窄譜中波紫外線誘導(dǎo)人永生化表皮細(xì)胞凋亡的Wnt /β-catenin信號通路機制研究

惠海英，吳 娜， 張美芳，肖生祥

窄譜中波紫外線誘導(dǎo)人永生化表皮細(xì)胞凋亡的Wnt /β-catenin信號通路機制研究

惠海英，吳 娜， 張美芳，肖生祥

目的 探討窄譜中波紫外線（NB-UVB）通過Wnt /β-catenin信號通路對人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT cells）的增殖及凋亡影響。方法 研究對象為人HaCaT細(xì)胞系，實驗分為空白對照組、NB-UVB組、BIO組、NB-UVB+BIO組。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀（FCM）實驗檢測細(xì)胞凋亡；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)的β-catenin、survivin、caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組相比，NB-UVB組細(xì)胞增殖抑制作用及凋亡明顯增強（P＜0.05），同時觀察到NB-UVB組β-catenin及survivin表達(dá)降低，caspase-3表達(dá)增強（P＜0.05）。而NB-UVB+BIO組明顯減弱了NB-UVB對HaCaT細(xì)胞的這些作用（P＜0.05）。結(jié)論NB-UVB可能通過下調(diào)Wnt /β-catenin信號通路、抑制HaCaT細(xì)胞的增殖及促進(jìn)凋亡。

中波紫外線，窄譜；HaCaT細(xì)胞；Wnt /β-catenin

近年來，紫外線對人體的損傷已引起人們的廣泛關(guān)注。資料表明，日光中的紫外線特別是中波紫外線（UVB）與皮膚的光老化、光損傷和光致癌的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康[1,2]。皮膚光老化在臨床上主要表現(xiàn)為皮膚粗糙、 彈性喪失、出現(xiàn)粗深皺紋、色素沉著斑、毛細(xì)血管擴張或減少、良性甚至惡性腫瘤。紫外線輻射導(dǎo)致的皮膚光老化的機制涉及眾多信號分子和多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但其UVB誘導(dǎo)人皮膚光老化的機制尚不明確。本研究通過UVB誘導(dǎo)人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT cells）損傷，建立UVB損傷皮膚細(xì)胞模型,選取凋亡蛋白caspase-3及凋亡抑制蛋白survivin,探討了NB-UVB通過Wnt/β-catenin信號通路對皮膚HaCaT細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響，以期深入研究UVB 輻射損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑 人永生化HaCaT細(xì)胞株為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科李承新教授饋贈。改良的DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），噻唑蘭（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國sigma公司）。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。survivin、caspase-3兔多克隆抗體和β-catenin以及相應(yīng)的二級抗體（美國SANTA公司）。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）。GSK-3抑制劑BIO（美國sigma公司）。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 儀器 電泳儀（美國Bio-RAD公司）、 酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）、電轉(zhuǎn)槽（美國Bio-RAD公司）、流式細(xì)胞儀（美國BD-FACScalibur）、FluorChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）、7500型實時定量PCR檢測儀（美國 ABI公司）。SS-03B 型光療儀（上海sigma公司，波長311nm）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞株常規(guī)方法復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基，置5%CO2培養(yǎng)箱（37℃，相對濕度95%）培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞制成4×104單細(xì)胞懸液，接種于6孔板后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h給藥。

1.2.2 NB-UVB照射及分組 待細(xì)胞生長至每孔融合 80%～90%時， 吸去培養(yǎng)基, 加入2 ml phosphate buffer solution（PBS）緩沖液, 細(xì)胞暴露于NB-UVB燈管下, 照射距離約為10 cm，給予75 mJ/cm2輻射劑量照射（使用紫外線輻照度監(jiān)視計檢測紫外線光療儀輻照強度，以保證照射劑量精確）。紫外線照射后吸去PBS，并在各孔中重新加入培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗分為4組，空白對照組、NB-UVB組、BIO組、NB-UVB+BIO組。

