伍志偉, 劉丹, 劉永琦, 等. 黃芪多糖對低氧環(huán)境中BMSCs成脂分化的影響. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(11): 1850–1858.Wu ZW, Liu D, Liu YQ, et al. Effects of Astragalus polysaccharides on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in low oxygen environment. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1850–1858.

探討黃芪多糖 (APS) 對低氧環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs) 成脂誘導(dǎo)分化的影響。采用四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 法篩選促進(jìn)BMSCs增殖的最佳APS濃度，干預(yù)不同氧濃度下 (3%、6%、10%和20%) 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs，通過油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，Real-time PCR和Western blotting檢測成脂相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPAR-γ2) 和脂蛋白脂肪酶 (LPL) 的mRNA和蛋白水平。結(jié)果表明，與對照組相比，40 μg/mL APS能顯著促進(jìn)不同氧濃度下BMSCs的增殖 (<0.05)；含有40 μg/mL APS的成脂誘導(dǎo)劑能提升低氧環(huán)境中BMSCs內(nèi)脂滴含量及PPAR-γ2和LPL的蛋白和mRNA水平，在氧濃度為10%時其促進(jìn)作用較顯著 (<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。40 μg/mL APS具有促進(jìn)低氧環(huán)境中BMSCs增殖和成脂誘導(dǎo)分化的作用，其促分化作用與細(xì)胞培養(yǎng)的氧環(huán)境相關(guān)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，低氧環(huán)境，黃芪多糖，成脂分化

來源于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 因其具有自我更新和多向分化的潛能，而被作為理想的生物工程種子細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、基因工程和細(xì)胞治療等臨床領(lǐng)域[1-3]。然而，大量研究表明，包括BMSCs在內(nèi)的多能干細(xì)胞，極易受到炎性介質(zhì)[4]、X射線[5]、低氧環(huán)境[6-7]等因素的影響，引起細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及修飾過程的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分化異常，甚至造成BMSCs惡性轉(zhuǎn)變，極大地限制了BMSCs的臨床應(yīng)用和開發(fā)前景。

氧作為生物機(jī)體新陳代謝的重要營養(yǎng)組分，在促進(jìn)和維持生物體生長發(fā)育以及細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用。機(jī)體不同組織或體液中氧濃度分布客觀地反映了生物體新陳代謝的特殊性，這也為解析組織器官功能和細(xì)胞分化與更新提供了理論依據(jù)。同時，黃芪多糖 (polysaccharides) 作為黃芪主要有效活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)細(xì)胞增殖的功效[8-10]。低氧環(huán)境與APS結(jié)合起來是否具有促進(jìn)BMSCs分化的作用？本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，應(yīng)用APS干預(yù)成脂誘導(dǎo)的BMSCs，探析APS對低氧環(huán)境中BMSCs成脂分化的作用，這將為解析黃芪多糖的臨床療效和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 BMSCs細(xì)胞株

Wistar大鼠BMSCs細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定獲得。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素 (Gibco)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (賽業(yè)生物科技有限公司)；油紅Ｏ染色試劑盒 (杰美基因)；RNA提取試劑盒 (TaKaRa)；PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix EX(Roche)；大鼠PPAR-γ2、LPL單克隆抗體和羊抗鼠IgG-HRP (Abcam)；PPARγ2和LPL引物 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司)；倒置顯微鏡 (OLMYPUS)；Real-Time PCR儀 (Bio-Rad)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (SANYO)。

2 方法

2.1 APS對低氧環(huán)境中BMSCs增殖的影響

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組

依據(jù)氧濃度及APS濃度，實(shí)驗(yàn)共分為24組，其中氧濃度分為3%、6%、10%和20%四個梯度，黃芪多糖濃度分為0、10、20、40、80和100 μg/mL6個梯度，共計4×6組。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)第3代 (G3) BMSCs至融合達(dá)到80%?90%時，將其消化制成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基 (10% FBS的高糖DMEM/F12) 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104cells/cm2，接種于96孔板 (200 μL/well)，細(xì)胞終濃度為2×103cells/well；置于常氧環(huán)境、37 ℃、5% CO2、相對濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h (即細(xì)胞貼壁) 后，棄上 清，依次加入含有不同濃度APS的完全培養(yǎng)基 (200 μL/well)，每濃度3個重復(fù)；置于不同氧濃度、37 ℃、5% CO2、相對濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.1.3 MTT檢測

