宗地花豬GDF9基因多態(tài)性與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析

林鵬飛+任麗群+李平+顧麗菊+吳光松+燕志宏+張蕓

摘要：為驗證GDF9基因SNP位點與宗地花豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，從而為提高宗地花豬繁殖性能提供有價值的分子輔助標(biāo)記，推進選育進程進行試驗。以貴州宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬為試驗素材，利用DNA池和DNA直接測序方法檢測GDF9基因的多態(tài)性，對各突變位點不同基因型個體與總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬平均初生質(zhì)量和母豬泌乳力性狀進行關(guān)聯(lián)性分析。在受試群體中，發(fā)現(xiàn)基因GDF9有2個突變位點，C1009T和T1014C均位于exon2；且都與經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)差異顯著（P<0.05）；基因型分別為BB>AB>AA、DD>CD>CC，母豬泌乳力基因型個體之間差異不顯著（P>0.05）。仔豬平均初生質(zhì)量的基因型表現(xiàn)為BB>AB>AA、DD>CD>CC，差異顯著（P<0.05）；母豬總產(chǎn)仔數(shù)DD基因型多于DC與CC基因型，DD基因型為優(yōu)勢基因型，D為優(yōu)勢等位基因；BB基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的繁殖性狀中多于基因型AB、AA，BB為優(yōu)勢基因型，B為優(yōu)勢等位基因。因此，研究結(jié)果表明推測等位基因D和等位基因B可能為宗地花豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的有利等位基因，且DD基因型和BB基因型為有利基因型。

關(guān)鍵詞：宗地花豬；GDF9基因；SNP位點；繁殖性狀；關(guān)聯(lián)性分析

中圖分類號： S828.3 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0224-04

收稿日期：2017-07-10

基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)動植物育種專項資金（編號：黔農(nóng)育專字[2016]009號）。

作者簡介：林鵬飛（1991—），男，山東乳山人，碩士研究生，研究方向為動物種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：1124800190@qq.com。

通信作者：燕志宏，教授，研究方向為動物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：yzh611127@sina.com。 生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族中的成員。卵母細胞是GDF9的最初來源，在大部分動物中，僅在動物卵巢的卵母細胞中檢測到GDF9 mRNA和蛋白質(zhì)[1-4]。在一些靈長類動物中，GDF9 mRNA和蛋白質(zhì)在卵母細胞及其鄰近的顆粒細胞中也有發(fā)現(xiàn)[5]。但研究發(fā)現(xiàn)GDF9可通過自分泌和旁分泌的方式，參與調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和衰退，進而對優(yōu)勢卵泡的選擇及閉鎖卵泡的形成產(chǎn)生影響[6]。GDF9特殊性在于GDF9僅有6個Cys，而一般的TGF-β家族成員具有7個或者9個[7]，GDF9基因位于常染色體上，人的GDF9基因在5號常染色體上，而豬的GDF9基因則定位于2號染色體上[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)在羊的原始卵泡中有GDF9基因的mRNA表達，一旦原始卵泡的卵母細胞產(chǎn)生GDF9，卵泡就開始發(fā)育[10]。Li等通過觀察豬卵母細胞不同時間GDF9基因的表達時發(fā)現(xiàn)，GDF9在不成熟的卵母細胞中高度表達，在成熟的卵母細胞中逐漸減少[11]。于佐卿等以陶灘寒雜種羊和德灘寒雜種羊為研究對象，發(fā)現(xiàn)GDF9基因多態(tài)性對羊羔初生質(zhì)量無顯著影響[12]。由此可推測，GDF9基因?qū)游锏纳彻δ芫哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用。

宗地花豬是貴州省優(yōu)良地方豬種之一，皮厚而糯、肉嫩味香，為人們所喜愛。但飼養(yǎng)周期長、產(chǎn)仔數(shù)少、生產(chǎn)效率低、成本高、養(yǎng)殖投入高、收益低等原因使得宗地花豬養(yǎng)殖群體規(guī)模發(fā)展緩慢。針對宗地花豬的保種選育，相關(guān)機構(gòu)和學(xué)者做了很多研究，推進了宗地花豬的開發(fā)利用。馮文豪等對宗地花豬的胴體肉質(zhì)性狀進行測定，結(jié)果顯示雖然宗地花豬瘦肉率明顯低于大白豬，但是肉質(zhì)性狀優(yōu)于大白豬[13]。隨后，張蕓等分別研究了不同飼養(yǎng)方式對宗地花豬的胴體和肉質(zhì)性狀影響和不同飼養(yǎng)方式下宗地花豬肌肉營養(yǎng)成分及品質(zhì)的影響[14]。燕志宏等研究宗地花豬1世代的生長發(fā)育情況，隨后在2011年研究了宗地花豬及其與長白豬和大白豬的雜種一代豬哺乳期和保育期的生長性能[15]。毛同輝等對對產(chǎn)區(qū)保種選育基礎(chǔ)群進行了繁殖性能測定，隨后開始對宗地花豬繁殖性能進行了研究[16]。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，燕志宏等[17-20]、魏小紅等[21]、李平等[22]、顧麗菊等[23]、任麗群等[24]和閆雷等[25]分別對影響宗地花豬肉質(zhì)和繁殖性狀的一些相關(guān)基因進行了研究，取得了一定的研究成果。本試驗旨在驗證GDF9基因SNP位點與宗地花豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析，從而為提高宗地花豬繁殖性能提供有價值的分子輔助標(biāo)記，推進選育進程進行試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗動物樣本