1.2.3 MTT法檢測HaCaT細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4.0×104/ml，以每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去原培養(yǎng)液進(jìn)行實驗。實驗組及空白對照組各100 μl，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT（5 ng/ml）20 μl。培養(yǎng)結(jié)束時，棄上清，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測定吸光度（A570值），細(xì)胞抑制率=（1-實驗組平均A值/空白對照組平均A值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI檢測HaCaT細(xì)胞早期及中晚期總凋亡率 HaCaT細(xì)胞經(jīng)NB-UVB照射后24 h，經(jīng)0.25% Trypsin-EDTA 消化，200 g離心 6 min，培養(yǎng)液棄去，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，收集的細(xì)胞經(jīng)70%的乙醇 4℃固定 2 h，14 000 g 離心 2 min， 固定液棄去，PBS 緩沖液 （含 5 mmol/L EDTA）500 μl進(jìn)行細(xì)胞重懸， 再經(jīng)RNA酶室溫孵育 30 min，以1×binding buffer制成單細(xì)胞懸液，置于流式管，每組設(shè)6個樣，加Annexin V-FITC 10 μl與PI 5 μl，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 實時定量PCR檢測HaCaT細(xì)胞β-catenin、caspase-3、survivin mRNA表達(dá) HaCaT細(xì)胞經(jīng)NBUVB照射后24 h，吸去培養(yǎng)液，經(jīng)0.25%胰蛋白酶液分別制成細(xì)胞懸液，分別裝入離心管，1 500 r/min離心，收集細(xì)胞，利用TaKaRa細(xì)胞總RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒按照說明書以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后使用ABI7500 PCR儀進(jìn)行熒光PCR。引物由上海華大生物公司合成，序列見表1。實時定量PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，擴增40個循環(huán)，每循環(huán)中，94℃變性30 s，57℃退火30 s ，72℃延伸45 s，采集熒光信號；40循環(huán)結(jié)束后，經(jīng)94℃30 s、57℃ 30 s、72℃45 s，采集熔解曲線。使用7500型Real-time PCR儀分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以β-actin為內(nèi)參基因，計算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評價目的基因的表達(dá)水平。每個樣本取3個復(fù)孔，PCR重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.2.6 Western-blot檢測細(xì)胞β-catenin、caspase-3、survivin 蛋白表達(dá) UVB照射后的HaCaT細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化法傳代，加入1 μmol/L BIO工作液培養(yǎng)48 h。Western blot檢測β-catenin、Caspase-3、survin蛋白表達(dá)水平，β-肌動蛋白作為內(nèi)參蛋白，按照如下步驟進(jìn)行操作：進(jìn)行處理后細(xì)胞收集，4℃預(yù)冷PBS 液洗 3 次，加入細(xì)胞勻漿液（50 mmol/L This-HCl，pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L ED-TA），4℃、12 000 r/min 條件下離心 10 min，吸取上清，收集蛋白，收集細(xì)胞后用SDS上樣緩沖液處理，檢測總蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，上樣量（30 μg），濕轉(zhuǎn)NC膜，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉30 min，不同濃度稀釋一抗 β-catenin、caspase-3、 survivin孵育，4℃過夜，HRP 標(biāo)記抗兔 IgG 二抗常溫孵育 1 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色、掃描并進(jìn)行吸光度分析、計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NB-UVB照射對HaCaT 細(xì)胞增殖抑制的影響

MTT實驗表明，與空白對照組相比，NB-UVB組細(xì)胞生長受到明顯抑制（t=10.91，P＜0.05），但是與NB-UVB組相比，NB-UVB+BIO組的細(xì)胞生長抑制率明顯降低（t=7.82，P＜0.05），說明BIO顯著逆轉(zhuǎn)了NB-UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制（圖1）。

圖1 不同處理組的細(xì)胞生長抑制率

2.2 NB-UVB照射對HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞處理24 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，NB-UVB組中晚期細(xì)胞凋亡率明顯增加（t=13.23，P ＜0.05），但與NB-UVB組比較，NB-UVB+BIO組的細(xì)胞凋亡百分率降低（t=10.15，P ＜0.05），說明BIO可以明顯減少NB-UVB所致的細(xì)胞凋亡。

2.3 NB-UVB照射對HaCaT 細(xì)胞β-catenin、caspase-3、survivin mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞處理24 h后進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，NB-UVB組β-catenin mRNA表達(dá)明顯降低（t=8.46，P＜0.05），NB-UVB+BIO組和BIO組輕度增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但與NBUVB組比較，NB-UVB+BIO組及BIO組的β-catenin mRNA表達(dá)明顯增加（tNB-UVB=5.36，tBIO=5.79，P＜0.05）（圖2）。與正常對照組相比，NB-UVB組細(xì)胞caspase-3mRNA表達(dá)增加、survivin mRNA表達(dá)降低均較明顯（tcaspase-3=14.26，tsurvivin=11.54，P＜0.05），同時與NB-UVB組比較，NB-UVB+BIO組及BIO組caspase-3mRNA表達(dá)降低（tNB-UVB=8.16，tBIO=7.24，P＜0.05），survivin mRNA表達(dá)增加（tNB-UVB=8.32，tBIO=8.58，P＜0.05）（圖3）。

