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    中藥對多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵的作用研究

    2017-11-25 02:29:07王淋荊曾建明魯洋藍鍇羅強林冬玲張偉錚陳茶
    分子診斷與治療雜志 2017年6期
    關鍵詞:五倍子穿心蓮夏枯草

    王淋荊 曾建明 魯洋 藍鍇 羅強 林冬玲 張偉錚 陳茶★

    中藥對多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵的作用研究

    王淋荊1,2曾建明1魯洋1藍鍇1羅強1林冬玲1張偉錚1陳茶1★

    目的 研究中藥與常用抗生素的相互作用和對多重耐藥銅綠假單胞菌(multi drug resistantPseudomonas aeruginosa,MDR?PA)外排泵的作用。 方法 采用外排泵抑制劑聯(lián)合紙片擴散法(Kirby?Bauer,K?B)篩選外排泵陽性 MDR?PA,并用實時熒光定量 PCR(real?time fluorescence quantitative PCR,qPCR)確認外排泵基因高表達菌株。檢測10種常用中藥對抗生素的作用和對外排泵陽性MDR?PA外排泵基因表達的影響。 結果 從34株MDR?PA中篩選到5株外排泵陽性菌,qPCR法檢測到這5株菌外排泵基因的表達水平是野生型銅綠假單胞菌PAOl的2倍或2倍以上(P<0.05)。黃芩、金銀花和夏枯草對環(huán)丙沙星有較強的拮抗作用,穿心蓮和五倍子對慶大霉素的拮抗作用最強,穿心蓮和夏枯草對美羅培南的協(xié)同作用最強。穿心蓮、金銀花、夏枯草和五倍子具有促進外排泵基因表達的作用。 結論 中藥穿心蓮、金銀花、夏枯草和五倍子可通過促進外排泵基因的表達拮抗抗生素的抗菌作用,臨床抗感染治療時需謹慎使用。

    銅綠假單胞菌;多重耐藥;外排泵;穿心蓮;金銀花;夏枯草;五倍子

    銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是非發(fā)酵革蘭陰性桿菌,為院內(nèi)感染的主要病原菌之一[1]。近年來,由于喹諾酮類和碳青霉烯類等抗生素的廣泛應用,臨床多重耐藥銅綠假單胞菌(multiple?drug resistantPseudomonas aeruginosa,MDR?PA)的分離率逐年增高,給抗感染治療帶來很大困難[2?3]。PA 產(chǎn)生耐藥性的機制復雜,包括抗生素靶位改變、滅活酶產(chǎn)生、生物膜形成和主動外排系統(tǒng)過度表達等[4?5]。外排系統(tǒng)過表達可將進入細菌體內(nèi)絕大部分的抗生素外排,介導產(chǎn)生高水平的耐藥[6?7]。而外排泵抑制劑苯丙氨酸?精氨酸?β 萘酰胺(phe?arg?β?naphthylamide,PAβN,即MC?207110)能夠有效地抑制外排泵活性[8],可恢復 MDR?PA 對于環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)和美羅培南(meropenem,MEM)的敏感性[9]。

    中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分,現(xiàn)代研究已證實多種中藥具有抗菌抑菌的作用[10]。由于中藥的種類繁多,單味中藥成分復雜,中藥與抗生素的相互作用和機制尚不清楚。本研究從34株臨床分離的MDR?PA中篩選出外排泵過表達的菌株,確定其耐藥表型。選擇10種常用的中藥制成水煎液,研究其與常用抗生素的相互作用和對MDR?PA外排泵的作用,為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 菌株

    34株MDR?PA分離自2016年2月至7月間廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院門診及住院患者送檢的痰液、尿液和胸腔積液等標本,野生型銅綠假單胞菌PAO1由重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院鄒琳教授惠贈。

    1.2 試劑

    外排泵抑制劑PAβN購自美國Sigma公司;CIP 10 μg、MEM 15 μg、慶大霉素(gentamicin,CN)120 μg、紅霉素(erythromycin,E)5 μg,藥敏紙片購自賽默飛世爾科技有限公司;抗生素(CIP、MEM)、LB(lysogeny broth,LB)培養(yǎng)基和水解酪蛋白(muller hinton,M?H)平板均購自上海生物工程股份有限公司;熒光染料SYBR Premix Ex TaqⅡ和逆轉錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

    1.3 藥敏實驗

    微量肉湯倍比稀釋法:分別挑單個菌落接種入3 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃200 r/min搖至對數(shù)生長期,取100 μL加入96孔板,使每孔菌液為5×104CFU;采用倍比稀釋法將抗生素由256 μg/mL稀釋至 0.25 μg/mL,取 100 μL 加入 96 孔板;37℃孵箱培養(yǎng)18 h,根據(jù)2016年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準判斷結果[11]。

