肇慶地區(qū)血小板供者庫(kù)的建立及應(yīng)用

廖揚(yáng)勛 陳志忠 余文潮 陳尚良 梁潔貞 陳超紅 李結(jié)敏

肇慶地區(qū)血小板供者庫(kù)的建立及應(yīng)用

廖揚(yáng)勛★陳志忠 余文潮 陳尚良 梁潔貞 陳超紅 李結(jié)敏

目的 建立肇慶地區(qū)已知人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因分型及人類血小板抗原（human platelet alloantigen，HPA）HPA?1～6、9、15基因型的無(wú)償機(jī)采血小板供者庫(kù)，為臨床血小板輸注無(wú)效（platelet transfusion refractory，PTR）患者提供HLA及HPA相合的血小板。 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)?序列特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction?sequence specific olignuliotide probe，PCR?SSO）檢測(cè)血小板供者的HLA基因分型及聚合酶鏈反應(yīng)?序列特異性引物（polymerase chain reaction?sequence specific primer，PCR?SSP）檢測(cè) HPA?1～6、9、15基因型。對(duì)雜合度高的HPA?3、15隨機(jī)抽樣20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序。對(duì)3例患者進(jìn)行HLA?I分型。 結(jié)果 成功檢測(cè)出101名無(wú)償血小板捐獻(xiàn)者HLA及HPA?1～6、9、15基因型；HPA?3、15的測(cè)序結(jié)果與PCR?SSP一致。HLA?A位點(diǎn)等位基因共檢出11個(gè)；HLA?B位點(diǎn)共檢出等位基因20個(gè)。3例患者中的1例從已知的HLA血小板庫(kù)中找到完全一致供者，另外2例也找到三位點(diǎn)吻合的血小板供者。 結(jié)論 建立基于HLA?I類抗原及HPA基因分型的血小板供者資料庫(kù)，有助于給PTR患者提供HLA和HPA相合的單采血小板。

HLA基因分型；HPA基因分型；血小板輸注無(wú)效；血小板供者資料庫(kù)；測(cè)序

目前臨床上治療血小板減少患者時(shí)，輸注血小板是有效的措施，但反復(fù)輸注有可能產(chǎn)生同種免疫，導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效。約有20%～50%白血病患者，80%的再生障礙性貧血患者長(zhǎng)期輸注血小板后輸注無(wú)效［1］。引起血小板輸注無(wú)效（platelet transfusion refractory，PTR）的原因眾多，其中20%～30%為免疫因素［2］。由于血小板表面有豐富的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）及人類血小板抗原（human platelet alloantigen，HPA），這些特異性抗原能通過(guò)輸注血小板產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，將可能導(dǎo)致PTR。建立已知HPA及HLA基因供者資料庫(kù)，能夠?yàn)榛颊咛峁┫嗯浜系难“?，減少PTR的發(fā)生。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，HPA及HLA基因已闡明，本研究采用分子生物學(xué)PCR技術(shù)對(duì)血小板供者HPA及HLA進(jìn)行基因分型，為患者提供相配合的血小板，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究隨機(jī)選擇肇慶地區(qū)漢族機(jī)采血小板供者庫(kù)中獻(xiàn)血者101名，其中男性87人份，女性14人份，年齡19～55歲（平均年齡34.0歲），用于建立HLA及HPA基因定型的機(jī)采血小板供者庫(kù)。選取了3例白血病患者（來(lái)源于肇慶市第一人民醫(yī)院）進(jìn)行應(yīng)用研究。

1.2 主要試劑與儀器

Magcore DNA自動(dòng)提取儀（RBC Bioscience Crop，中國(guó)臺(tái)灣），HPA基因分型試劑盒（Innotrain，德國(guó)。批號(hào)：S9HX045），HLA基因分型試劑盒（北京曼泰里生物技術(shù)有限公司）；Taq酶（Promaga，美國(guó)），高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），PCR擴(kuò)增儀（ABI，美國(guó)），電泳儀（Bio?rad，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：LG2020D）。

