芐嘧磺隆降解菌的分離及生長(zhǎng)降解特性研究

陳 森，王 歡，陸 敏，韓麗珍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

芐嘧磺隆降解菌的分離及生長(zhǎng)降解特性研究

陳 森，王 歡，陸 敏，韓麗珍*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

芐嘧磺隆是一種磺酰脲類(lèi)除草劑，被廣泛應(yīng)用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草。在土壤中的持效期較長(zhǎng)，大量施用后易對(duì)后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，微生物降解是土壤中芐嘧磺隆轉(zhuǎn)化的主要方式。本研究從長(zhǎng)期施用該除草劑的稻田土壤中分離篩選到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，經(jīng)形態(tài)學(xué)及生理生化特征、16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。75B菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在pH 5.09.0、0.55.0% NaCl濃度下、培養(yǎng)溫度為2638℃的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。將該菌株按5%接種量置于pH 7.0、以芐嘧磺隆為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(2.0% NaCl濃度)中、34℃條件下培養(yǎng)，對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養(yǎng)至10 d時(shí)的降解率為97.65%。結(jié)果表明75B菌株可以有效地降解芐嘧磺隆，具有應(yīng)用于該除草劑污染環(huán)境修復(fù)的潛力。

芐嘧磺隆降解菌；肺炎克雷伯氏菌；生長(zhǎng)降解特性

芐嘧磺隆(Bensulfuron-methyl， BSM)是一種磺酰脲類(lèi)除草劑，可以抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase， ALS)的活性，導(dǎo)致植物支鏈氨基酸的合成受阻而起殺草作用[1]。由于其選擇性高，對(duì)禾本科植物無(wú)害，因而被廣泛應(yīng)用于稻田土壤中防除一年生和多年生闊葉雜草和莎草。芐嘧磺隆具有揮發(fā)性低、難以光降解，在堿性土壤中的持效期長(zhǎng)達(dá)100 d以上的特征[2]。大量應(yīng)用后不僅對(duì)后茬輪作作物有毒、損傷煙草和番茄等敏感作物，而且其殘留可通過(guò)滲濾增加鄰近水生環(huán)境污染的可能性[3]。研究已經(jīng)證明BSM對(duì)水生蕨類(lèi)和淡水藍(lán)藻有高度毒性[4]。較高濃度(3.553 mg/kg)BSM的處理可造成土壤微生物多樣性降低，嚴(yán)重抑制需氧性細(xì)菌、固氮菌、纖維素分解菌及氨化細(xì)菌的生長(zhǎng)，減少了土壤固氮過(guò)程和硝化作用的進(jìn)行[5]；還可導(dǎo)致Pseudomonasputida(惡臭假單胞菌)的急性毒性效應(yīng)[6]。然而，利用14C標(biāo)記技術(shù)對(duì)施加芐嘧磺隆的稻田土壤進(jìn)行降解研究，發(fā)現(xiàn)重復(fù)施用BSM的稻田土壤中礦化產(chǎn)生14CO2的速率更快，表明土壤細(xì)菌可以利用BSM為碳源和能源[7]；顯然，通過(guò)微生物酶系統(tǒng)發(fā)揮的微生物降解仍然是芐嘧磺隆在土壤中轉(zhuǎn)化的決定性機(jī)制[8]。但是，自2005年首次分離到可以降解芐嘧磺隆的Brevibacteriumsp. BH菌株后，近年來(lái)芐嘧磺隆的降解微生物報(bào)道仍較少。為了豐富芐嘧磺隆的降解菌株，本研究從長(zhǎng)期施用芐嘧磺隆除草劑的農(nóng)田土壤中，分離篩選到1株Klebsiellapneumoniae，并對(duì)其生長(zhǎng)降解特性進(jìn)行了研究，以期為芐嘧磺隆污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1土樣采集

