硝基苯席夫堿衍生物的合成、結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤活性研究

易岑蘭，謝旭芹，劉賢智， 王 玉，袁澤利

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

硝基苯席夫堿衍生物的合成、結(jié)構(gòu)表征及其抗腫瘤活性研究

易岑蘭，謝旭芹，劉賢智， 王 玉，袁澤利

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

目的尋找新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。方法將芳香醛與2,4-二硝基苯肼縮合制備得到4個(gè)新的硝基苯席夫堿衍生物(1-4)。并利用1H NMR、13C NMR、HR-MS、FT-IR等對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，化合物1經(jīng)單晶XRD測試。采用MTT法對A549(人肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞)耐藥細(xì)胞株進(jìn)行體外抗腫瘤活性初步篩選。結(jié)果化合物4對A549(人肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞)具有中等活性。結(jié)論得到的系列硝基苯席夫堿化合物為今后的深入抗腫瘤活性研究與實(shí)踐奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

硝基苯；席夫堿; 合成; 表征；抗腫瘤活性

化學(xué)治療在癌癥臨床治療中具有十分重要的地位[1-2]。然而，由于動(dòng)物和人實(shí)體瘤中普遍存在著乏氧細(xì)胞，這些乏氧細(xì)胞由于對化療、放療以及光動(dòng)力治療都不敏感，且對多種抗癌治療(如化療、放療等)抗拒，從而導(dǎo)致腫瘤治療失敗[3-4]。已有研究證實(shí)：腫瘤乏氧細(xì)胞會(huì)為適應(yīng)乏氧而發(fā)生一系列生物學(xué)改變，從而促進(jìn)腫瘤的惡性表現(xiàn)行為[4-6]。因此，將腫瘤乏氧作為一個(gè)重要的靶點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)治療藥物開發(fā)成為熱門研究方向之一[6-7]。已有研究表明[8-9]：具有生物還原性化療藥物能有選擇性地殺死腫瘤組織中對射線有對抗性的乏氧細(xì)胞，與放療治療方案聯(lián)用可提高腫瘤療效。因而，生物還原性藥物作為一種新型抗腫瘤藥物得到了快速發(fā)展[9]。硝基芳環(huán)或者硝基芳香雜環(huán)類化合物可在乏氧條件下被硝基還原酶(Nitroreductases,NTRs)還原為亞硝基、羥胺和胺類化合物，這些還原物質(zhì)可與DNA作用殺死腫瘤細(xì)胞[10]。如Chester Beatty等[11]合成的CB1954和RSU1059已證明在乏氧條件下被DT-心肌黃酶還原為羥胺后與DNA偶聯(lián)，抑制癌細(xì)胞的增殖。

當(dāng)前應(yīng)用于臨床的抗腫瘤抗生素藥物中，多數(shù)均是直接作用于DNA或插入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，抑制以DNA為模板的RNA多聚酶而抑制RNA的合成。稠環(huán)芳烴的共平面分子結(jié)構(gòu)特性，使其具有插入DNA作用而干擾模板功能[12]。一些含蒽結(jié)構(gòu)的稠環(huán)芳烴化合物如多柔比星(阿霉素)、米托蒽醌、比生群等均已成功應(yīng)用于臨床[13]。在項(xiàng)目組和其他課題組的研究中均證實(shí)具有CH=N結(jié)構(gòu)的席夫堿結(jié)構(gòu)具有抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[14-18]。為發(fā)展芳環(huán)硝基苯類席夫堿結(jié)構(gòu)的新化合物并篩選其抗腫瘤活，本文設(shè)計(jì)合成了四個(gè)芳烴的硝基苯類席夫堿結(jié)構(gòu)的化合物，并初步對其進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，以期為新的乏氧選擇性化療藥物研究提供新的研究對象和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑 Varian 1000 FT-IR紅外光譜儀(美國瓦里安公司)，安捷倫400 MHz-DD2磁共振儀(美國安捷倫公司)，Micromass LCT PremierXE高分辨質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)， BRUKER SMART APEX II型單晶X射線衍射儀(德國布魯克公司)，Carry-1000型紅外光譜儀(美國安捷倫公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo 公司)。所有試劑均為分析純，所用溶劑未經(jīng)純化直接使用。

