狂犬病病毒糖蛋白表達及純化及其記憶性B細胞結合能力的分析

嚴麗蔚，鞏蔚，朱文兵，張雪梅，徐婧雯，吳忠香，盧孔杰，孫明，董少忠

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狂犬病病毒糖蛋白表達及純化及其記憶性B細胞結合能力的分析

嚴麗蔚，鞏蔚，朱文兵，張雪梅，徐婧雯，吳忠香，盧孔杰，孫明，董少忠

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明 650118

嚴麗蔚, 鞏蔚, 朱文兵,等. 狂犬病病毒糖蛋白表達及純化及其記憶性B細胞結合能力的分析. 生物工程學報, 2017, 33(11): 1840–1849.Yan LW, Gong W, Zhu WB, et al. Expression and purification of rabies virus glycoprotein and analysis of its specific binding capacity to memory B cells. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1840–1849.

表達純化不同標簽、不同大小3個狂犬病病毒糖蛋白，分析其結合功能后，得到具備高親和力的、可特異性結合記憶性B細胞的狂犬病病毒糖蛋白。本實驗通過基因工程的方法，采用不同的原核表達系統(tǒng)分別表達帶有不同標簽的、全長和膜外區(qū)的RVG，純化蛋白并分析比較其結合功能，熒光標記候選蛋白，結合CD19及CD27的抗體，流式細胞術檢測狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特異性記憶性B細胞的情況，確認候選蛋白與抗狂犬病毒特異性記憶性B細胞的結合功能。本實驗成功構建了3個表達載體pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G，優(yōu)化表達純化條件成功獲得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。純化后的GST-RVG、His-RVG和His-G經(jīng)Western blotting和ELISA鑒定均有抗原特異性；由競爭ELISA法測得3個純化后糖蛋白與抗狂犬病病毒抗體的親和力。通過流式細胞術可以檢測到狂犬疫苗免疫后陽性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特異性記憶性B細胞，從而獲得了高親和力、可用于分選抗原特異性的記憶性B細胞的狂犬病病毒糖蛋白。

狂犬病病毒糖蛋白，抗原特異性記憶性B細胞，流式細胞術

狂犬病病毒糖蛋白(RVG)是一種典型的跨膜糖蛋白，作為唯一暴露在病毒顆粒表面并誘導產生病毒中和抗體的抗原[1]，其介導病毒與細胞表面受體的結合[2-3]，與病毒毒力直接相關，是有效的保護性抗原[4]。目前，主要運用不同表達系統(tǒng)對基因全長進行表達，表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母[5-6]和昆蟲細胞[7-8]等。但大多數(shù)情況下表達產量較低且純度不高，不利于后續(xù)的研究應用[9]。鑒于狂犬病毒糖蛋白膜外區(qū)是決定抗原性、組織嗜性及毒力的最重要部分，RVG上第Ⅱ和第Ⅲ抗原部位是病毒與中和抗體的主要結合部位[10]，因此，也有研究嘗試采用截斷的基因片段進行表達和純化[11]。

抗體是由漿細胞分泌產生，記憶性B細胞在機體再次感染同一抗原時，可以快速分化為分泌抗體的漿細胞，介導迅速的記憶性免疫應答[12]，故對特異性記憶性B細胞進行分析，也是對機體產生免疫評價的一個重要補充。同時，單個B細胞分選單抗技術要求具備高親和力結合記憶B細胞特異性抗原[13]。單個特異性記憶性B細胞分選制備單克隆抗體是一種制備單克隆抗體的新型方法[14]。此方法的關鍵點是利用流式技術獲得單個特異性記憶性B細胞，候選抗原的純度、濃度以及和抗體的親和力等對分選至關重要[15]。鑒于狂犬病病毒的糖蛋白與感染、免疫和抗體水平評價、抗體分選的緊密關系，本實驗通過研究不同表達系統(tǒng)獲得不同的目的蛋白，以期能夠獲取用于分選特異性記憶B細胞的候選抗原。