1.3 DNA制備

使用Magcore DNA自動(dòng)提取儀提取及測(cè)定DNA濃度，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA濃度測(cè)定范圍為20～60 ng/μL，純度測(cè)定A260/A280比率為1.6～2.0。DNA儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)?序列特異性引物（polymerase chain reaction?sequence specific primer，PCR?SSP）擴(kuò)增

PCR?SSP擴(kuò)增，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每人份用量：取Ready PCR Buffer工作液60 μL、Taq酶1.6 μL、DNA標(biāo)本1000 ng，其余加水，總反應(yīng)體積混合液為200 μL。用振蕩器混合后，并瞬時(shí)離心，使液體置于管底，分別向PCR反應(yīng)板每個(gè)引物孔各加入上述混合液10 μL。加封蓋后，將反應(yīng)板放入設(shè)置好循環(huán)參數(shù)的PCR儀內(nèi)，擴(kuò)增程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，70℃ 60 s，5個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，65℃ 60 s，72℃ 45 s，10個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，61℃ 50 s，72℃ 45 s，20個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。

1.5 電泳

電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳25 min，在凝膠成像儀下觀察，進(jìn)行結(jié)果判斷并拍攝成像，保存試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 血小板的HLA檢測(cè)

具體操作步驟按北京曼泰里生物技術(shù)有限公司的聚合酶鏈反應(yīng)?序列特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction?sequence specific olignu?liotide probe，PCR?SSO）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 3例患者進(jìn)行HLA檢測(cè)

使用北京曼泰里公司PCR?SSO試劑盒進(jìn)行HLA分型。

1.8 抽樣20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序

對(duì)雜合度高的HPA?3、15隨機(jī)抽樣20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，引物見(jiàn)表1。

表1 HPA?3、15的PCR?SBT引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of PCR?SBT primers for HPA ?3 and 15

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HPA基因頻率=陽(yáng)性基因數(shù)/總基因數(shù)，HPA基因型頻率=基因型數(shù)/總基因數(shù)。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)處理軟件，按統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理原則，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析。HLA基因分析應(yīng)用pypop 進(jìn)行分析［4］。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板供者庫(kù)HPA?1～6、9、15基因多態(tài)性分布情況

本地區(qū)人群HPA?2、3、5、6、15 基因分型頻率均符合 Hardy?Weinberg 遺傳平衡定律；HPA?3、15系統(tǒng)中抗原頻率接近，HPA?2、5、6中aa基因型為主，HPA?1、9未檢出b基因，結(jié)果見(jiàn)表2。其中1例樣品 HPA?1～6、9、15 等位基因分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 HPA?3、15基因測(cè)序分型

采用我們合成的引物對(duì)20份隨機(jī)標(biāo)本作HPA?3、15基因測(cè)序分型：與PCR?SSP的結(jié)果完全一致。HPA?3與HPA?15的基因多態(tài)性測(cè)序圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

2.3 血小板供者庫(kù)HLA等位基因分型及特征

HLA?A位點(diǎn)共檢出等位基因11個(gè)，見(jiàn)表3。

表2 肇慶地區(qū)HPA?1～6、9、15基因型和基因頻率分布Table 2 Genotype and gene frequency distribution of HPA?1～6,9,15 in Zhaoqing

圖1 1例標(biāo)本的HPA?1～6、9、15等位基因分型結(jié)果電泳圖Figure 1 One case of HPA?1～6,9,15 allelic pattern electrophoresis results

圖2 HPA?3基因分型測(cè)序圖Figure 2 HPA?3 genotyping sequence map

其中頻率高于5%的等位基因是：A11、A02、A24、A33；HLA?B位點(diǎn)共檢出等位基因20個(gè)，見(jiàn)表3。

圖3 HPA?15基因分型測(cè)序圖Figure 3 HPA?15 genotyping sequence map

表3 肇慶地區(qū)血小板獻(xiàn)血人群HLA?A、B等位基因頻率（%）Table 3 Allele frequencies of HLA?A and B alleles in platelet donors in Zhaoqing（%）

