紫光分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定百令膠囊中D—甘露醇含量的比較

王心珉

【摘要】 目的 探討紫光分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定百令膠囊中D-甘露醇含量的差異。方法 采用紫光分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定百令膠囊中D-甘露醇含量， 并比較不同方法測(cè)定的D-甘露醇含量。結(jié)果 紫光分光光度法測(cè)定的D-甘露醇含量為（6.03±0.35）mg/g， 顯著低于高效液相色譜法的（6.52±0.35）mg/g， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。紫光分光光度法測(cè)定的D-甘露醇含量與高效液相色譜法呈正相關(guān)（r=0.965， P=0.002<0.05）。結(jié)論 高效液相色譜法的靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均優(yōu)于紫光分光光度法， 但紫光分光光度法操作比較簡(jiǎn)單， 對(duì)試劑的要求較低， 不需要特定標(biāo)準(zhǔn)品， 經(jīng)濟(jì)、快速， 故更適用于百令膠囊中D-甘露醇的日常定量檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 紫光分光光度法；高效液相色譜法；百令膠囊；D-甘露醇

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.31.114

百令膠囊是《中國(guó)藥典》收載的藥品， 是人工發(fā)酵冬蟲夏草菌粉所得菌絲體而制成的膠囊， 其有效成分為19種氨基酸、D-甘露醇、生物堿、維生素及微量元素等， 具有補(bǔ)肺腎、益精氣及止咳化痰作用[1]， 主要用于治療慢性腎衰、IgA腎病、腎小球腎炎、腎小管損傷、腎移植、2型糖尿病伴微量白蛋白尿、反復(fù)發(fā)作性尿路感染、肝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等[2]。有研究顯示， 百令膠囊可通過抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）， 并增加可溶性細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）的表達(dá)， 抑制淋巴細(xì)胞增殖， 具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[3]。還有研究表明， D-甘露醇即蟲草酸是真菌類藥物的主要成分之一， 具有利尿脫水、鎮(zhèn)咳祛痰平喘、降脂等功效， 并且也是人工冬蟲夏草的主要質(zhì)控指標(biāo)[4]。本研究通過紫光分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定D-甘露醇的含量， 并比較兩種方法的準(zhǔn)確度， 為該藥物的質(zhì)控提供參考。

1 材料與方法

1. 1 儀器與試劑 主要儀器包括高效液相色譜儀（Waters系列）、UV-2000紫光可見分光光度計(jì)、電子天平（BP121S）、恒溫水浴鍋、混勻器、清洗器。主要試劑包括百令膠囊（購(gòu)自中美華東制藥有限公司）、D-甘露醇對(duì)照品、高碘酸鈉、乙醇、硫酸、碘化鉀、L-鼠李糖、乙酰丙酮、醋酸銨、冰醋酸。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要試劑溶液的制備 ①0.1% L-鼠李糖溶液的制備：稱取L-鼠李糖0.1 g于100 ml的容量瓶中， 加蒸餾水定容至100 ml， 混勻， 待用。②0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液的制備：稱取0.321 g高碘酸鈉溶于0.12 mol/L的鹽酸溶液中， 定容至100 ml， 混勻， 待用。③Nash試劑的制備： 取75 g醋酸銨、1 ml冰醋酸、1 ml乙酰丙酮加蒸餾水定容至500 ml。

1. 2. 2 對(duì)照品溶液的制備 稱取D-甘露醇對(duì)照品0.05 g于50 ml錐形瓶中， 加蒸餾水定容至100 ml， 加熱使之溶解， 搖勻， 放置冰箱內(nèi)冷藏， 待用。

1. 2. 3 樣品溶液的制備 將百令膠囊粉末篩后， 稱取0.3 g樣品至50 ml具塞錐形瓶中， 加入25 ml乙醇， 稱重， 加熱回流2 h， 冷卻， 用乙醇不足重量， 搖勻過濾， 取25 ml濾液進(jìn)行干燥， 殘?jiān)昧鲃?dòng)相加熱轉(zhuǎn)溶至容量瓶中， 冷卻， 加蒸餾水定容至25 ml， 即得。