1.2 目標(biāo)化合物1-4的合成 化合物1-4的合成見圖1。

圖1 目標(biāo)化合物1-4的合成

以化合物1的合成為例：稱取1.98 g(1 mmol)2,4-二硝基苯肼和2.06 g(1mmol)9-蒽甲醛于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇使其溶解，緩慢滴加10滴冰醋酸(作催化劑)回流12 h后，冷卻，抽濾得褐色固體，將固體用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)重結(jié)晶，即得化合物1。產(chǎn)率:81.8%。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):8.91～8.93(d,J= 8.5 Hz,1H,NH),7.91～7.93 (d,J= 8.4 Hz,1H,CH=N),7.88～7.90(m,3H,Ar-H),7.53～7.55(m,5H,Ar-H),6.95(s,2H,,Ar-H),6.78～6.80(d,J= 8.6 Hz,1H,Ar-H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz):153.15,150.37,136.76,133.30,129.25,129.16,127.46,124.31,122.65,121.92,121.17,115.04,107.35; HR-MS (ESI-MS) calculated for C28H30N4O4(M)+:386.1015,foundm/z:386.0977.FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr):3459,3446,3285,3120,1617,1593,1574,1512,1401,1334,1055,827,738。

化合物2，黃色粉末固體。產(chǎn)率:78.6%。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):11.86 (s,1H,NH),9.55(s,1H,CH=N),8.88～8.89(d,J= 2.6 Hz,1H,Ar-H),8.65-8.67(d,J= 8.5 Hz,1H,Ar-H),8.40-8.43(m,1H,Ar-H),8.14～8.16 (d,J= 9.2 Hz,2H,Ar-H),8.03～8.09 (m,2H,,Ar-H),7.61～7.73(m,3H,Ar-H);13C NMR (DMSO-d6,100 MHz) :148.63,128.92,127.44,126.48,125.71,123.52,116.74; HRMS (ESI-MS) calculated for C28H30N4O4(M)+:336.0859,foundm/z:336.0816.FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr):3546,3474,3416,3294,1617,1590,1519,1502,1398,1326,1304,1175,839,741。

化合物3，褐色晶狀固體。產(chǎn)率:69.3%。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):11.76(s,1H,NH),8.85～8.86(d,J= 2.5 Hz,1H,Ar-H),8.69(s,1H,CH=N),8.36～8.39(m,1H,Ar-H),8.09～8.11(d,J= 9.6 Hz,1H,Ar-H),7.78～7.80(m,2H,Ar-H),7.48-7.49(m,3H,Ar-H);13C NMR(DMSO-d6):149.48,144.61,137.08,133.87,130.65,129.85,129.06,127.45,123.08,116.86; HRMS (ESI-MS) calculated for C13H10N4O4(M)+:286.00702,foundm/z:286.0658.FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr):3454,3289,1620,1512,1400,1328,1274,1086,716,685。

化合物4，黃色粉末固體。產(chǎn)率:82.6%。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz):11.61 (s,1H,NH) ,8.85～8.86 (d,J= 2.5 Hz,1H,Ar-H),8.61(s,1H,CH=N),8.33～8.35(d,J= 9.6 Hz,1H,Ar-H),8.02～8.04(d,J= 9.6 Hz,1H,Ar-H),7.64～7.36(d,J= 8.6 Hz,2H,Ar-H),7.35～7.39(t,J= 7.8 Hz,4H,Ar-H),7.09～7.16(m,6H,Ar-H),6.95～9.97(d,J= 8.6 Hz,2H,Ar-H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz):149.47,146.36,144.36,136.67,129.80,128.76,126.67,125.16,124.27,121.09; HRMS (ESI-MS) calculated for C25H19N5O4(M)+:476.1334,foundm/z:476.1319.FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr):3546,3474,3416,3294,1617,1590,1519,1502,1398,1326,1304,1175,839,741。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定及解析 將化合物1溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)放置于室溫下緩慢揮發(fā)15d后可得粒狀晶體。挑選適宜尺寸的顆粒在Bruker APEX2 Smart CCD單晶衍射儀上進(jìn)行數(shù)據(jù)收集(石墨單色器單色化的Mo Kα射線(λ=0.071073 nm)，φ-ω掃描方式進(jìn)行單晶衍射數(shù)據(jù)收集。對強(qiáng)度數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)吸收校正、LP 校正。晶體結(jié)構(gòu)通過直接法解出。對全部非氫原子坐標(biāo)以及它的各向異性熱參數(shù)均進(jìn)行全矩陣最小二乘法加以修正。計(jì)算采用SHELX-97程序得以完成。