分別取培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的上述BMSCs，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍后，依次加入含0.5%的MTT完全培養(yǎng)基 (200 μL/well)，于對應(yīng)氧濃度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜 (150 μL/well)，置搖床低速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀490濾光片檢測各孔吸光值。

2.2 APS對低氧環(huán)境中BMSCs成脂誘導(dǎo)分化的影響

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分為空白組、黃芪多糖組、誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組，同時設(shè)立3%、6%、12%和20%四個氧濃度梯度，共計4×4組。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)G3代BMSCs至融合達(dá)到80%?90%時，用含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液消化，按2×104cells/cm2細(xì)胞密度接種于6孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，置于常氧環(huán)境、37 ℃、5% CO2、相對濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合達(dá)到100%，棄完全培養(yǎng)基。空白對照組加完全培養(yǎng)基、黃芪多糖組加含有40 μg/mL黃芪多糖的完全培養(yǎng)基、誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液A和B (具體操作見Cyagen Biosciences lnc RAWMX90031說明書)、誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組加入含有40 μg/mL黃芪多糖成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液A和B (具體操作同誘導(dǎo)劑組)，2 mL/well；置于3%、6%、10%和20%四個氧濃度環(huán)境，每隔3 d換液1次，持續(xù)培養(yǎng)22 d。

2.2.3 油紅O染色分析

成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，每孔加入2 mL 4%中性甲醛于4 ℃固定30 min；棄甲醛，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL油紅O染液染色30 min；棄染液，PBS洗滌2次，于相差顯微鏡下觀察脂滴形成。

2.2.4 Real-time PCR分析

提取2.2.2培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，以表1序列為引物，采用Real-time PCR檢測成脂相關(guān)基因PPAR-γ2和LPL的mRNA水平，具體操作見RNA提取試劑盒 (TaKaRa)、PrimeScript RT reagent kit和SYBR premix EX(Roche) 說明書。

2.2.5 Western blotting分析

提取2.2.2培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜；將膜置于3%脫脂奶粉中4 ℃過液封閉，棄封閉液；分別加入1∶500大鼠PPAR-γ2和LPL單克隆抗體 (Abcam)，室溫孵育4 h，棄一抗，用PBST洗滌3次；加入1∶600二抗，室溫孵育2 h，棄二抗，應(yīng)用Western blotting ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 (Bio-Rad)進(jìn)行染色，具體操作見說明書；將膜置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

表1 引物序列

2.3 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 APS對低氧環(huán)境中BMSCs增殖的分析

由MTT分析顯示，在不同氧濃度下，不同黃芪多糖濃度對BMSCs增殖有不同程度的影響。與對照組相比，當(dāng)氧濃度在3%、6%、10%和20%時，10 μg/mL和20 μg/mL黃芪多糖對BMSCs增殖作用不顯著，40 μg/mL黃芪多糖對BMSCs有明顯的促增殖作用；當(dāng)黃芪多糖濃度在80 μg/mL和100 μg/mL時，對BMSCs增殖有一定的抑制作用；當(dāng)氧濃度在6%、10%和20%時，40 μg/mL黃芪多糖對BMSCs促增殖作用顯著 (<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

3.2 油紅O染色分析

由圖可知，在3%、6%、10%和20%四個氧濃度下，空白組和黃芪多糖組細(xì)胞內(nèi)均不存在或有極少量的棕紅色脂滴，兩組間差異不顯著(>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；而在誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組中，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的棕紅色脂滴，誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組高于誘導(dǎo)組 (<0.05)，與空白組和黃芪多糖組相比差異極顯著 (<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義；且在10%氧濃度下，誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量最高，見圖2。