采集土樣來(lái)自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)常年施用野老除草劑(含芐嘧磺隆 6%，乙草胺 16.7%)的稻田淹水土壤(北緯N26°26′18.23″，東經(jīng)E106°39′45.32″，海拔1 125.35 m)，土壤為黃壤、pH值6.0。

1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(minimal sodium medium， MSM)：NH4NO31.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO40.1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌 30 min。

LB培養(yǎng)基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌 30 min。

固體培養(yǎng)基均加入2.0%瓊脂。

1.3主要試劑及儀器

主要試劑：芐嘧磺隆標(biāo)品(Sigma-Aldrich， USA)，10%芐嘧磺隆原藥(安徽華星化工股份有限公司)，除乙腈和甲醇為色譜純外，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；分子生物學(xué)試劑Premix rTaq購(gòu)自TakaRa，Bacterial DNA Kit購(gòu)自O(shè)mega；主要儀器為T(mén)100 PCR儀(Bio-Rad， USA)，Chemi Doc XRS+凝膠成像儀(Bio-Rad， USA)，Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)(Waters， USA)。

引物合成及產(chǎn)物測(cè)序均由上海英駿生物工程有限公司完成。

1.4芐嘧磺隆降解菌的分離

稱(chēng)取土壤10.0 g加入100 mL含10 mg/L芐嘧磺隆的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)器中150 rpm振蕩培養(yǎng)，每隔10 d轉(zhuǎn)接一次，逐步提高培養(yǎng)基中的芐嘧磺隆濃度，連續(xù)馴化、富集培養(yǎng)6次，直至芐嘧磺隆濃度為250 mg/L。取最后一次富集培養(yǎng)液適量，稀釋后涂布培養(yǎng)于含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4 d左右，挑選生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行分離純化并保種。

1.5芐嘧磺隆降解菌株的鑒定

1.5.1降解菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 純化的單菌落接種到LB固體培養(yǎng)基中活化兩次后觀察菌落形態(tài)，挑取少量單菌落涂片進(jìn)行Gram染色后光學(xué)顯微鏡觀察。生理生化的鑒定依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[9]進(jìn)行。

1.5.2降解菌株的分子鑒定 利用Bacterial DNA Kit提取細(xì)菌DNA，以降解菌DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，有目的大小條帶者送出測(cè)序。測(cè)序獲得的16S r RNA基因序列使用BLAST進(jìn)行同源性比較，同時(shí)聯(lián)合EzTaxon-e服務(wù)器的模式種細(xì)菌菌株比對(duì)進(jìn)行分子鑒定。利用MEGA6.0中的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)。

1.6不同環(huán)境因素對(duì)芐嘧磺隆降解菌株生長(zhǎng)的影響

1.6.1降解菌株的生長(zhǎng)曲線 將活化菌液分別接種于LB培養(yǎng)基和含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)液起始OD600值為0.2左右，于30℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)量。

1.6.2培養(yǎng)基不同pH值對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 將活化菌液接種于60 mL含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，于30℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD600值。

1.6.3培養(yǎng)基中不同NaCl濃度對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 在含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養(yǎng)基中(原有NaCl濃度為0.5%)，分別添加NaCl使其鹽濃度分別為1.0、2.0和5.0%，接種菌液于30℃振蕩培養(yǎng)并測(cè)定OD600值。

1.6.4不同接種量對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 將活化的菌液調(diào)節(jié)OD600值為1.0，按1.0、5.0、7.0和10.0%的接種量分別轉(zhuǎn)接入含50 mg/L芐嘧磺隆的60 mL LB培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)并測(cè)定OD600值。

1.6.5不同裝液量對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響 分別取20、40和60 LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)裝入100 mL三角瓶中，接入菌液于30℃振蕩培養(yǎng)并測(cè)定OD600值。

1.6.6不同培養(yǎng)溫度對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響 將活化菌液轉(zhuǎn)接入60 mL LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，分別在26、30、34和38℃條件下振蕩培養(yǎng)并測(cè)定OD600值。以上每個(gè)處理均設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.7降解菌株在以芐嘧磺隆為唯一碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及降解