66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬來自貴州紫薇畜牧業(yè)開發(fā)有限公司宗地花豬飼養(yǎng)場，各頭母豬均健康，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境和管理條件下進行飼養(yǎng)，用耳缺鉗采取每頭母豬耳根邊緣耳組織，放入裝有濃度為70%乙醇的1.5 mL離心管中，冰盒帶回實驗室，于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、 DL2000 DNA Marker、 2×Taq Master Mix 、瓊脂糖等均來自上海生工生物工程有限公司；去離子水、 無水乙醇、TAE緩沖液等試劑為實驗室自備。PCR擴增儀（PTC200，美國Bio-rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（BioSens SC 710，美國Bio-rad公司），微量移液器（ACURA825，SOCOREX公司）。

1.3 DNA提取

用基因組DNA提取試劑盒提取母豬耳根邊緣耳組織DNA，含有核酸染料1%瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測純度，并用紫外分光光度計測量每個樣品DNA濃度3次，取其平均值，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及PCR擴增

參照 NCBI（登錄號為NC-010444.1）提供的豬GDF9基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件結(jié)合Oligo 6.0軟件設(shè)計引物（表1），應(yīng)用NCBI Blast軟件檢測所設(shè)計引物的特異性。引物送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。endprint

1.5 統(tǒng)計分析

經(jīng)檢測濃度及純度后，為使樣品DNA濃度接近，稀釋至相同濃度后，抽取5 μL充分振蕩混勻構(gòu)建貴州宗地花豬品種DNA池。將所構(gòu)建的宗地花豬DNA池作為模板，根據(jù)20 μL PCR反應(yīng)體系和擴增條件進行擴增，擴增產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后直接將產(chǎn)物送往北京諾賽基因公司進行雙向測序。根據(jù)DNA池篩選各基因的SNPs位點，選擇具有多態(tài)位點的片段，利用DNAStar等軟件分析測序結(jié)果，篩選SNPs位點，分析不同位點在受試群體中的基因型頻率和遺傳特異性，并進行哈迪-溫伯格平衡檢測；根據(jù)最小二乘線性模型，分析不同基因型與樣本母豬繁殖性能（在相同飼養(yǎng)條件下，測定記錄健康狀況良好的經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩質(zhì)量和20日齡窩質(zhì)量以計算經(jīng)產(chǎn)母豬泌乳力）的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

根據(jù)全基因組DNA提取試劑盒提取豬的全基因組DNA，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的全基因組DNA。由圖1可知，條帶明亮清晰、整齊無拖尾，可直接用于接下來的試驗。

2.2 PCR擴增

對66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均顯示為1條特異性條帶，其片段長度P1、P2分別為533、910 bp，與預(yù)期目標(biāo)片段相符，條帶清晰、整齊無拖尾（圖2），可用于測序。

2.3 GDF9基因DNA池PCR測序結(jié)果與測序結(jié)果分析

將所得PCR產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化切膠回收測序，對所得序列運用SeqMan和BioXM等軟件進行分析比對，在GDF9基因發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點，分別在1 009 bp與1 014 bp處，均位于第2外顯子上（圖3）。

運用SeqMan軟件對所有樣品的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，第2外顯子C1009T位點處發(fā)生堿基突變，發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB和BB基因型。T1014C位點處發(fā)生堿基突變，發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為CC、CD和DD基因型，有2個等位基因C和D。通過序列對比發(fā)現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA和CC基因型個體序列與GenBank上所提交的豬的基因序列一致，定義為野生型，BB型和DD型則定義為突變型，AB基因型和CD基因型定義為雜合型。

2.4 GDF9基因不同SNPs位點基因與基因型頻率

由表2可知，在宗地花豬母豬群中3種基因型頻率分布為AA>AB>BB，其基因型頻率分別為0.393 9、0.318 2和0.287 9。等位基因A和B的基因頻率分別為0.553 0和0447 0。由表3可知，在宗地花豬母豬群中3種基因型頻率分布為CC>CD>DD，其基因型頻率分別為0.378 8、0.348 5和0.2727，等位基因C和D的基因頻率分別為0.553 0和0447 0。