本實驗采用基因工程的方法，利用不同的原核表達系統(tǒng) (pGEX-5X-1，pET28a，pET30a) 分別表達帶有不同標簽 (GST-tag和His-tag)的全長和膜外區(qū)RVG，純化后鑒定、分析比較和狂犬免疫球蛋白的結合能力，再利用熒光標記和流式細胞技術，用于目標記憶B細胞的分選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和Rosetta (DE3)pLysS以及原核表達載體pGEX-5X-1(4972bp，GST-tag)、pET28a(5 369 bp，His-tag)、pET30a(5422 bp，His-tag)均由本實驗室保存；毒株狂犬病病毒CTN-1株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶RⅠ和Ⅰ，T4 DNA連接酶均購自BioLab；Trizol、DNA純化回收試劑盒和質粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；HRP標記的羊抗人抗體購自碧云天生物技術研究所；逆轉錄試劑盒PrimeScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Primer StarMax(2×)均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白熒光標記試劑盒購自Innova Bioscience；人狂犬病免疫球蛋白購自廣東雙林生物制藥有限公司。CD19、CD27抗體購自美國BD生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建

根據(jù)狂犬病病毒CTN-1株基因的序列 (GenBank登錄號為FJ959397.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設計狂犬病毒CTN-1株基因全長序列(1575bp)和膜外區(qū)去除信號肽序列(1308bp)的引物，并在上下游引物中分別引入酶切位點RⅠ和Ⅰ(用下劃線表示)，見表1。Trizol法提取病毒RNA，經(jīng)逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行特異PCR擴增。用RⅠ和Ⅰ對擴增出的DNA片段和載體pGEX-5X-1、pET28a、pET30a進行雙酶切，然后將酶切后的載體pGEX-5X-1和pET28a與基因全長序列連接，載體pET30a和基因膜外區(qū)連接，16℃過夜，將連接后質粒轉化到.DH5α，提取質粒，經(jīng)雙酶切鑒定，并送鉑尚生物技術 (上海) 有限公司測序。鑒定正確的質粒命名為pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G。

1.2.2 目的基因的誘導表達

將鑒定為陽性的表達載體的pGEX-5X-1-RVG轉化到Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)中，pET28a-RVG、pET30a-G轉化到BL21(DE3)感受態(tài)中；挑取重組工程菌接種于含有1%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床過夜；將培養(yǎng)物按1∶50的比例接種至10mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)約3h至菌液600為0.6時，進行誘導表達。IPTG誘導終濃度為0.5mmol/L，溫度為16℃，誘導12h。收集菌體，超聲波破菌后，4℃、8000r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。其中，載體pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG、pET30a-G對應表達的重組蛋白形式分別為GST-RVG(約85.2kDa)、His-RVG(約62.4kDa)、His-G(約54.8kDa)。同時用空載體pGEX-5X-1、pET28a和pET30a作為陰性對照。

表1 重組蛋白原核表達載體構建所用引物及其序列

Restriction sites were underlined.

1.2.3蛋白純化

根據(jù)目的蛋白所帶標簽和表達情況的不同，選擇不同的純化方法。其中蛋白GST-RVG采用GST親和層析柱純化；蛋白His-RVG采用陰離子柱層析和鎳柱親和層析純化；蛋白His-G采用包涵體變性復性的方法純化。

1.2.4重組蛋白的抗原特異性鑒定

采用Westernblotting鑒定。純化后重組蛋白GST-RVG、His-RVG、His-G經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉1h，加入抗狂犬病病毒免疫球蛋白(1∶10000)，室溫孵育2h；TBST洗滌3次，每次5min，再加入HRP標記的羊抗人IgG(1∶30000稀釋)，室溫孵育1h；TBST洗滌4次，每次10min；ECL顯影。

1.2.5 重組蛋白與抗狂犬病病毒免疫球蛋白的親和力檢測

通過競爭ELISA法來檢測純化后重組蛋白與狂犬免疫球蛋白的親和力大小。用純化后的重組蛋白包被兩塊抗原板，4℃過夜，用PBST洗板3次后，用3%的MPBS(MPBS即含有脫脂奶粉的PBS)室溫封閉2h，PBST洗板3次；在一排12個試管中，建立從0.1nmol/L–1 μmol/L濃度梯度的抗原即蛋白PBS溶液，加入終濃度為0.5nmol/L的抗狂犬病病毒抗體，加入抗體溶液使總體積為100μL，室溫孵育30min后，加入90μL反應混合物到前述已被包被抗原的微孔中，微孔中預先加入30μL的30%MPBS后孵育，時間不超過10min；孵育結束后，將反應混合物轉入另一塊包被抗原的板中，第二塊板的ELISA操作與第一塊相同。充分洗滌第一塊和第二塊板，加入帶HRP標記的羊抗人IgG(1:750稀釋)，室溫1h，PBST洗板3次，加入TMB顯色液100μL/孔，37℃避光10min，加入2mol/LH2SO4終止反應；檢測各孔的吸光度值。在半飽和狀態(tài)下(ELISA信號強度是最高強度的一半) 所得到的抗原濃度約等于解離常數(shù)dis(dis=/，為蛋白總濃度，為蛋白稀釋倍數(shù)，為蛋白相對分子質量)，解離常數(shù)的倒數(shù)即為親和力。