1.4 體外抗腫瘤活性初步測試 對合成得到的新化合物1-4用MTT法分別對 A549(人肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞)(細(xì)胞均來自于遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究中心)進(jìn)行體外抗腫瘤活性的初步篩選。

具體操作(化合物1為例)：取對數(shù)生長期的A549或HepG2細(xì)胞 ，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，離心，去上清，用完全培養(yǎng)基(89%基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%雙抗；其中A549用DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，HepG2用RPMI 1640作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞，使細(xì)胞懸液濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板中(100 μL/孔)，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h。將新化合物1用DMSO溶解并用培養(yǎng)基稀釋至終體積為100 μL，分別加入96 孔板中，使其最終濃度分別為5、10、20、40、60、80、100、120 μg/L，繼續(xù)孵育24 h后，去培養(yǎng)基，每孔再加入90 μL的 培養(yǎng)基和10 μL (5 mg/mL) MTT 溶液，于37 ℃條件下繼續(xù)孵育 4 h，小心吸去孔內(nèi)液體， 加DMSO 100 μL/孔， 室溫振搖5 min，并用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm 處的OD值。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率公式(1)進(jìn)行計(jì)算：抑制率=1-[OD(樣品)-OD(空白)]/[(OD細(xì)胞對照-OD空白)]×100% (1)； IC50值用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 17.0 進(jìn)行計(jì)算。同樣操作測試新化合物2,3和4的體外抗腫瘤活性。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物1-4的結(jié)構(gòu)表征 在目標(biāo)化合物1-4的1H NMR譜中，席夫堿結(jié)構(gòu)中的CH=N質(zhì)子化學(xué)位移在8.9 ppm附近出現(xiàn)，而在化合物2和3中，該質(zhì)子化學(xué)位移出現(xiàn)在7.61～9.55 ppm附近。這一特征質(zhì)子化學(xué)位移均符合文獻(xiàn)報(bào)道的化學(xué)位移范圍[20-21]。同時(shí)，也由于蒽環(huán)和三苯基胺結(jié)構(gòu)中大的剛性π電子體系存在的影響，芳環(huán)質(zhì)子化學(xué)位移也分別向高場發(fā)生移動(dòng)。其積分均與預(yù)期結(jié)構(gòu)吻合，這說明得到的分子為預(yù)期結(jié)構(gòu)。而在目標(biāo)化合物1-4的13C NMR譜中，在107～153 ppm均出現(xiàn)了相應(yīng)芳環(huán)碳信號的出現(xiàn)?；衔?-4的高分辨質(zhì)譜測試值與計(jì)算值吻合較好，表明它們?yōu)轭A(yù)期的分子組成。在化合物1-4的紅外光譜中，均在1617 cm-1附近觀察到了席夫堿(C=N)的特征振動(dòng)吸收峰[20-21]，這說明了目標(biāo)化合物中均有C=N官能團(tuán)的存在。因而可以確定所合成得到的化合物為預(yù)期目標(biāo)化合物。

2.2 化合物1的晶體結(jié)構(gòu) 化合物1的單晶X射線衍射測試結(jié)果表明：其晶體結(jié)構(gòu)屬于斜方晶系,P21 空間群，其分子式為C21H14N4O4(Mr=386.36),晶胞參數(shù)為a=5.6509(11) ?，b=8.1598(15) ?,c=36.879(7) ?，α=β=γ=90.00°，V= 1700.5(6) ?3，Dc= 1.509 mg/m3，μ= 0.108 mm-1，Z= 4，F(xiàn)(000)=800.0，光源:Mo Kα 射線(λ=0.071073 nm)，R1=1.05 ，wR2=0.1065[Igt;2σ(I)]。晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)存于英國劍橋數(shù)據(jù)中心,CCDC 為 1577767 (選擇性鍵長、鍵角見表1)。其晶體結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 目標(biāo)化合物1的分子結(jié)構(gòu) (橢球幾率為30%)

表1目標(biāo)化合物1的選擇性鍵長(?)