2.5 GDF9基因不同SNPs位點χ2檢驗及群體遺傳學(xué)參數(shù)

由表4可知，GDF9基因C1009T位點由χ2適應(yīng)性檢驗顯示，χ2<χ20.05（2）=5.99，說明該位點群體遺傳變異處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。該位點雜合度為0.494 4，多態(tài)信息含量PIC=0.3722，0.25

由表5可知，GDF9基因T1014C位點χ2適應(yīng)性檢驗顯示，χ2<χ20.05（2）=5.99，說明該位點群體遺傳變異處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。該位點雜合度為0.494 4，多態(tài)信息含量PIC=0.3834，0.25

2.6 GDF9基因不同SNPs位點關(guān)聯(lián)性分析

由表6可知，在宗地花豬母豬群中，總產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)為基因型BB>AB>AA，B為優(yōu)勢等位基因，BB基因型為優(yōu)勢基因型，總產(chǎn)仔數(shù)最高，方差分析顯示，其中BB基因型個體與AA基因型個體間差異極顯著（P<0.01），AB基因型個體與AA基因型個體差異顯著（P<0.05）；產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為基因型BB>AB>AA，BB產(chǎn)活仔數(shù)最高，方差分析顯示，BB基因型和AB基因型均顯著高于AA基因型（P<0.05）；仔豬平均初生質(zhì)量BB基因型最高，為優(yōu)勢基因型，BB基因型個體比AA基因型個體間平均初生質(zhì)量高80 g，差異顯著（P<0.05）；母豬泌乳力是基因型AA>BB>AB，3種基因型個體之間差異不顯著（P>0.05）。

由表7可知，在宗地花豬母豬群中，總產(chǎn)仔數(shù)純合子高于雜合子，表現(xiàn)為基因型DD>CD>CC，DD基因型為優(yōu)勢基因型，總產(chǎn)仔數(shù)最高，D為優(yōu)勢等位基因。方差分析顯示，其中DD、CD基因型個體與CC基因型個體差異均顯著（P<005），產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為基因型DD>CD>CC，DD產(chǎn)活仔數(shù)最高，DD基因型個體與CC、CD基因型個體差異均顯著（P<005）；仔豬平均初生質(zhì)量DD基因型最高，為優(yōu)勢基因型，DD基因型個體與CC基因型個體間平均初生質(zhì)量差異顯著（P<0.05），DD基因型比CC基因型高77 g；母豬泌乳力是基因型CC>DD>CD，3種基因型個體之間差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論

張璐等研究表明，遼寧黑豬和長白豬的產(chǎn)仔數(shù)在不同基因型之間差異顯著，而在大白豬、丹麥豬和杜洛克豬的不同基因型間差異不顯著（P>0.05）[26]。孟洪莉等研究了豬繁殖相關(guān)基因多態(tài)性及其關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，大白豬和長白豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)出AA>GG>AG的趨勢，其中長白經(jīng)產(chǎn)母豬的AA和GG型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于AG型（P<0.05）[27]。本研究結(jié)果表明：（1）在GDF9基因第2外顯子上發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點，分別是C1009T和T1014C。（2）綜合本試驗中的產(chǎn)仔數(shù)指標(biāo)，在C1009T和T1014C表現(xiàn)出顯著影響，說明GDF9基因?qū)ψ诘鼗ㄘi產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響（P<0.05）。GDF9基因在C1009T和T1014C位點的多態(tài)性均對宗地花豬的仔豬平均初生質(zhì)量有顯著影響。（3）母豬總產(chǎn)仔數(shù)DD基因型多于DC與CC基因型，DD基因型為優(yōu)勢基因型，D為優(yōu)勢等位基因；BB基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的繁殖性狀中多于基因型AB、AA，BB為優(yōu)勢基因型，B為優(yōu)勢等位基因。因此，研究結(jié)果表明推測等位基因D和等位基因B可能為宗地花豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的有利等位基因，且DD基因型和BB基因型為有利基因型。

參考文獻：

[1]Yoshida M，Cran D G，Pursel V G. Confocal and fluorescence microscopic study using lectins of the distribution of cortical granules during the maturation and fertilization of pig oocytes[J]. Molecular Reproduction and Development，1993，36（4）：462-468.

[2]Vitt U A，Hsueh A J. Stage-dependent role of growth differentiation factor-9 in ovarian follicle development[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2001，183（1/2）：171-177.

[3]Clelland E S，Kelly S P. Exogenous GDF9 but not Activin A，BMP15 or TGFβ alters tight junction protein transcript abundance in zebrafish ovarian follicles[J]. General and Comparative Endocrinology，2011，171（2）：211-217.

