S100B基因rs881827多態(tài)性與缺血性腦卒中的遺傳易感性研究

陸玉蘭 黃華佗 王榮 劉純宏 藍(lán)艷 韋葉生

【摘要】目的探討星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs881827與缺血性腦卒中（IS）的相關(guān)性。

方法采用單堿基延伸的PCR技術(shù)（SBEPCR）和DNA測序法對(duì)396例IS患者（病例組）及398例體檢者（對(duì)照組）的S100B基因rs881827位點(diǎn)進(jìn)行基因分型；用非條件Logistic回歸計(jì)算比值比（OR）、95%置信區(qū)間（95%CI）、顯性模型（TT/CT vs.CC）、隱性模型（CT/CC vs.TT）和超顯性模型（CC/TT vs.CT），從而分析rs881827多態(tài)性與IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)果兩組間基因型和不同遺傳模型比較結(jié)果顯示，rs881827位點(diǎn)SNP可能與IS的遺傳易感性無關(guān)（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22； TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC： OR=0.75，95%CI 053～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～1.26，P=0.53）。

結(jié)論S100B基因rs881827位點(diǎn)SNP可能與IS的遺傳易感性無關(guān)。

【關(guān)鍵詞】S100B；缺血性腦卒中；單核苷酸多態(tài)性；易感性

中圖分類號(hào)：R743.3；R394 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.05.001

Study on polymorphisms of rs881827 in S100B gene and geneticsusceptibility to ischemic stroke

[HJ2][HJ]

LU Yulan1，HUANG Huatuo1，WANG Rong1，LIU Chunhong3，LAN Yan2，WEI Yesheng3▲

（1.Graduate School，2.Department of Dermatology of Affiliated Hospital，3.Department of Laboratory Medicine of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between single nucleotide polymorphism（SNP）rs881827 in S100B gene and susceptibility to ischemic stroke（IS）.

MethodsSNP rs881827 genotyping in S100B gene was performed by polymerase chain reactionsingle base extension PCR（SBEPCR）and DNA sequencing among 396 cases of IS patients（case group）and 398 physical examinees（control group）.Odds ratio（OR），95% confidence intervals（95%CI），dominant model（TT/CT vs.CC），recessive model（CT/CC vs.TT）and over dominant model（CC/TT vs.CT）were measured by unconditional Logistic regression analysis to analyze the risk of rs881827 polymorphism and IS.

ResultsComparison of genotypes and different genetic models between the two groups showed that SNP in rs881827 locus may be unrelated to the genetic susceptibility of IS（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs. CT：OR=090，95%CI 0. 64～1.26，P=0.53）.

ConclusionS100B gene rs881827 polymorphism may be not associated with susceptibility to IS.

【Key words】S100B；IS；SNP；susceptibility

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是由多因素共同參與而導(dǎo)致的一類復(fù)雜疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。近年來，我國IS的發(fā)病率逐年上升，而且發(fā)病人群呈年輕化趨勢[2]。流行病學(xué)研究表明年齡、性別、肥胖、高血壓、糖尿病、吸煙和血脂異常等傳統(tǒng)因素與IS的發(fā)病密切相關(guān)[3]。然而，IS的確切病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。越來越多的家族性病例報(bào)道說明IS有明顯的遺傳傾向[4]。星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）是一種主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的酸性鈣結(jié)合蛋白，為S100超家族中的成員之一。S100B可通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后激活蛋白激酶/cJun氨基末端激酶（JNK）通路及P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[5～6]。此外，S100B與RAGE結(jié)合可誘導(dǎo)IL1、IL6、IFNγ、TNFα等細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，從而參與機(jī)體免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)[7]。既往研究表明，S100B蛋白可作為輔助診斷缺血性腦卒中、顱腦損傷和腫瘤腦轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)[8～10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)編碼S100B基因存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，而這些SNP位點(diǎn)與自閉癥、精神分裂癥等多種疾病密切相關(guān)[11～12]。然而，S100B基因多態(tài)性與IS發(fā)病是否相關(guān)尚未見報(bào)道。因此，在本研究中，我們通過病例對(duì)照研究的方法，探討S100B基因多態(tài)性與IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，為從分子水平上揭示IS的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，也為盡快發(fā)現(xiàn)IS的危險(xiǎn)人群、預(yù)防IS的發(fā)生提供重要的參考信息。endprint