圖1 黃芪多糖干預(yù)的不同氧環(huán)境中BMSCs增殖曲線(A?D：3%、6%、10%和20%的氧濃度)

3.3 Real-time PCR分析

在3%、6%、10%和20%四個氧濃度下，空白組和黃芪多糖組細(xì)胞中成脂相關(guān)基因PPAR-γ2(圖3A) 和LPL (圖3B) 的mRNA水平顯著低于誘導(dǎo)劑組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組 (<0.01)，誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組高于誘導(dǎo)劑組 (<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和黃芪多糖組間差異不顯著 (>0.05)；同時，在誘導(dǎo)劑組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組中，10%氧濃度下的PPAR-γ2和LPL mRNA水平顯著高于其他氧濃度 (<0.05)，見圖3。

3.4 Western blotting分析

在3%、6%、10%和20%四個氧濃度下，空白組和黃芪多糖組細(xì)胞中成脂相關(guān)基因PPAR-γ2(圖4A) 和LPL (圖4B) 的蛋白水平顯著低于誘導(dǎo)劑組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組 (<0.01)，誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組高于誘導(dǎo)劑組 (<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組和黃芪多糖組間差異不顯著(>0.05)；同時，在誘導(dǎo)劑組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組中，10%氧濃度下的PPAR-γ2和LPL蛋白水平顯著高于其他氧濃度 (<0.05)，見圖4。

圖2 成脂誘導(dǎo)BMSCs油紅O染色分析(A–D：分別代表空白組、黃芪多糖組、誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)劑+黃芪多糖組，1–4分別代表3%、6%、10%和20%的氧濃度)

圖3 PPAR-γ2和LPL mRNA水平的qPCR分析

圖4 成脂相關(guān)蛋白PPAR-γ2 (A) 和LPL (B) 的Western blotting分析

4 討論

BMSCs是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞[11-13]，已被用于心腦血管疾病、肝硬化、骨質(zhì)疏松癥、脊髓神經(jīng)損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病的治療，取得了令人鼓舞的臨床試驗(yàn)結(jié)果[14-16]。目前，部分學(xué)者應(yīng)用脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)、MicroRNA調(diào)控、激素干預(yù)等方式研究BMSCs成脂分化的機(jī)制，證實(shí)這些因素在抑制或促進(jìn)BMSCs成脂誘導(dǎo)分化中具有重要的作用[17-19]。因此，依據(jù)BMSCs生物學(xué)特性，通過藥物調(diào)節(jié)BMSCs多向分化進(jìn)行臨床疾病治療具有廣闊的應(yīng)用前景。

黃芪多糖 (APS) 作為黃芪的主要組分在抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)、抗炎、抗腫瘤等方面具有重要的作用。近年來，有大量研究證實(shí)黃芪多糖在促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖與分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞毒性等方面具有一定的功效[20]。同時，體內(nèi)微環(huán)境是BMSCs增殖與分化的溫床，不同組織或器官中氧濃度分布存在一定的差別，如動脈血氧濃度約為12%，骨髓組織中的氧濃度約為1%?7%，成熟肌肉組織中的氧濃度約為l%?10%21]。氧元素作為體內(nèi)環(huán)境的重要組分之一，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)基因表達(dá)、信號通路等方式在細(xì)胞的增殖與分化程中發(fā)揮著重要的作用。目前，對于BMSCs增殖與分化的相關(guān)研究大多基于常氧環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)，并不能真實(shí)地反映其在體內(nèi)的生物學(xué)特性。

本研究模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，以3%、6%、10%和20%為細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境氧濃度，經(jīng)MTT法篩選出有效促進(jìn)BMSCs增殖的最佳APS濃度為40 μg/mL，濃度過高 (80?100 μg/mL) 抑制BMSCs增殖，濃度過低 (40 μg/mL以下) 促增殖效果不明顯，這一結(jié)果與前人研究一致[22]。同時，以40 μg/mL APS干預(yù)低氧環(huán)境中成脂誘導(dǎo)的BMSCs，通過脂滴形成檢測表明，黃芪多糖干預(yù)誘導(dǎo)組BMSCs細(xì)胞內(nèi)形成了大量棕紅色脂滴，顯著高于單獨(dú)應(yīng)用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的BMSCs (<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；并且在氧濃度為10%時，其干預(yù)誘導(dǎo)作用較為顯著。這一結(jié)果證實(shí)APS不僅具有促進(jìn)低氧環(huán)境中BMSCs成脂誘導(dǎo)分化的功效，而且其促誘導(dǎo)分化作用與BMSCs所處微環(huán)境的氧濃度有一定關(guān)系。

