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    大苞水竹葉組培快繁及再生體系的建立

    2017-11-22 09:06:18李翠韋瑩李林軒郭曉云趙以民張占江
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年19期
    關(guān)鍵詞:壯藥

    李翠+韋瑩+李林軒+郭曉云+趙以民+張占江

    摘要:擬采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)解決大苞水竹葉種苗短缺和種質(zhì)資源可持續(xù)開發(fā)利用的問題,從而為人工種植提供技術(shù)支持。對消毒劑、消毒時間進行篩選,以大苞水竹葉側(cè)芽為外植體,以MS、B5、N6為基本培養(yǎng)基,采用正交設(shè)計研究植物生長調(diào)節(jié)劑多因素組合[6-BA、KT、NAA、IAA、IBA、活性炭(AC)]對大苞水竹葉進行初代誘導、不定芽分化和誘導生根的影響。結(jié)果表明,體積分數(shù)為0.1%的氯化汞為最佳滅菌劑,滅菌時間為8 min時誘導率最高,最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基;不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT,外植體經(jīng)15 d誘導培養(yǎng),可分化形成11個不定芽;MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA最利于不定芽繼代增殖;MS+2.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA最適于誘導生根獲得再生植株,生根率93.1%;生根苗宜移栽于泥炭+黃沙(體積比 3 ∶1)的基質(zhì)上,成活率84%。由結(jié)果可以看出,該組培快繁途徑繁殖速度快、再生率高,有望為栽培大苞水竹葉提供大量種苗,為壯藥深入開發(fā)利用研究提供依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:大苞水竹葉;壯藥;組培快繁;再生體系

    中圖分類號: Q945.51 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)19-0143-03

    收稿日期:2016-04-28

    基金項目:廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥標準化課題(編號:GZBZ14-15);廣西壯藥質(zhì)量標準研究項目(編號:MZY2013052)。

    作者簡介:李 翠(1982—),女,黑龍江依安人,碩士,助理研究員,主要研究方向為藥用植物繁育與保存。Tel:(0771)5602850;E-mail:licuicui941@aliyun.com。

    通信作者:張占江,博士,副研究員,研究方向為藥用資源保護與開發(fā)利用。Tel:(0771)5603824;E-mail:zzj1811@163.com。 大苞水竹葉{Murdannia bracteata(C. B. Clarke) O. Kuntze[Aneilema bracteata (C. B. Clarke) O. Kuntze]}為鴨趾草科水竹草屬植物[1],是著名的壯藥痰火草的源植物,為多年生常綠草本。大苞水竹葉根呈圓柱狀,長20~30 cm,花期5—8月,果期6—9月,主要生長在海拔500~850 m的水溝邊及密林下,分布于廣東、海南、廣西、云南等地。收載于《中華本草》《全國中草藥匯編》《廣西藥用植物名錄》等。大苞水竹葉多分布于長江以南各?。▍^(qū)),尤以西南地區(qū)為盛。其根入藥,具有較高的藥用價值,售價約100元/kg,具有逐水通便、消腫散結(jié)的功效,主治水腫,此外還有通經(jīng)之效,用于治療慢性腎炎、晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥[2]。近年來,隨著市場需求量的不斷增加,野生大苞水竹葉資源瀕臨枯竭,生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積栽培。采用生物技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù),可以有效快速地提高大苞水竹葉種苗的繁殖速度和質(zhì)量,滿足大苞水竹葉的市場需求,也可為壯藥痰火草資源可持續(xù)開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料和基本培養(yǎng)條件

    本試驗所需材料采集自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園引種繁育圃內(nèi)引種栽培的生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良大苞水竹葉植株,選取其側(cè)芽作為外植體進行誘導,先將大苞水竹葉側(cè)芽表面洗凈去污,用濃度為75%的乙醇滅菌30~45 s,然后用無菌水沖洗1~3次,放入滅菌劑滅菌,再用無菌水沖洗2~5次,然后用無菌濾紙將側(cè)芽表層的水分吸干,最后將測芽置于基本培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng),在平均光照度2 000 lx下培養(yǎng),光照時間12 h/d,溫度(24±2) ℃。

    1.2 適宜滅菌條件的篩選

    設(shè)計2組消毒試驗。第1組設(shè)計不同消毒劑種類:0.1% HgCl2 10 min,2% NaClO 20 min,50%的84消毒液20 min,2% H2O2 20 min,從中篩選最適合的消毒劑;第2組設(shè)計不同的消毒時間:5、6、7、8、9、10 min。所有的試驗都是在接種后 15 d 對試驗對象的污染率、成活率進行統(tǒng)計。