其中頻率高于5%的等位基因是：B13、B46、B75、B60、B38、B58和B51。

2.4 血小板供者庫(kù)HLA?A、B位點(diǎn)兩座位單倍型頻率和特征

HLA?A、B位點(diǎn)兩座位單倍型結(jié)果，見(jiàn)表4。

2.5 患者的HLA的基因分型

3例患者的HLA基因分型結(jié)果如下，見(jiàn)表5。

表4 肇慶地區(qū)獻(xiàn)血者頻率高于0.5%的HLA?A、B單倍型（%）Table 4 Haplotype frequencies of HLA?A and B alleles in platelet donors in Zhaoqing（%）

表5 3例患者的HLA的基因分型Table 5 Genotyping of HLA in 3 patients

3 討論

引起PTR的原因眾多，其中20%～30%為免疫因素［2］。人類血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原，與輸血相關(guān)且抗原性較強(qiáng)的有2大類，其中之一是人類白細(xì)胞抗原（HLA），血小板表面有HLA?I類抗原，缺少 HLA?Ⅱ類抗原［4?5］。本研究中只針對(duì)血小板上的HLA?I類抗原即HLA?A與HLA?B等位基因進(jìn)行分型。由于本研究采用PCR?SSO的方法，相對(duì)于PCR?SSP來(lái)說(shuō)，具有分辨率高、特異高的特點(diǎn)，最重要的一點(diǎn)是可以進(jìn)行大批量操作，PCR?SSP則不能達(dá)到相應(yīng)的要求，因此利用PCR?SSO可以快速便捷把血小板供者HLA資料庫(kù)建立起來(lái)。本研究中，HLA?A位點(diǎn)共檢出11個(gè)不同等位基因，其中頻率高于5%的等位基因是：A11、A02、A24、A33；HLA?B 位點(diǎn)共檢出 20個(gè)不同等位基因，其中頻率高于5%的等位基因是：B13、B46、B75、B60、B38、B58和B51。HLA?A頻率大于30%的等位基因有A2及A11，HLA?B大于頻率10%的有B13、B46及B75，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道南方人群的 HLA 基因分型大致相同［4?7］。

建立血小板供者HLA資料庫(kù)，這對(duì)于HLA抗體引起的PTR，就可以從血小板庫(kù)中更容易找到相配合的血小板供者。單倍型分析中發(fā)現(xiàn)頻率大于10%的有A2?B46和 A11?B13，表明可選擇HLA相合供者概率更大。本研究對(duì)3例患者的HLA基因分析中，1例從已知的HLA血小板庫(kù)中找到完全一致供者，另外2例也找到三位點(diǎn)吻合的血小板供者。如果有患者需要，只要對(duì)患者進(jìn)行HLA分型，就可以從血小板庫(kù)里查找相合的供者，而且相合度越高輸注效果越好［8］。