PPAR-γ是脂肪細(xì)胞形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，該因子具有激活控制BMSCs進(jìn)入最終分化和獲得成熟脂肪細(xì)胞功能基因的作用。PPAR-γ的持續(xù)表達(dá)是維持細(xì)胞成脂分化狀態(tài)的必要條件，具有誘導(dǎo)BMSCs 向脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)甘油三酯 (TG) 合成的作用，一般在成脂向分化中后期高表達(dá)[23]。LPL是TG降解的限速酶，對清除體內(nèi)過多的TG至關(guān)重要，在脂代謝、胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞分化中有重要作用，成為當(dāng)今研究肥胖癥和相關(guān)疾病的熱點(diǎn)。PPAR-γ作為LPL表達(dá)的影響因素之一，共同調(diào)控著BMSCs成脂分化的過程[24]。本研究通過Real-time PCR和Western blotting對低氧環(huán)境中APS干預(yù)的成脂誘導(dǎo)BMSCs內(nèi)PPAR-γ和LPL mRNA和蛋白水平分析表明，其表達(dá)水平均上調(diào)；而且在10%的氧濃度時，APS促PPAR-γ和LPL的mRNA和蛋白水平效果越顯著。這一結(jié)果提示APS可能通過調(diào)控PPAR-γ和LPL的mRNA和蛋白水平來促進(jìn)低氧環(huán)境中BMSCs成脂誘導(dǎo)分化的過程，而且其促誘導(dǎo)分化作用與BMSCs所處微環(huán)境的氧濃度有一定關(guān)系，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effects ofpolysaccharides on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in low oxygen environment

Zhiwei Wu1,2, Dan Liu1, Yongqi Liu1,2, Na Xue1, Chunlu Yan1, and Yun Su1

1 Basic Medical College, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou730000, Gansu, China 2 Provincial-level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with TCM Research in Gansu Colleges and Universities, Lanzhou 730000, Gansu, China

To study the effect ofpolysaccharide (APS) on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) cultured in hypoxic environment. The optimal APS concentration, which could promote the proliferation of BMSCs, was screened by methyl thiazolyl tetrazolium method. The concentration was used to intervene in BMSCs-induced by adipogenic differentiation fluid growing in different oxygen concentrations (3%, 6%, 10% and 20%). The formation of lipid droplets in the BMSCs-intervened was observed by oil red O staining under the optical microscope. The mRNA and protein levels of the lipid relating genes peroxisome proliferator activated receptor gamma 2 (PPAR-γ2) and lipoprotein lipase (LPL) were detected by Real-time PCR and Western blotting, respectively. The results showed that, comparing with the control group, 40 μg/mL APS could significantly promote the proliferation of BMSCs under low oxygen concentration. A large amount of lipid droplets existed in BMSCs growing in the adipogenic inducing fluid containing 40 μg/mL APS and the hypoxic environment, and the protein and mRNA levels of PPAR-γ2and LPL also raised. It was worth noting that the phenomenon was more significant in 10% oxygen concentration, and the difference was statistically significant (<0.05). 40 μg/mL APS had effect on promoting the proliferation and adipogenic differentiation of BMSCs cultured in hypoxic environment, and the effect was related to the concentration of oxygen of BMSCs-cultured.

bone mesenchymal stem cells, low oxygen environment,polysaccharides, adipogenic differentiation

January 21, 2017;

February 16, 2017

Zhiwei Wu. Tel: +86-931-8721601; Fax: +86-931-8765344; E-mail: wzhiwei@aliyun.com

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2017-03-31

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