圖2 不同處理組β-catenin mRNA表達(dá)

圖3 不同處理組caspase-3、survivin mRNA表達(dá)

2.4 NB-UVB照射對HaCaT 細(xì)胞β-catenin、caspase-3、survivin 蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞處理24 h后進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，NB-UVB組β-catenin 蛋白及survivin 蛋白表達(dá)降低，caspase-3蛋白表達(dá)增強。而NB-UVB+BIO組明顯減弱了DHA對HaCaT細(xì)胞的這一作用（圖4）。

圖4 不同處理組β-catenin、 caspase-3、survivin蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

皮膚衰老分為內(nèi)源性老化和外源性老化。外源性老化又稱為光老化，主要由太陽中的紫外線輻射引起。近年來，由于臭氧層的破壞、過度日光浴等使人體暴露部位的皮膚衰老80%以上屬于光老化[3]，皮膚光老化與皮膚細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。

caspase 是執(zhí)行凋亡的主要酶類，被稱為死亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的中樞效應(yīng)器，細(xì)胞凋亡后期的共同途徑由caspase 激活[4]。caspase蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡中的一個重要作用是使保護(hù)細(xì)胞遠(yuǎn)離凋亡的各種蛋白失活。caspase-3處于caspase蛋白酶系的核心地位，在caspase酶系級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。caspase-3 可能是整個凋亡級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)之一，在幾乎所有的凋亡中被最后活化的 caspase分子，被認(rèn)為是凋亡的最終效應(yīng)蛋白。UVB 輻射后產(chǎn)生的ROS 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+），降低線粒體膜電位，caspase-3蛋白[5]， 最終引起細(xì)胞凋亡。

survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一員，于1997 年被 Ambrosinin 在人類基因組庫的雜交篩選分離出來，是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子[6]。survivin具有調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的雙重功能。survivin廣泛表達(dá)于人的胚胎組織和各種腫瘤組織,也表達(dá)于少數(shù)正常成人組織,包括人的皮膚組織。在人類皮膚KSCs及黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞均有表達(dá)。在維持人類角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞周期變化及細(xì)胞增殖中起很重要的作用[7]。Survivin通過抑制其caspase-3、caspase-7活性而抑制細(xì)胞凋亡[8]。

Wnt信號是普遍存在于動物細(xì)胞內(nèi)一條與生長發(fā)育及某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號途徑。β-catenin是Wnt信號通路中關(guān)鍵的信號樞紐，可以存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的胞質(zhì)蛋白[9]。當(dāng)Wnt信號異常激活，β-catenin蛋白不能被降解，導(dǎo)致β-catenin在胞質(zhì)中聚集，并遷移至細(xì)胞核中，與Tcf4結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，啟動通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長[10]。大量證據(jù)表明，Wnt /β-catenin信號通路可調(diào)控皮膚、毛發(fā)及其他附屬器生長，是一種復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)[11]。

BIO化學(xué)名為6-bromoindirubin-3'-oxime，是具有細(xì)胞通透性的小分子吲哚類化合物，其作用的發(fā)揮是通過激活胚胎干細(xì)胞內(nèi)的 Wnt 信號途徑而實現(xiàn)的。BIO為Wnt激活劑，為了確定NB-UVB是否對Wnt信號通路有失活作用，從而明確NB-UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的機制。筆者采用生物小分子Wnt激活劑BIO進(jìn)行研究，結(jié)果表明，NB-UVB可引起HaCaT細(xì)胞抑制，BIO可顯著逆轉(zhuǎn)NB-UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制，同時NB-UVB能有效降低HaCaT細(xì)胞β-catenin總蛋白水平的表達(dá)，而BIO能過度表達(dá)β-catenin，可以減弱NB-UVB對HaCaT的生長抑制作用。同時也觀察到NB-UVB可以下調(diào)survivin水平以及上調(diào)caspase-3的表達(dá)。而BIO明顯減弱了NB-UVB對HaCaT細(xì)胞的這一作用。

上述數(shù)據(jù)表明，NB-UVB對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用可能與Wnt /β-catenin信號失活，以及caspase-3及survivin有關(guān)，它們共同參與了皮膚的光損傷作用。

[1] Grant WB. Solar ultraviolet irradiance and cancer incidence and mortality [J]. Adv Exp Med Biol, 2014, 810: 52-68.