鍵長?鍵角?C15-N11.285(3)O(2)-N(3)-C(19)118.3(3)C16-N21.358(3)O(4)-N(4)-C(21)118.8(3)N1-N21.382(3)O(1)-N(3)-C(19)118.6(3)N3-O21.230(3)O(4)-N(4)-O(3)121.7(2)N4-O31.240(3)O(3)-N(4)-C(21)119.5(2)C19-N31.457(4)C(20)-C(21)-N(4)116.8(2)N4-O41.232(3)C(15)-N(1)-N(2)113.9(2)N3-O11.218(3)C(16)-N(2)-N(1)120.8(2)

2.3 目標(biāo)化合物1-4的初步抗腫瘤活性 采用MTT法初步考察了目標(biāo)化合物1-4對 A549(人肺腺癌細(xì)胞)和 HepG2(人源肝癌細(xì)胞)的體外初步抗腫瘤活性，結(jié)果(見表2)。

表2化合物1-4的體外抗腫瘤活性

化合物IC50μmol/LA549HeGP2169.097.22gt;100gt;100381.981.8440.230.2

3 討論

3.1 目標(biāo)化合物1-4的合成及性質(zhì) 目標(biāo)化合物的合成用2,4-二硝基苯肼與芳香醛在冰醋酸作為催化劑的情況下，一步直接縮合即可得到，再以DMF重結(jié)晶即以較高產(chǎn)率獲得目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物具有制備簡便、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。目標(biāo)化合物微溶于甲醇、乙醇，而易溶于DMF和DMSO等有機(jī)溶劑中。

3.2 目標(biāo)化合物1的晶體結(jié)構(gòu) 由表1可見，化合物1的C15=N1的鍵長為1.285(3) ?，與文獻(xiàn)報(bào)道的席夫堿結(jié)構(gòu)的C=N鍵長能較好吻合[20-21]。其結(jié)構(gòu)中的硝基N3-O1、N3-O2、N4-O3及N4-O4的鍵長分別為：1.218(3)、1.230(3)、1.240(3)和1.232(3) ?也與文獻(xiàn)報(bào)道的硝基N-O鍵長相差不大[19]，其余鍵長均在合理范圍內(nèi)。這進(jìn)一步證實(shí)了合成得到的目標(biāo)化合物為預(yù)期結(jié)構(gòu)和組成。

3.3 目標(biāo)化合物1-4的初步抗腫瘤活性 由表2中數(shù)據(jù)可看出，目標(biāo)化合物1-3對所HeGP2細(xì)胞株均無顯著性抗腫瘤活性，而化合物1和3對A549表現(xiàn)出一定抗腫瘤活性。值得注意的是，目標(biāo)化合物4對受試的兩株細(xì)胞均表現(xiàn)出中等抗腫瘤活性。由表2中數(shù)據(jù)還能得出總的活性順序?yàn)?gt;1gt;3gt;2，這說明增加芳環(huán)的剛性有助于提高抗腫瘤活性，這為后續(xù)研究稠環(huán)芳烴為母核結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物作為抗腫瘤藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)。

本文以冰醋酸作為催化劑，用2,4-二硝基苯肼與芳香醛一步成功合成得到了4個(gè)新的硝基苯類席夫堿衍生物，通過1H NMR、13C NMR、HRMS(ESI-MS)、FT-IR以及單晶X射線等方法表征結(jié)果表明獲得了預(yù)期目標(biāo)分子。體外抗腫瘤活性初步篩選表明增加芳環(huán)的剛性有助于提高抗腫瘤活性，為以稠環(huán)芳烴為母核結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物的合成提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)。

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[收稿2017-07-14;修回2017-08-10]

(編輯：譚秀榮)

Synthesis,characterizationandinvitroanticanceractivitiesofnitrobenzeneSchiffbasederivatives

YiCenglan,XieXuqin,LiuXianzhi,WangYu,YuanZeli

(School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo discover novel lead compounds for antitumor researches.MethodsFour Schiff base derivatives (1-4) were obtained by conventional synthesis of aromatic aldehyde and 2,4-Dinitrophenylhydrazine,and their structures were characterized by1H NMR,13C NMR,HR-MS and FT-IR spectrum.Compound1was further tested by single-crystal XRD techniques.Their anticancer activities were investigated against A-549 and HeGp2 cell lines by MTT assay.ResultsCompound4exhibited middle anticancer activities on the two human cancer cells.ConclusionFour Schiff base derivatives are synthesized,which serves as a good basis for further research of anticancer activities and practice.

Nitrobenzene; schiff base; synthesis; characterization; anticancer activity

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360471；NO：81660575)；貴州省國際合作項(xiàng)目(NO：[2012]7036)；貴州省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目 (NO：201513653011)；遵義醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目 (NO：[2014]2906)。

袁澤利，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物設(shè)計(jì)合成及性能，E-mail:zlyuan2002@126.com。

O625.4

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1000-2715(2017)05-0486-05