    1.4 外排泵表型陽性菌株的篩選

    制備添加PAβN(終濃度50 μg/mL)的M?H平板[12],紙片擴散法(kirby?bauer,K?B)檢測 34 株MDR?PA對CIP、MEM、CN和E藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑,以未加PAβN的M?H平板做對照,根據(jù)CLSI 2016年標準,結果由耐藥變?yōu)槊舾谢蛑薪椋袛酁橥馀疟帽硇完栃跃辍?/p>

    1.5 qPCR檢測所篩選菌株外排泵相關基因表達水平

    分別取外排泵表型陽性菌株單個菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃200 r/min增菌至對數(shù)生長期。收集1.5 mL菌液離心,加入RNAiso Plus提取RNA,逆轉錄為cDNA,采用SYBR Green染料法定量檢測Mex?AB、Mex?CD、Mex?EF基因表達量,以rpoD為內(nèi)參基因,引物序列見表1。qPCR條件:98℃ 8 min;95℃ 15 s,60℃ 45 s,循環(huán)40次。

    表1 外排泵基因引物序列Table 1 The primers of efflux pump gene

    1.6 中藥制備

    黃芩、黃連、黃柏、金銀花、夏枯草、五倍子、射干、蒼術、穿心蓮和魚腥草均購自康美藥業(yè)股份有限公司。中藥飲片各120 g分別用水煎2次,頭煎30 min,二煎20 min。根莖類中藥飲片頭煎加水840 mL,二煎加水720 mL?;?、葉、全草類中藥飲片頭煎加水1200 mL,二煎加水960 mL。取2次水煎液混合后紗布過濾,60℃旋轉蒸發(fā)濃縮至120 mL,即得生藥1000 mg/mL的中藥水煎液,用0.22 μm濾膜過濾除菌,-20℃儲存?zhèn)溆茫?3]。

    1.7 中藥對抗生素抑菌作用的影響

    將10種中藥水煎液分別加入M?H瓊脂內(nèi),制成含中藥的M?H平板(射干、穿心蓮、黃連、黃柏、黃芩的低、高濃度分別為2、20 mg/mL;魚腥草、金銀花、蒼術、夏枯草的低、高濃度分別為1、10 mg/mL;五倍子的低、高濃度分別為0.2、2 mg/mL),采用K?B法檢測PAO1及外排泵陽性菌株對抗生素紙片CIP、MEM、CN和E的抑菌環(huán)直徑,以不加中藥水煎液的M?H平板為對照,觀察抑菌環(huán)的變化。

    1.8 中藥對外排泵基因表達水平的影響

    挑取外排泵陽性菌株單個菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi),37℃200 r/min過夜增菌,二次增菌至對數(shù)生長期,分別設置空白對照組、CIP干預組[以各菌株的亞MIC(minimum inhibitory concentra?tion)濃度處理]、中藥干預組(金銀花、夏枯草的低、高濃度分別為10、20 mg/mL;五倍子的濃度為2 mg/mL)、CIP和中藥聯(lián)合干預組(提前1 h加入各菌株的亞MIC濃度CIP干預),各組細菌37℃靜置培養(yǎng)2、4 h后分別收取菌液,qPCR檢測外排泵相關基因表達水平(方法同1.5)。

    1.9 統(tǒng)計學分析

    應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 34株MDR?PA藥敏試驗結果

    采用微量肉湯稀釋法檢測臨床分離的34株mRPA的藥敏,根據(jù)2016年CLSI判斷標準,34株PA均為CIP、MEM耐藥株,結果見表2。

    表234株MDR?PA對CIP和MEM的MIC分布情況Table 2 The MIC distribution of CIP and MEM in 34 strains of MDR?PA

    2.2 外排泵表型陽性菌株篩選結果

    添加 PAβN(50 μg/mL)后,34株 MDR?PA 對CIP、MEM、CN和E的抑菌環(huán)直徑變大,其中MEM的抑制環(huán)直徑變化范圍為0~23 mm,中位數(shù)為11 mm。對MEM由耐藥變?yōu)槊舾械腜A有24株;對CIP由耐藥變?yōu)槊舾械腜A有7株,兩者交集的菌株有5株(PA8、PA11、PA14、PA29和PA36),確定為外排泵表型陽性菌株。

    2.3 qPCR檢測所篩選菌株外排泵相關基因表達

    以PAOl為對照,5株MDR?PA中每株菌的外排泵基因MexA、MexC、MexE中至少有一個的表達水平是PAOl的2倍或2倍以上,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結果見圖1。

    圖1 外排泵陽性菌株外排泵基因表達量Figure 1 Expression of efflux pump gene in positive strains of efflux pump