1.2.6 免疫后血清中抗狂犬病病毒抗體水平檢測

采用間接ELISA法。志愿者按照暴露前程序接受狂犬疫苗接種，在接種第3針后14 d，采集志愿者血液5mL，分離血清。將純化的GST-RVG包被酶標板，包被液為碳酸鹽緩沖液(pH9.6)，每孔0.7μg蛋白，4℃過夜；PBST洗板3次后，用1%BSA封閉液室溫封閉1h；洗板3次，加入稀釋的陰性血清 (志愿者免疫前血清)，狂犬病毒免疫球蛋白以及志愿者免疫后血清 (稀釋倍數(shù)為1∶6400)，室溫孵育2h；洗板3次，加入HRP標記的羊抗人二抗 (1∶750稀釋)，孵育1h后加入TMB顯色液100μL/孔，37℃避光10min，加入2mol/L H2SO4終止反應；檢測各孔的吸光度值。

1.2.7 GST-RVG標記FITC

使用Lightning-Link熒光標記試劑盒。將 1 mL GST-RVG (516μg/mL) 和100 μL LL-modifier reagent混勻后，加入到Lightning-Link?mix中輕輕混勻，避光，4℃過夜后，加入100μL LL-quencher FD reagent，放置30min。

1.2.8 流式細胞術檢測特異性結合記憶性B細胞

采用流式細胞術。志愿者按照暴露前程序接受狂犬疫苗接種，在接種第3針后14 d，采集志愿者血液5mL，用來分離外周血淋巴細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。將ELISA鑒定為陽性志愿者的PBMCs樣品進行流式細胞術分析，并將接種疫苗前的血清和PBMCs作為陰性對照。將凍存的PBMCs復蘇后，37℃過夜培養(yǎng)，離心收集細胞并計數(shù)，細胞數(shù)量達到約1×106個1管，PBS洗滌2次，離心后棄上清。為確定最佳的標記蛋白使用量，我們分別采用10、20、40 μg的GST-RVG-FITC對PBMCs進行細胞染色，同時加入10μLanti-CD19-PE抗體，10μLanti-CD27-APC[16]抗體4℃避光30min，用PBS洗滌，離心后棄上清，加入200μL PBS，流式細胞儀檢測并分選。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建

PCR擴增產物pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G經(jīng)RⅠ和Ⅰ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析產物，載體片段、全長序列 (1 575 bp) 和膜外區(qū)序列 (1308bp) 的基因片段均與預期相符 (圖1A和1B)；測序結果與GenBank標準序列一致，表明質粒pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G均構建成功。

2.2 目的基因誘導表達產物的鑒定

12%SDS-PAGE結果顯示，可見相對分子質量約為85kDa (pGEX-5X-1-RVG)、62 kDa (pET28a-RVG)和55kDa (pET30a-G) 的目的蛋白條帶，大小均與預期相符，且GST-RVG、His-RVG在添加1%葡萄糖培養(yǎng)表達量明顯增多，見圖2。

圖1 重組蛋白原核表達載體構建

圖2 表達產物的SDS-PAGE分析

2.3 純化產物的鑒定

12%SDS-PAGE分析純化上述表達蛋白，可見相對分子質量約為85kDa (親和層析)、62 kDa(陰離子交換層析和親和層析) 和55 kDa (包涵體變性復性) 大小條帶 (圖3A)。Bradford法檢測蛋白濃度，GST-RVG：516μg/mL，His-RVG：1224μg/mL，His-G：320μg/mL。Scion Image灰度掃描計算蛋白純度，GST-RVG：87.12%，His-RVG：23.1%，His-G：95.2%，見表2。Westernblotting結果顯示，純化后蛋白均可與人狂犬病毒免疫球蛋白特異性結合 (圖3B)。

圖3 純化后蛋白SDS-PAGE(A)和Western boltting (B)鑒定

2.4 重組蛋白與抗狂犬病病毒抗體的親和力檢測

競爭ELISA法結果顯示，純化后不同蛋白與人狂犬病毒免疫球蛋白的親和力大小分別為：GST-RVG：1.38×108L/mol，His-RVG：5.1×107L/mol，His-G：1.7×105L/mol，結果見表2。通常，抗原抗體反應的親和常數(shù)a(Affinity constant)小于105L/mol為低親和力，107–108L/mol為中等親和力，大于108L/mol為高等親和力。故GST-RVG與人狂犬病毒免疫球蛋白為高親和力結合，His-RVG與特異性抗體屬于中等親和力結合，His-G與則以低親和力結合特異性抗體。由此，后續(xù)實驗將使用GST-RVG作為陽性血清和特異性B細胞的候選抗原進行分析。