1. 2. 4 空白溶液的制備 步驟同“1.2.3”， 加入25 ml乙醇至50 ml具塞錐形瓶中， 稱重， 加熱回流2 h， 冷卻， 用乙醇不足重量， 搖勻過濾， 取25 ml濾液進(jìn)行干燥， 殘?jiān)昧鲃?dòng)相加熱轉(zhuǎn)溶至容量瓶中， 冷卻， 加蒸餾水定容至25 ml， 即得。

1. 3 紫光分光光度法

1. 3. 1 吸光度值的測(cè)定 吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml對(duì)照品溶液分別置于容量瓶中， 加入蒸餾水定容至100 ml， 混勻， 再各吸取1 ml置于試管中， 分別加入 0.015 mol/L的高碘酸鈉溶液1 ml， 放置10 min， 加入0.1% L-鼠李糖溶液， 最后加入4 ml Nash試劑， 搖勻， 在恒溫水浴箱中加熱15 min， 然后冷卻， 以蒸餾水作為空白溶液， 在412 nm處測(cè)定D-甘露醇對(duì)照品的吸光度值。

1. 3. 2 樣品D-甘露醇含量的測(cè)定 根據(jù)“1.3.1”測(cè)得吸光度值的操作及標(biāo)準(zhǔn)曲線， 吸取樣品溶液1 ml進(jìn)行測(cè)定吸光度值， 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（Y=0.0431X+0.0033， Y為吸光度值， X為D-甘露醇對(duì)照品溶液濃度）計(jì)算樣品中D-甘露醇含量。

1. 4 高效液相色譜法

1. 4. 1 色譜條件 色譜柱：Waters sugar-pak-1鈣型（300 mm×6.5 mm）， 流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（17∶83）， 流速1.0 ml/min， 柱溫：室溫， 進(jìn)樣量：10 ?l。

1. 4. 2 樣品D-甘露醇含量的測(cè)定 吸取樣品溶液10 ?l， 根據(jù)“1.4.1”所設(shè)定的色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定， 記錄峰面積值， 因本樣品為干燥品， 故采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中D-甘露醇的含量， 公式為：CX=CR（AX/AR）， 其中CX為供試品的含量， CR為對(duì)照品的含量， AX為供試品的峰面積或峰高， AR為對(duì)照品的峰面積或峰高。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同方法測(cè)定百令膠囊D-甘露醇含量的比較 紫光分光光度法測(cè)定的D-甘露醇含量為（6.03±0.35）mg/g， 顯著低于高效液相色譜法的（6.52±0.35）mg/g， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。endprint

2. 2 不同方法測(cè)定百令膠囊D-甘露醇含量的相關(guān)性分析 紫光分光光度法測(cè)定的D-甘露醇含量與高效液相色譜法呈正相關(guān)（r=0.965， P=0.002<0.05）。見圖1。

3 討論

冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)藥用真菌， 有2000多年的歷史， 是三大瑰寶之一， 具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等作用， 對(duì)心、肝、肺、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有保護(hù)作用[5]。但因其受自然條件的限制， 產(chǎn)量較低， 價(jià)格比較昂貴， 無法在臨床上推廣使用， 故在1983年沈南英等從青海省玉樹及化隆的冬蟲夏草上分離及培養(yǎng)中華束絲孢， 即為百令膠囊[6]。大部分研究均已證實(shí)， 百令膠囊具有以下作用：①免疫調(diào)節(jié)作用：主要是通過抑制抗原遞呈細(xì)胞的功能， 阻斷外來信號(hào)刺激的呈遞， 影響樹突細(xì)胞刺激增殖的能力， 出現(xiàn)免疫抑制。②抗氧化作用：主要是通過激活單核巨噬細(xì)胞T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞來阻止自由基和脂質(zhì)過氧化的損傷。③抗纖維化作用：主要是通過抑制一些促纖維化因子的表達(dá)來抑制膠原及細(xì)胞外基質(zhì)的生成。④保護(hù)腎功能：主要包括減少尿蛋白， 保護(hù)腎小管細(xì)胞Na+-K+-ATP酶， 促進(jìn)腎小管細(xì)胞增殖及細(xì)胞修復(fù)， 抑制腎小球的代償性肥大。⑤抗炎作用：主要是通過抑制炎癥因子水平， 糾正Th1/Th2失衡。⑥輔助治療腫瘤：百令膠囊中含有的多肽或蛋白質(zhì)、核苷類衍生物、多糖類等能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)， 增強(qiáng)放化療的耐受性及減輕毒性[7-9]。