    2.4 中藥對抗生素抑菌作用的影響

    通過K?B法檢測的高濃度中藥組(tcmhigh)與低濃度中藥組(tcmlow)所測抑菌環(huán)直徑差值來判斷中藥與抗生素的作用關系,如果抑菌環(huán)直徑差值小于零,提示中藥與抗生素的作用為拮抗作用,反之為協(xié)同作用。從表3中可見,所用的10種中藥對CIP均表現(xiàn)為拮抗作用,其中黃芩、金銀花和夏枯草的拮抗作用最強。10種中藥除魚腥草外均對CN表現(xiàn)為拮抗作用,其中穿心蓮和五倍子的拮抗作用最強。穿心蓮、夏枯草和五倍子對MEM具有協(xié)同作用,其中穿心蓮的協(xié)同作用最強。各種中藥對E幾乎沒有影響。

    進一步分析發(fā)現(xiàn),中藥幾乎不影響PA29的抑菌環(huán)直徑;五倍子對PA36、黃芩對PA11、穿心蓮和夏枯草對PA14、穿心蓮和五倍子對PA8的抑菌環(huán)直徑有顯著影響,結果見表4和圖2。

    表3 中藥對抗生素抑菌作用的影響(最大值/最小值,mm)Table 3 Effect of traditional Chinese medicine on bacteriostasis of antibiotics(Maximum/Minimum,mm)

    表4 MDR?PA對中藥與抗生素的反應(最大值/最小值,mm)Table 4 The reactions of MDR?PA to traditional Chinese medicine and antibiotics(Maximum/Minimum,mm)

    圖3 qPCR檢測中藥對外排泵基因表達的影響Figure 3 The effect of traditional Chinese medicine on efflux pump gene expression by qPCR

    2.5 中藥對外排泵基因表達的影響

    從中藥對外排泵陽性菌株抑菌環(huán)直徑影響較大的處理組中,分別選出中藥穿心蓮、夏枯草、金銀花和五倍子,菌株PA8、PA11和PA36,分組處理后采用qPCR法檢測外排泵基因的表達情況。從圖3可見,夏枯草、金銀花和五倍子均能顯著增加MDR?PA外排泵基因的表達。穿心蓮處理2 h已能促進PA8的MexC和MexE的表達,4 h時更明顯;在CIP作用下,穿心蓮能明顯增強MexC和MexE的表達,4 h時表達水平回落;2 h時,穿心蓮主要引起PA11MexE表達增強。夏枯草對PA8的MexA、MexC和MexE表達無明顯影響;在CIP作用下,夏枯草處理2 h能顯著提高各基因的表達水平,尤其是MexE(P< 0.001)。對PA36,夏枯草單獨或聯(lián)合CIP的作用相似,主要引起MexE表達增高。在干預4 h的情況下五倍子能使PA11外排泵MexC、MexE基因表達量分別增強123倍和79倍。CIP對各菌株MexA、MexC和MexE的影響不大??瞻讓φ战M、CIP處理組、中藥處理組、CIP與中藥聯(lián)合處理組間外排泵基因表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    3 討論

    外排泵基因過表達是PA多重耐藥的重要機制之一。PA外排泵由3部分組成:①內(nèi)膜蛋白,如MexB、MexD、MexF、MexY,為主要的泵出蛋白,具有識別底物的作用,但不具特異性;②膜融合蛋白或連結蛋白,如 MexA、MexC、MexE、MexX,連接內(nèi)、外膜蛋白;③外膜蛋白,如OprM、OprJ、OprN,形成門通道,有利于底物通過外膜。目前研究最多的PA外排泵分子分別是MexAB?OprM、MexCD?OprJ和 MexEF?OprN,均屬于耐藥小結節(jié) 分裂(resistance?nodulation?division,RND)家族[5,7]。PAβN是經(jīng)典的RND型外排泵抑制劑,能夠競爭性的與外排泵相應位點結合阻止抗生素外排,使菌株對抗生素的MIC值降低,提高菌株對于抗生素的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)PAβN能夠將多粘菌素敏感的MDR?PA的MIC值降低四倍以上[15]。根據(jù)文獻報道的外排泵對應的底物,本實驗以CIP篩查MexEF?oprN,MEM篩查MexAB?oprM,CN篩查MexXY?OprM,E 篩查 MexCD?oprJ[14],采用外排泵抑制劑聯(lián)合K?B法從表型上篩選外排泵陽性MDR?PA,用于后續(xù)中藥對MDR?PA外排泵的作用研究。