    1.3 不定芽誘導分化條件的篩選

    本試驗基于MS、B5、N6培養(yǎng)基,添加NAA、IAA、6-BA這3種不同類型激素,并開展NAA濃度(0.5、1.0、1.5 mg/L)、KT濃度(0.1、0.2、0.4 mg/L)、6-BA濃度(1.0、1.5、2.0 mg/L)的正交設(shè)計(表1),研究不同激素組合對大苞水竹葉不定芽誘導的影響,每個處理10瓶,每瓶4個外植體,20 d后記錄外植體的誘導情況,比較不同組合誘導不定芽能力的差異。

    1.4 不定芽繁殖條件的篩選

    在MS為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,以6-BA、IAA為生長調(diào)節(jié)激素,考察大苞水竹葉不定芽繁殖情況。通過6-BA(0.5、1.0、1.5 mg/L)、IAA(0.2、0.4、0.6 mg/L)2種激素濃度組合試驗,對大苞水竹葉的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化,每個處理10瓶,每瓶4個單芽,20 d后測定試管苗生長情況和芽增殖倍數(shù)[芽增殖倍數(shù)=(20 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù))/接種時芽數(shù)],以芽增值倍數(shù)為主要考察指標來優(yōu)化繁殖培養(yǎng)基。

    1.5 生根條件的篩選

    為了研究大苞水竹葉無菌苗生根壯苗的最適合培養(yǎng)基,以MS為基本培養(yǎng)基,對IBA濃度(1.0、2.0 mg/L)、活性炭(AC)濃度(0.5、1.0、1.5 mg/L)進行組合試驗,對大苞水竹葉的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化,將生長健壯、高2~3 cm的無根苗接種于4種不同處理的生根培養(yǎng)基上,每個處理10瓶,每瓶8個單芽,培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計結(jié)果,計算生根率與生根數(shù)平均值,相關(guān)公式如下:

    生根率=(生根數(shù)/接種總數(shù))×100%;endprint

    生根數(shù)平均值=(總生根數(shù)/接種總數(shù))×100%。

    1.6 煉苗及移栽

    當生根培養(yǎng)的大苞水竹葉瓶苗長至3~5 cm高、有3張以上葉片和3~5條根時,即可出瓶移栽。挑選生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗,為使無菌苗移栽后適應(yīng)自然環(huán)境,出瓶前在實驗室散射光下煉苗2 d,轉(zhuǎn)移至走廊處煉苗3 d,其間需向瓶內(nèi)植株灑水以保持瓶內(nèi)水分充足,將生根試管苗小心地從培養(yǎng)瓶中取出,用水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基,單株栽入基質(zhì)(V木屑 ∶V草炭土=3 ∶1),置于室內(nèi)1周,2 d澆水1次,保持土質(zhì)80%左右的濕潤度,溫度18~25 ℃,木屑保水性、透氣性都很好。30 d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中組培苗的成活率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 滅菌條件的選擇

    如表2所示,0.1% HgCl2具有較好的消毒效果,外植體消毒成功率達到60%;NaClO、84消毒液、H2O2消毒效果均不夠理想,消毒不徹底,污染率高。由表3知:使用0.1% HgCl2消毒 8 min成功率最高,達到90%, 低于8 min時污染率高,

    高于8 min時,污染率雖然降低,但是死亡率不斷升高。因此,綜合比較可知,較好的消毒劑為0.1% HgCl2,較好的消毒時間為8~10 min。

    2.2 不定芽的誘導條件選擇

    將頂芽分化獲得的不定芽進行快速繁殖培養(yǎng),外植體接種到MS、B5、N6培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度為23~26 ℃、光照度為1 400~2 000 lx、光照時間為10~12 h/d的條件下培養(yǎng)15 d,側(cè)芽分化后獲得不定芽。B5培養(yǎng)基中側(cè)芽分化成愈傷褐化,N6培養(yǎng)基中側(cè)芽分化慢,系數(shù)低;MS培養(yǎng)基中含0.1~0.4 mg/L KT、1.0~2.0 mg/L 6-BA、1.0~2.0 mg/L NAA、20~30 g/L蔗糖和3.8~4.8 g/L瓊脂,培養(yǎng)基的pH值為58。觀察發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度的增加,大苞水竹葉不定芽數(shù)均增加。由表4可以看出,最優(yōu)組合是A3B2C1,即在培養(yǎng)基中添加0.4 mg/L KT、1.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的不定芽繁殖效果最好,平均分化出11個不定芽。組培苗誘導的各個階段效果見圖1。