表2 純化后蛋白的分析比較

2.5 免疫后血清中抗狂犬病病毒抗體水平 檢測

為了進行特異性單個記憶性B細胞的分選，我們對志愿者免疫前后的血清進行了ELISA檢測，結果顯示，高親和力的GST-RVG可用于免疫后血清樣本的分析檢測，與親和力的計算結果吻合，由此，我們最終確認GST-RVG用于記憶B細胞的分選 (圖4)。且當血清稀釋度為6 400倍時，陰性血清和志愿者1的免疫后血清450值相比<0.01(**)，差異具有較強的統(tǒng)計學意義，陰性血清和人狂犬病毒免疫球蛋白450值相比<0.05(*)，差異具有統(tǒng)計學意義，故選擇志愿者1的PBMCs進行下一步實驗。

2.6 流式細胞術分選特異性結合記憶性B 細胞

在比較了10、20和40 μg GST-RVG-FITC染色1×106個PBMCs的熒光信號強弱后，確定以20 μg GST-RVG-FITC標記1×106個PBMCs，隨后采用anti-CD19-PE抗體 (CD19，B細胞特異性表面分子)、anti-CD27-APC抗體 (CD27，記憶B細胞特異性表面分子) 和GST-RVG-FITC進行狂犬病毒抗原特異性記憶B細胞的分選，流式細胞術檢測結果顯示，陰性對照組 (免疫前)和實驗組 (免疫后) 的B細胞、記憶B細胞分群及所占比例情況基本一致(圖5B、C、F、G)；陰性對照組中記憶B細胞 (CD19+和CD27+) 能識別GST-RVG而被GST-RVG-FITC染色的數(shù)量極少，而實驗組中有相當數(shù)量的FITC陽性記憶B細胞 (CD19+和CD27+)，提示實驗組中GST-RVG可以特異性結合記憶B細胞。如圖5D、5H所示，我們選取了GST-RVG-FITC染色標記的部分記憶B細胞，初步比較了陰性對照組和實驗組間的差別，即0% vs 8.11%。實驗組中GST-RVG-FITC染色的記憶B細胞，可能含有抗狂犬病病毒抗體基因的B細胞克隆。

圖4 間接ELISA檢測免疫后志愿者血清抗體結果

3 討論

本實驗采用基因工程的方法構建了pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G三個原核表達載體。通過不同溫度、添加葡萄糖等誘表達條件的摸索，獲得了大小分別為85kDa(GST-RVG)、62 kDa(His-RVG)及 55 kDa(His-G)的重組蛋白。經(jīng)過不同純化方法獲得的3種蛋白，Western blotting結果顯示均能夠與陽性血清特異性結合，競爭性ELISA[17]結果顯示，3個蛋白中，僅GST-RVG與抗狂犬病病毒抗體為較高親和力結合。隨后，以GST-RVG為初步候選抗原進行下一步實驗，間接ELISA結果顯示GST-RVG能夠用于檢測狂犬病毒疫苗免疫后志愿者血清抗體水平高低，F(xiàn)ITC熒光標記GST-RVG后，結合CD19、CD27抗體，流式細胞術檢測志愿者1的PBMCs，可以檢測分選到抗原特異性的記憶B細胞。