D-甘露醇的測(cè)定方法較多， 常用的主要有高碘酸鹽氧化法、旋光法、折光法、比重法、分光光度法、高效液相色譜法等， 其中高碘酸鹽法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度較好， 但操作比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)， 對(duì)操作者的要求較高；旋光法、折光法操作比較簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、方便；比重法雖然操作簡(jiǎn)單準(zhǔn)確， 但比較費(fèi)時(shí)， 這幾種方法容易受到實(shí)驗(yàn)室的溫度、溶劑、儀器性能等因素的干擾， 導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確， 并且均適用于測(cè)定純甘露醇含量[10-12]。紫光分光光度法是指在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸光度， 對(duì)待測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法， 操作比較簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確、快捷， 可適用于甘露醇的混合物的檢測(cè)， 能夠排除樣品中的其他還原物質(zhì)的干擾， 能夠測(cè)定D-甘露醇的實(shí)際含量。而高效液相色譜法是以液體為流動(dòng)相， 采用高壓輸液系統(tǒng)， 將流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱， 在柱內(nèi)各成分被分離后， 進(jìn)入檢測(cè)器， 對(duì)試樣進(jìn)行分析， 操作比較復(fù)雜， 準(zhǔn)確， 穩(wěn)定性較好， 專屬性強(qiáng)， 但在溶液制備過程中應(yīng)以流動(dòng)相制備對(duì)照品和樣品溶液， 以減少其他溶劑對(duì)待測(cè)成分折光率的影響， 此外還需要控制柱溫和室溫， 以免影響折光率。大部分研究顯示， 高效液相色譜法中流動(dòng)相的比例是影響D-甘露醇分離度的主要因素， 本研究采用甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（17∶83）流動(dòng)相可使D-甘露醇色譜峰與其他峰完全脫離， 達(dá)到較好的分離效果， 能夠測(cè)定D-甘露醇的實(shí)際含量[13]。故本研究針對(duì)紫光分光光度法和高效液相色譜法這兩種方法測(cè)量百令膠囊中D-甘露醇的含量進(jìn)行比較。

有研究采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD）法測(cè)定百令膠囊中甘露醇的含量， 結(jié)果顯示， 甘露醇含量為10.00～27.60 mg/g， 平均17.3973 mg/g[14]， 高于本研究?jī)煞N方法測(cè)定甘露醇的含量。還有研究采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)（HPLC-RID）法和滴定法測(cè)定百令膠囊中甘露醇的含量[15]， 結(jié)果顯示， HPLC-RID測(cè)定的含量為5.94～7.29 mg/g， 與本研究結(jié)果基本一致， 而滴定法為14.85～18.10 mg/g， 顯著高于本研究結(jié)果。這說明HPLC-ELSD法和滴定法均不能測(cè)定甘露醇的實(shí)際含量， 可能測(cè)定的是所有還原性糖的含量， 故而測(cè)定的含量較高， 而HPLC-RID法采用以乙醇為溶劑， 加熱回流提取甘露醇， 預(yù)處理比較簡(jiǎn)單， 分離度較高， 故可測(cè)定甘露醇的實(shí)際含量。本研究顯示， 紫光分光光度法測(cè)定的D-甘露醇含量顯著低于高效液相色譜法， 但相關(guān)性較好（r=0.965）。雖然兩種方法均能測(cè)定甘露醇的實(shí)際含量， 但高效液相色譜法的靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均優(yōu)于紫光分光光度法， 但考慮到紫光分光光度法操作比較簡(jiǎn)單， 對(duì)試劑的要求較低， 不需要特定標(biāo)準(zhǔn)品， 經(jīng)濟(jì)， 快速， 故適用于百令膠囊中甘露醇的定量檢測(cè)。

綜上所述， 高效液相色譜法能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定百令膠囊中D-甘露醇的含量， 且靈敏度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性均較高， 隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展， 高效液相色譜法的成本能夠降低， 逐漸成為測(cè)定甘露醇含量的主要方法。但在日常檢測(cè)中， 應(yīng)充分了解兩種方法的優(yōu)、缺點(diǎn)， 結(jié)合實(shí)際情況選擇使用兩種方法， 保證百令膠囊的臨床效果。

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