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

對(duì)照組：隨機(jī)選取同一時(shí)期到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的體檢者398例，其中男性231例，女性167例，平均年齡（58.09±8.76）歲，所有研究對(duì)象均來自廣西地區(qū)，且相互無血緣關(guān)系。排除自身免疫性疾病、腫瘤、心腦血管疾病及感染性疾病等。本研究獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有受試對(duì)象均已簽署知情同意書。IS組：選取2013年1月～2016年9月入住右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，與對(duì)照組性別、年齡相匹配的IS患者396例，其中男性252例，女性144例，平均年齡（59.16±9.18）歲。IS的診斷均符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議的診斷標(biāo)準(zhǔn)。全部IS患者均經(jīng)頭顱CT或MRI掃描確診，不包括心源性、動(dòng)脈炎、外傷、腫瘤、腦血管畸形等引起的腦卒中。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取采集體檢者靜脈血3 ml，用含有EDTAK2抗凝劑的采血管保存；采用試劑盒離心柱法（TIANamp Blood DNA Kit）進(jìn)行基因組DNA提取，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取S100B基因SNP序列，用在線Primer3 軟件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）輔助設(shè)計(jì)PCR引物，并由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增的S100B基因rs881827引物序列詳見表1。

1.2.3PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系，其中包括1× GCⅠ緩沖液（Takara.）、1 μL多重PCR引物、1 U HotStarTaq聚合酶（Qiagen Inc.）、3.0 mM鎂離子、0.3 mM dNTP、1 μL DNA模板，余下體積用經(jīng)過嚴(yán)格高壓滅菌的雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性 2 min；擴(kuò)增階段：94℃預(yù)變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)11次；94℃預(yù)變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)24次；最后階段72℃延長2 min。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)過蝦堿酶（SAP：from Promega） 和外切酶I（EXO I：from Epicentre）純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用蝦堿酶（SAP：from Promega）純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）來分析（由上海天昊科技有限公司承做）。

1.3臨床基本資料收集

利用醫(yī)院的病例管理系統(tǒng)收集已確診為IS患者的臨床基本資料，主要包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和極低密度脂蛋白膽固醇（VLDLC）等。吸煙定義為吸煙≥1支，且一生中連續(xù)或累積吸煙≥6個(gè)月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用HardyWeinberg遺傳平衡定律評(píng)估樣本的群體代表性；計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。分類變量采用χ2檢驗(yàn)；經(jīng)相關(guān)混雜因素（性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、TCH、TG、HDLC、LDLC和VLDLC）調(diào)整，采用非條件Logistic回歸方法計(jì)算對(duì)照組與IS組的顯性模型（TT/CT vs.CC）、隱性模型（CT/CC vs.TT）和超顯性模型（CC/TT vs.CT）的比值比（OR）、95%置信區(qū)（CI）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1S100B基因rs881827基因型測序結(jié)果經(jīng)檢驗(yàn)S100B 基因rs881827位點(diǎn)基因型分布符合HardyWeinberg平衡（P值為0.902），表明本研究具有群體代表性。測序結(jié)果顯示，rs881827位點(diǎn)包含TT、CT、CC三種基因型，DNA測序證實(shí)了我們的結(jié)果。見圖 1。

2.2IS組和對(duì)照組的基本臨床資料IS患者和對(duì)照者的性別、年齡和TCH分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而高血壓、糖尿病、吸煙、TG、HDLC、LDLC、VLDLC在兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。見表2。

2.3S100B基因多態(tài)性rs881827 SNP與IS易感性的關(guān)聯(lián)分析分析比較對(duì)照組和IS組S100B基因rs881827位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果顯示，IS患者的CC基因型（37.2%）、CT基因型（492%）、C等位基因（61.7%）高于對(duì)照組的CC基因型（34.4%）、CT基因型（48.2%）、C等位基因（585%），但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。同時(shí)，我們采用非條件Logistic回歸方法分析兩組間基因型和不同遺傳模型的比較，結(jié)果表明，S100B基因rs881827位點(diǎn)SNP可能與IS的遺傳易感性無關(guān)（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～115，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～109，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～107，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 046～119，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～126，P=0.53）。見表3。