圖5 流式細胞術分析PBMC的抗狂犬病病毒記憶B細胞

采用原核系統(tǒng)表達RVG是一個快速有效獲得目的蛋白的方法[18]。本實驗表達純化并分析了帶不同標簽的不同分子量的糖蛋白。由于膜蛋白的高度疏水性和錯誤的折疊可能引起蛋白聚集，從而導致快速降解或是形成沉淀，故膜蛋白通常很難大量表達和純化。但是如果膜蛋白以融合蛋白的形式表達，這個問題可以在一定程度上得到緩解[19]?？赡艿脑虬ǎ?) 狂犬病毒G蛋白胞外區(qū)蛋白 (His-G) 是帶有6×His標簽的重組蛋白，其標簽對目的蛋白空間結構的影響相對較小。His-G表達量高，但多以包涵體的形式存在，針對包涵體變性、復性和后續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)，其與陽性血清結合的親和力較低，原因可能是狂犬病毒胞外區(qū)G蛋白的不完整性部分制約了其生物學功能[20]，變性和復性也可能影響了其折疊及功能[21]。2) 對于重組蛋白His-RVG，由于RVG全長基因信號肽、跨膜區(qū)和膜內區(qū)含有大量的稀有密碼子，導致RVG全長基因難以獲得高表達[22]，超聲菌體上清中包含少量His-RVG，而在添加1%葡萄糖培養(yǎng)后，其表達量明顯增高，可能原因是完整的狂犬病毒G蛋白在此表達系統(tǒng)中毒性較大[23]，宿主菌受到了抑制，1%的葡萄糖可以抑制毒性增強表達。但對其上清進行離子交換和親和層析后，得到的His-RVG純度偏低，雜蛋白可能會影響His-RVG與免疫球蛋白的結合，無法在后續(xù)實驗中使用。3) 對于重組蛋白GST-RVG，GST是一種高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性[24]。親和層析純化獲得了純度、濃度均滿足我們實驗目的的GST-RVG，具備和抗體高親和力結合的特性 (a=1.38×108L/mol)，流式細胞技術顯示GST-RVG能夠和抗原特異性記憶B細胞結合，分離特異性群落的分群顯示為陽性，陽性率為0.15%。鑒于其與特異性細胞結合的高親和力特性，該候選蛋白還可用來判斷疫苗接種后的免疫效果及毒株間的抗原性比較。

目前，狂犬病的防治主要是通過疫苗進行預防和使用免疫球蛋白進行緊急治療，但免疫球蛋白多來源于馬及人血清，異源性和副作用導致了免疫球蛋白的使用受限[25]。單個特異性記憶性B細胞分選制備單克隆抗體是一種制備單克隆抗體的新型方法，該方法的關鍵點是分選得到單個抗原特異性記憶性B細胞，如何獲得用于分選的高要求抗原至關重要。本研究基于表達不同的狂犬病病毒糖蛋白，進而選擇具有較高純度以及與陽性血清具有較高親和力特性的蛋白，用于篩選抗狂犬病病毒糖蛋白的記憶性B細胞，為分離純化得到單克隆抗體奠定基礎。

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(本文責編 郝麗芳)

Expression and purification of rabies virus glycoprotein and analysis of its specific binding capacity to memory B cells

Liwei Yan, Wei Gong, Wenbing Zhu, Xuemei Zhang, Jingwen Xu, Zhongxiang Wu, Kongjie Lu, Ming Sun, and Shaozhong Dong

Yunnan Provincial Key Laboratory for Development of Vaccines Against Major Infectious Diseases,Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,650118,,

We aimed to express and purify three rabies virus glycoproteins with different tags and sizes. After analyzing their binding function, we wish to obtain a rabies virus glycoprotein with higher affinity and ability to specifically bind memory B cells. Experiments were carried out to express full length, as well as the ectodomain RVG by gene engineering method. Combined with the antibody of CD19 and CD27, the candidate protein labeling with fluorescence was used to analyze its binding function. Flow cytometry was used to detect the anti-rabies virus specific memory B cells in PBMCs, and confirm the binding ability between the candidate proteins and anti-rabies virus-specific memory B cells. We successfully constructed three expression vectors pGEX-5X-1-RVG, pET28a-RVG and pET30a-G. Three glycoproteins GST-RVG, His-RVG and His-G were obtained by optimized expression and purification conditions. The antigen specificity of purified GST-RVG, His-RVG and His-G were identified by Western blotting and ELISA. The affinity of these three purified glycoproteins to anti-rabies virus antibody were detected by competitive ELISA. Anti-rabies virus specific memory B cells in positive PBMCs gained from people who had ever been injected with the vaccine can be detected by flow cytometry. Thus, we got a recombinant rabies virus glycoprotein that had high-affinity and could sort antigen specific memory B cells.

rabies virus glycoprotein, antigen specific memory B cells,flow cytometry

February 21, 2017;

May 8, 2017

Shaozhong Dong. Tel: +86-871-68335116; E-mail: dsz@imbcams.com.cn Ming Sun. Tel: +86-871-68339287; E-mail: sunming@imbcams.com.cn

Supported by:CAMS Innovation Fund for Medical Sciences Program (No. 2016-I2M-1-019).

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程重大協(xié)同創(chuàng)新項目 (No. 2016-I2M-1-019) 資助。

2017-05-17

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