[4]彭中友，孫俊銘，李 燕，等. GDF9 和 FST調(diào)控豬卵母細胞成熟和胚胎早期發(fā)育[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（3）：583-589.

[5]Dey S R，Deb G K，Ha A N，et al. Coculturing denuded oocytes during the in vitro maturation of bovine cumulus oocyte complexes exerts a synergistic effect on embryo development[J]. Theriogenology，2012，77（6）：1064-1077.

[6]Elvin J A，Yan C，Matzuk M M. Oocyte-expressed TGF-β superfamily members in female fertility[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2000，159（1）：1-5.

[7]Incerti B，Dong J，Borsani G，et al. Sturcutre of the mouse growth/differentiation factor 9 gene[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1994，1222（1）：125-128.

[8]Sadighi M，Bodensteiner K J，Beattie A E，et al. Mapping of ovine growth differentiation factor-9（GDF9）to sheep chromosome 5[J]. Animal Genetics，2002，33（3）：244-245.

[9]Cepica S，Procházka R，Civánová K，et al. Partial molecular characterization and mapping of the GDF9 gene to porcine chromosome 2[J]. Animal Genetics，2004，35（3）：261-262.

[10]Solovyeva E V，Hayashi M，Margi K，et al. Growth differentiation factor-9 stimulates rat theca-interstitial cell androgen biosynthesis[J]. Biology of Reproduction，2000，63（4）：1214-1218.

[11]Li H K，Kuo T Y，Yang H S，et al. Differential gene expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 during in vitro maturation of porcine oocytes and early embryos[J]. Animal Reproduction Science，2008，103（3）：312-322.

[12]于佐卿，楊博輝，郭 健，等. 兩種綿羊雜種GDF9 基因和 FecB 基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)和體重關(guān)系的研究[J]. 中國草食動物，2008，28（2）：5-8.

[13]馮文豪，燕志宏，毛同輝. 貴州宗地花豬胴體肉質(zhì)性狀測定初報[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2008，32（2）：9-10.

[14]張 蕓，陳 偉，李 平，等. 不同飼養(yǎng)方式宗地花豬的胴體和肉質(zhì)性狀[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（9）：164-166.

[15]燕志宏，毛同輝，馮文豪. 宗地花豬ESR、FSHβ基因的多態(tài)性及其對繁殖性能的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：134-137.

[16]燕志宏，田松軍，申紅艷，等. 宗地花豬1世代的生長發(fā)育研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（24）：13107-13108.endprint

[17]燕志宏，田松軍，韋玉美. 貴州宗地花豬最佳屠宰體重的研究[J]. 豬業(yè)科學(xué)，2010，27（7）：102-104.

[18]宗秋芳，戴開宇，劉穎，等. 豬氨肽酶N（APN）基因密碼子偏好性分析[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2016，37（2）：45-50，73.

[19]楊開典，陳偶，齊傳翔，等. 豬STC-1 siRNA設(shè)計及其基因沉默效率檢測[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2017，38（1）：16-19.

[20]燕志宏，張 蕓，田松軍. 宗地花豬及其雜種1代豬哺乳期和保育期生長性能的研究初報[J]. 養(yǎng)豬，2011（3）：47-48.

[21]魏小紅，田松軍，燕志宏，等. 紫云縣宗地花豬發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2014，38（2）：25-27.

[22]李 平，燕志宏，陳 偉，等. 宗地花豬H-FABP基因mRNA的表達與肉質(zhì)性狀的相關(guān)研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：644-649.

[23]顧麗菊，任麗群，燕志宏，等. 宗地花豬和從江香豬ADRP基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（11）：2395-2401.

[24]任麗群，燕志宏，顧麗菊，等. 貴州宗地花豬的GDF9基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（11）：2402-2407.

[25]閆 雷，林家棟，燕志宏，等. 宗地花豬生長激素基因TaqⅠ多態(tài)性及其對屠宰性狀的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：170-172.

[26]張 璐. 豬BMP15、GDF9和FSHβ基因的遺傳多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[27]孟洪莉. 豬繁殖相關(guān)基因多態(tài)性檢測及其關(guān)聯(lián)分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012. 更正 茲有沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)郭偉等作者發(fā)表于《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》2017年第45卷第11期73-76頁的論文《施硅對稻田稗草光合及生理特性的影響》，由于失誤，原作者排序“楊顏熙，耿珍珍，郭 偉，李 晴，李亮亮”存在順序錯誤，其中“郭偉”應(yīng)為第一作者，正確作者排序為“郭 偉，楊顏熙，耿珍珍，李 晴，李亮亮”。特此更正，并向作者和讀者致歉。

《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》編輯部

2017年10月 丁立云，饒 毅，陳文靜，等. 投喂頻率對彭澤鯽幼魚生長性能、形體指標(biāo)和肌肉品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（19）：228-231.endprint