    本研究發(fā)現(xiàn),PAβN能提高MDR?PA對于抗生素的敏感性,與文獻報道一致[8]。以CIP和MEM聯(lián)合PAβN從34株MDR?PA中篩選到5株外排泵陽性MDR?PA?;蛩降难芯堪l(fā)現(xiàn)這5株菌的MexA表達均顯著高于野生株PAO1,并且各菌株還伴有MexC和/或MexE基因高表達,提示外排泵基因高表達是導致PA多藥耐藥的重要機制,篩選到的MDR?PA菌株外排泵基因表型與外排泵表型一致。

    中藥具有一定的抗菌作用,但是中藥與抗生素的作用和作用機制尚不清楚。本文根據(jù)文獻[16?17]和課題組前期結果,從清熱解毒藥及收澀藥中遴選了10味中藥,通過K?B法檢測的高濃度中藥組與低濃度中藥組所測抑菌環(huán)直徑差值來判斷中藥與抗生素的作用關系,如果抑菌環(huán)直徑差值小于零,提示中藥與抗生素的作用為拮抗作用,反之為協(xié)同作用[18]。實驗結果發(fā)現(xiàn)中藥與抗生素的相互作用主要表現(xiàn)為拮抗作用,黃芩、金銀花和夏枯草對環(huán)丙沙星有較強的拮抗作用,穿心蓮和五倍子對慶大霉素的拮抗作用最強(見表4)。

    楊祚明等[19]發(fā)現(xiàn)哌拉西林/他唑巴坦能降低PA對CIP、MEM等抗生素的MIC值,并能降低MexA、MexX基因的表達水平。而本文發(fā)現(xiàn)夏枯草、金銀花、五倍子、穿心蓮單獨或聯(lián)合CIP均能不同程度地促進MDR?PA外排泵基因表達,尤其是MexC、MexE基因表達變化最為顯著,提示中藥通過促進外排泵基因表達發(fā)揮拮抗抗生素的作用。與抗生素哌拉西林/他唑巴坦降低外排泵基因MexA、MexX表達發(fā)揮抗菌作用相比,中藥導致MDR?PA外排泵基因表達水平升高,可能是中藥不能抑制MDR?PA的原因。

    隨著中西醫(yī)結合的深入發(fā)展,中西藥聯(lián)合應用已日趨普遍。一般認為,中藥藥性平和,毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性,與西藥聯(lián)用可增強療效。但本實驗從表型和基因水平的研究結果表明,中藥穿心蓮、金銀花、夏枯草和五倍子可通過促進外排泵基因的表達拮抗抗生素的抗菌作用。因此,盲目聯(lián)用中藥和抗生素,可能會對抗生素產(chǎn)生拮抗,降低療效,臨床抗感染時抗生素與中藥的聯(lián)用需謹慎。

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    Study on the effect of traditional Chinese medicine on efflux pump of multi?drug resistantPseudomonas aeruginosa

    WANG Linjing1,2,ZENG Jianming1,LU Yang1,LAN Kai1, LUO Qiang1, LIN Dongling1,ZHANG Weizheng1,CHEN Cha1★
    (1.Department of Laboratory Medicine,Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong,China,510006;2.Second Clinical Medical College,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong,China,510006)

    Objective To study the effect of traditional Chinese medicine on efflux pump ofPseudomonas aeruginosawith multiple drug resistance(MDR?PA). Methods Kirby?Bauer(K?B)test and real?time fluorescence quantitative PCR(qPCR)were used to screen positive bacteria of efflux pump in MDR?PA.The effect of 10 kinds of traditional Chinese medicine on the role of antibiotics and the expression of efflux pump genes positive MDR?PA were detected. Results 5 strains of efflux pump positive bacteria were screened from 34 strains of MDR?PA,and the expression level of efflux pump gene was 2 times or more than that of wild type Pseudomonas aeruginosa(P<0.05).Scutellaria,honeysuckle and prunella have strong antagonism against ciprofloxacin,andrographis paniculata and gallnut have the strongest antagonism against gentamicin,and andrographolide and prunella have the strongestsynergistic effecton meropenem.Andrographis paniculata,flos lonicerae,prunella vulgaris and gallnut chinensis have the function of promoting the gene expression of efflux pump. Conclusions Andrographis paniculata,flos lonicerae,prunella vulgaris and gallnut can antagonize the antibiotic effect by promoting the expression of efflux pump gene,and use caution in clinical anti?infection treatment.

    Pseudomonas aeruginosa;Multiple?drug resistant;Efflux pump;Andrographis paniculata;Honeysuckle;Prunella vulgans;Gallnut

    廣東省科技計劃項目(2014A020212281,2016A020215236);廣東省中醫(yī)院拔尖人才專項(2014KT1491)

    1.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部,廣東,廣州510006

    2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,廣東,廣州510006

    ★通訊作者:陳茶,E?mail:chencha906@163.com

    王淋荊和曾建明為并列第一作者

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