[2] Park JM, Cho JK, Mok JK, et al. Protective effect of Astragalin and Quercetin on ultraviolet (UV) -irradiated damage in HaCaT cells and Balb/c Mice [J]. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2012, 55(3):443-446.

[3] Monheit GD. Consultation for photoaging skin [J]. Dermatol Clin,2001, 19(3):401-403.

[4] Kavurma MM, Khachigian LM. Signaling and transcriptional control of fas ligand gene expression [J]. Cell Death Differ, 2003,10(1):36-44.

[5] Farrukh MR, Nissar UA, Afnan Q, et al. Oxidative stress mediated Ca2+release manifests endoplasmic reticulum stress leading to unfolded protein response in UVB irradiated human skin cells [J].Dermatol Sci, 2014, 75(1):24-35.

[6] Katalinic A, Waldmann A, Weinstock MA, et al. Does skin cancer screening save lives? [J]. Cancer, 2012, 118(21):5395-5402.

[7] Katiuscia D, Alessandra M, Carlo P. Survivin: A dual player in healthy and diseased skin [J]. J Invest Dermatol, 2012, 132(1):18-27.

[8] Huang KF, Zhang GD, Huang YQ, et al. Wogonin induces apoptosis and down-regulates survivin in human breast cancer MCF-7 cells by modulating PI3K-AKT pathway [J]. Int Immunopharmacol, 2012,12(2):334-341.

[9] Larriba MJ, González-Sancho JM, Barbáchano A, et al. Vitamin D is a multilevel repressor of Wnt/β-catenin signaling in cancer cells [J].Cancers, 2013, 5(4):1242-1260.

[10] Ljiljana S. Martic N, Serman T, et al. Epigenetic alterations of the Wnt signaling pathway in cancer: a mini review [J]. Bosn J Basic Med Sci, 2014,14 (4):191-194.

[11] 蘭雪梅、楊希川. Wnt/β-catenin信號通路與毛囊的生長 [J]. 實用皮膚科雜志, 2015, 8(3):205-297.

NB-UVB regulation of HaCaT cells proliferation and apoptosis through Wnt/β-catenin signaling pathway: an experimental study

HUI Hai-ying，WU Na，ZHANG Mei-fang，et al
Department of Dermatology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, China

Objective To investigate the effects of narrow band ultraviolet B(NB-UVB) regulation of HaCaT cells proliferation and apoptosis through Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods Human HaCaT cell lines was adopted as the experimental subject and divided into four groups(blank control group, NB-UVB group, NB-UVB+BIO group, BIO group). Four methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to observe the cell proliferative capacity, flow cytometry(FCM) test was used to detect cell apoptosis, real-time quantitative PCR and Western-blotting were used to detect the expression levels of intracellular β-catenin,antiapoptotic gene survivin and proapoptotic gene caspease-3. Results Compared with the control group, the proliferation and viability of HaCaT cells were inhibited and cell apoptosis was induced in NB-UVB group, meanwhile decreased survivin expression and increased caspase-3 expression of HaCaT cells were also observed in NB-UVB group. Furthermore, these effects were found to be depend on the suppression of Wnt/β-catenin signaling pathway as pretreatment with the Wnt activator BIO markedly dampened the DHA-induced effects. Conclusion NB-UVB may inhibit skin HaCaT cells by suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway.

NB-UVB；HaCaT cells；Wnt/β-catenin[J Pract Dermatol, 2017, 10(5):267-270]

惠海英

R454.2

A

1674-1293(2017)05-0267-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170504

710068 西安，陜西省人民醫(yī)院皮膚科（惠海英，吳娜，張美芳），西安交通大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科（肖生祥）

惠海英，副主任醫(yī)師，研究方向：皮膚腫瘤的防治，E-mail: haiyinghui@163.com

2017-02-01

2017-03-13）

（本文編輯 耿建麗）