2.4S100B基因rs881827多態(tài)性與不同人群的比較經(jīng)分析，廣西人群S100B基因rs881827位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布與國際人類基因組單體型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫（Hap Map）的Hap MapCEU、Hap MapYRI、Hap MapJPT、Hap MapHCB、Hap MapASW、Hap MapGIH、Hap MapLWK、Hap MapMEX人群相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Hap MapCHB相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。endprint

3討論

IS是由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧而發(fā)生的軟化壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前認(rèn)為IS是一種由環(huán)境因素與遺傳因素共同作用誘發(fā)的復(fù)雜疾病。

S100B基因定位人類染色體21q22.3區(qū)域，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，mRNA長度為1095bp，編碼91個(gè)氨基酸。其啟動(dòng)子區(qū)包括數(shù)個(gè)潛在的調(diào)控轉(zhuǎn)錄成分，如CAMP反應(yīng)元件CRE和AP2、SP1結(jié)合位點(diǎn)GC框。S100B主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞表達(dá)，是S100蛋白超家族中具有活性的成員，約96%存在于腦內(nèi)，因此被稱為腦特異性蛋白。高濃度的S100B可通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后激活多種信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)IL1、IL6、IFNγ和TNFα等多種細(xì)胞因子的釋放，而這些細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)在IS的發(fā)病中均起著重要的作用[13～14]。此外，高濃度的S100B可發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，通過一氧化氮依賴途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[15]。同時(shí)，越來越多的研究表明，S100B蛋白表達(dá)水平在IS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，Selcuk等[16]檢測50例IS患者的S100B血清水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，IS組S100B血清水平顯著升高，且S100B濃度隨腦梗死體積的增大而增加。Mori等[17]研究發(fā)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈閉塞的小鼠中，超表達(dá)S100B組梗死面積和神經(jīng)功能損傷程度較對(duì)照組明顯嚴(yán)重，認(rèn)為大腦中動(dòng)脈閉塞后超表達(dá)的S100B可加速腦損傷及增大梗死面積。然而，S100B蛋白在IS中的表達(dá)機(jī)制目前仍未明確。

近年來已有一些文獻(xiàn)報(bào)道S100B基因多態(tài)性與疾病遺傳易感性關(guān)系的研究[11～12，18]。然而S100B基因rs881827 SNP是否與IS遺傳易感性相關(guān)，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，S100B基因rs881827位點(diǎn)SNP可能與IS的遺傳易感性無關(guān)。產(chǎn)生此結(jié)果的可能原因有：首先，IS是一種復(fù)雜性疾病，可能是由很多基因參與其發(fā)病過程，一個(gè)單獨(dú)基因在其發(fā)病原因中起的作用很小，而更多的是基因與基因之間的交互作用的結(jié)果。其次，本研究所選取的樣本量較小以及樣本選擇的偏倚也可能是造成此陰性結(jié)果的原因之一。最后，既往研究結(jié)果表明，同一個(gè)位點(diǎn)SNP在不同人群、不同疾病中所發(fā)揮的作用并不一致，因此，S100B基因rs881827 SNP可能與廣西人群IS的遺傳易感性無關(guān)，但是其可能與其他人群的IS發(fā)病具有相關(guān)性，這是我們后續(xù)的研究方向。此外，值得注意的是，基因多態(tài)性有不同種族和不同地區(qū)人群間的差別，正如表4所示，我們發(fā)現(xiàn)，廣西人群rs881827位點(diǎn)基因型在不同種族間甚至在同一種族不同人群間的分布也表現(xiàn)出不同程度的差異。因此，擁有不同遺傳背景的人群對(duì)疾病的遺傳易感性也有可能不同。

綜上所述，雖然我們通過多方面系統(tǒng)地分析發(fā)現(xiàn)，S100B基因rs881827位點(diǎn)SNP可能與IS的遺傳易感性無關(guān)。但是，基因多態(tài)性有不同種族和地區(qū)人群間的差別，因此，該結(jié)果仍需要經(jīng)大樣本、多地域、多民族的廣泛深入研究，以期為IS的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、治療以及評(píng)估預(yù)后提供一條新的線索和途徑。

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（收稿日期：2017-06-09修回日期：2017-07-04）

（編輯：潘明志）endprint