    2.3 不定芽壯苗條件選擇

    將“2.2” 節(jié)中得到的試管苗不定芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度23~26 ℃、光照度1 400~2 000 lx、光照時間10~12 h/d的條件下培養(yǎng)40 d,得到健壯植株,其中MS壯苗培養(yǎng)基中含0.5~1.5 mg/L 6-BA、0.2~0.6 mg/L IAA、20~30 g/L蔗糖和3.8~4.8 g/L瓊脂,培養(yǎng)基的pH值為5.8,觀察發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.6 mg/L IAA時壯苗效果最好,株高達到5.37 cm(表5)。

    2.4 健壯植株生根培養(yǎng)條件選擇

    將得到的健壯植株置于生根培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)溫度23~26 ℃、光照度1 400~2 000 lx、光照時間10~12 h/d的條件下培養(yǎng)40 d,得到帶根的完整植株,其中MS生根培養(yǎng)基中含0.5~1.5 mg/L IAA、1.0~2.0 mg/L IBA、25~30 g/L蔗糖和3.8~4.8 g/L瓊脂,培養(yǎng)基的pH值為5.8。觀察發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基中IAA濃度增加,組培苗的生根率也提高;培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L IBA和1.0 mg/L IAA的生根效果最好,生根率達93.1%,平均根長達到4.49 cm(表6)。

    2.5 試管苗移栽條件

    經(jīng)生根培養(yǎng)后的大苞水竹葉,挑選生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗移入常溫室內(nèi)放置,擰松蓋子,2 d后掀開蓋子讓大苞水竹葉幼苗與空氣完全接觸,其間需向瓶內(nèi)的植株灑水以保持瓶內(nèi)的水分充足。3 d后從瓶內(nèi)取出幼苗,洗凈根部的培養(yǎng)基,移栽于消過毒的泥炭、泥炭+蛭石(體積比3 ∶1)、泥炭+黃沙(體積比3 ∶1)3種不同基質(zhì)上,適度遮陰,并保持一定的濕度。30 d后統(tǒng)計生根率和生長率。由表7可以看出,不同基質(zhì)成活率的高低順序為泥炭+黃沙(體積比3 ∶1)>泥炭+蛭石(體積比3 ∶1)>泥炭。因此,試管苗移栽最好的基質(zhì)為泥炭+黃沙(體積比3 ∶1),移栽30 d成活率為84%。

    3 討論

    鴨跖草科植物均為草本,主要分布于熱帶,少數(shù)種產(chǎn)于亞熱帶、溫帶地區(qū),中國產(chǎn)13屬49種,多分布于長江以南各?。▍^(qū)),尤以西南地區(qū)為盛。目前對鴨跖草科植物的研究開展的較少,僅有關(guān)于其生物學特性[1-2]、分布與分類[3]、種植栽培、病蟲害[4]、化學成分[5-7]、藥理作用的報道[8],未見有關(guān)組培的報道。本研究采用大苞水竹葉側(cè)芽為外植體,以芽繁芽,未經(jīng)過愈傷組織階段,對側(cè)芽分化及植株再生方法進行探討,建立了大苞水竹葉的離體再生體系,有利于保持大苞水竹葉的遺傳穩(wěn)定性,不但滿足了工廠化生產(chǎn)的需求,還具有實際意義。

    植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì),能以極微小的量影響植物的細胞分化、分裂和發(fā)育,在植物離體培養(yǎng)中起重要調(diào)節(jié)作用[9]。當細胞分裂素/生長素的比值合適時,能誘導芽的形成和促進芽的生長。6-BA是重要的細胞分裂素,能促進細胞分裂、非分化組織分化、側(cè)芽生長等;NAA是植物生長調(diào)節(jié)劑,具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用;IAA是植物生長素,能促進細胞分裂與細胞生長,誘導形成不定根[10-11]。多種激素組合能更有效地促進植物的生長,因此在MS培養(yǎng)基中加入6-BA、IAA配合使用,對大苞水竹葉生長均具有較大的影響。本研究得出,大苞水竹葉增殖的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA,在此培養(yǎng)基上增值率為6.5且芽苗翠綠粗壯。試驗中不定芽生根率達93.1%,移栽成活率為98%,生產(chǎn)出的種苗,既可滿足人們對大苞水竹葉的用途需求,又可保護珍稀瀕危種質(zhì)資源,同時還為豐富我國園林植物種類提供保障。本研究為著名壯藥植物大苞水竹葉的保護和可持續(xù)開發(fā)利用開辟了一條新的途徑,同時可為同屬其他物種的組織培養(yǎng)研究提供借鑒。

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