雖然引起PTR的主要為HLA抗體，但另一大類血小板抗原HPA引起的PTR也有相當(dāng)比例。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，因 HPA 不合導(dǎo)致 PTR 大于 10%［9?10］，因此同時(shí)建立血小板供者HPA資料庫(kù)，也尤為重要。HPA基因分型方法主要有：PCR?SSO、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、PCR?SSP 等。PCR?SSO 方法比較繁瑣，判斷試驗(yàn)結(jié)果不太容易，而且需要昂貴的儀器。RFLP方法較PCR?SSO方法簡(jiǎn)單，但由于需要限制性內(nèi)切酶的使用及消化步驟，仍較為繁瑣。PCR?SSP擴(kuò)增后凝膠電泳，直接獲得結(jié)果，比前2種方法較簡(jiǎn)單而且快速、經(jīng)濟(jì)。本研究應(yīng)用PCR?SSP方法對(duì)血小板基因進(jìn)行分型，檢測(cè)了肇慶地區(qū)101名隨機(jī)固定血小板獻(xiàn)血者的HPA?1～6、9、15基因分布，其中HPA?2、3、5、6、15基因分型頻率均符合Hardy?Weinberg遺傳平衡定律。發(fā)現(xiàn)HPA?3、15出現(xiàn)高度多態(tài)性，HPA?2、5、6的基因型以aa為主。HPA?1、9未檢出b基因，均為a/a純合子。血小板抗原HPA不合的血小板輸注中，歐州各國(guó)血小板輸注無(wú)效多數(shù)是由于HPA?1a基因引起的。亞洲地區(qū)人群約99%具有HPA?1a基因［12?16］，與肇慶地區(qū)基本一致。本研究加入了多態(tài)性不高的HPA?9基因分型，雖然未檢出b基因，均為a/a純合子，但提示肇慶地區(qū)HPA?9b基因的確基本接近無(wú)，與山東地區(qū)、廣西地區(qū)一致［12，14，16］。HPA?3、15為高多態(tài)性表達(dá)基因，我們的檢測(cè)結(jié)果表明HPA?3、15基因多態(tài)性中的不配合率較高，在輸血上具有重要的免疫學(xué)意義。同時(shí)筆者對(duì)HPA?3、15進(jìn)行基因分析測(cè)序，結(jié)果與PCR?SSP一致。HPA基因PCR?SBT分型技術(shù)具有高分辨率，圖2及圖3中顯示可以從2方面來(lái)分辨：第一，從顏色來(lái)區(qū)分，HPA?3a與HPA?3b為多態(tài)性位置峰分別為紅色與黑色單峰，HPA?15a與HPA?15b為多態(tài)性位置峰分別為藍(lán)色與綠色單峰；第二，從峰的多少來(lái)分辨，出現(xiàn)雙峰的都是雜合基因型分別是 HPA?3ab及 HPA?15ab。PCR?SBT 分型技術(shù)具有高精確度、從峰圖能直接發(fā)現(xiàn)是否存在新的等位基因等特點(diǎn)，而且可以彌補(bǔ)PCR?SSP的不足之處，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的檢測(cè)技術(shù)。

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Establishment and clinical application of platelet donor registry in Zhaoqing area

LIAO Yangxun★,CHEN Zhizhong,YU Wenchao,CHEN Shangliang,LIANG Jiezhen,CHEN Chaohong,LI Jiemin
（Zhaoqing Blood Center,Zhaoqing,Guangdong,China,526040）

Objective To establish a human leukocyte antigen(HLA)and human platelet alloantigen(HPA)?1～6,9,15 genetic and volunteer apheresis platelet donor registry in Zhaoqinq;to provide matched HLA and HPA platelets for patients with platelet transfusion refractoriness(PTR). Methods The polymerase chain reaction?sequence specific primer(PCR?SSP)method was established for HPA?1～6,9,15 genotyping.HLA genotyping was performed by polymerase chain reaction?sequence specific olignuliotide probe(PCR?SSO).The HPA ?3,15 genotype of a random 20 specimens were analyzed by sequence?based typing(SBT)method.Results The PCR?SSP method for HPA?1～6,9,15 genotyping was established and the HLA typing of 101 donors were identified.HPA?3,15 sequencing results are consistent with the PCR?SSP.HLA?A locus were detected 11 alleles,while 20 allele genes were detected at HLA?B locus. Conclusion A platelet donor database based on HLA?I class antigen and HPA genotyping was established.It is helpful to provide HLA and HPA compatible apheresis platelets for PTR patients.

HLA genotyping;HPA genotyping;Platelet transfusion refractory;Platelet donor registry;Sequencing

廣東省肇慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014F006）

肇慶市中心血站，廣東，肇慶526040

★通訊作者：廖揚(yáng)勛，E?mail：13929881671@163.com