將活化菌液6000 rpm離心5 min后棄上清，菌體沉淀用MSM培養(yǎng)液洗滌2次后重懸。重懸菌液分別接種于含50、100和150 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基中，在最適生長(zhǎng)條件下置于恒溫?fù)u床中150 rpm振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD600值。每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。選擇菌體生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)液處理后，HPLC測(cè)定其中的芐嘧磺隆濃度并計(jì)算降解率。

培養(yǎng)液中芐嘧磺隆的提取及濃度測(cè)定參考李陽(yáng)陽(yáng)方法[10]，簡(jiǎn)而言之，取適量培養(yǎng)液加入3倍體積的二氯甲烷萃取、無(wú)水硫酸鈉吸去水分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后加入色譜級(jí)甲醇溶解、過(guò)濾后利用HPLC測(cè)定培養(yǎng)液中的芐嘧磺隆含量。HPLC測(cè)定的色譜柱為AsilentTC-C18柱，以甲醇為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.8數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010和SPSS19.0軟件，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1芐嘧磺隆降解菌株的分離與鑒定

利用長(zhǎng)期使用野老除草劑的稻田土壤為材料，通過(guò)逐步提高培養(yǎng)基中芐嘧磺隆濃度的方法，經(jīng)近兩個(gè)月的馴化及富集培養(yǎng)，最終分離純化獲得1個(gè)細(xì)菌菌株，該菌株在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養(yǎng)基平板上生良好，命名為75B。

降解菌株75B在LB固體平板上培養(yǎng)24 h后，呈現(xiàn)出半透明、光滑、隆起的乳白色光澤感菌落；鏡檢為G-的桿狀細(xì)菌(圖1)。生理生化測(cè)試表明，該菌株M.R試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、氧化酶及過(guò)氧化氫酶陰性；苯丙氨酸水解、淀粉水解、酪素水解陰性；硝酸鹽還原、纖維素分解、丙酸鹽利用陽(yáng)性；有莢膜；可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、核糖醇，不能利用山梨糖和5-酮基-D-葡萄糖酸。

利用16S rRNA基因擴(kuò)增的通用引物，以75B菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示擴(kuò)增到1.5 kb大小目的條帶。測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)BLAST及EzTaxon-e服務(wù)器鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，表明75B菌株的16S rRNA基因與Klebsiellavariicola及Klebsiellapneumoniae同源性極高，分子鑒定為Klebsiellasp.。

結(jié)合生理生化測(cè)定及分子生物學(xué)方法，最終將芐嘧磺隆降解菌75B鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。

圖1 芐嘧磺隆降解菌75B的菌落和鏡下Gram染色圖譜Fig.1 Colony and Cell Gram staining of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2芐嘧磺隆降解菌株75B在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)

2.2.1降解菌株75B在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線 當(dāng)把降解菌株75B接種入LB、含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示出相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)；另外，在LB培養(yǎng)基中加入50 mg/L芐嘧磺隆后，降解菌株75B的生長(zhǎng)稍稍有所滯后，表明芐嘧磺隆的加入對(duì)于芐嘧磺隆降解菌株仍然存在略微的影響，這主要表現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率有所降低。但是，當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期(24 h)，在兩種培養(yǎng)基中的菌體生長(zhǎng)量(OD600值)并未有顯著差別(p0.05)(圖3)，降解菌株可以快速適應(yīng)芐嘧磺隆的存在。

圖2 芐嘧磺隆降解菌75B的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tress on 16S rRNA gene of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

圖3 芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2.2培養(yǎng)基不同pH值及NaCl濃度對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 在不同pH值的LB培養(yǎng)基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，降解菌株75B的菌體生長(zhǎng)量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期存在差異，pH 7.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率最快(p0.05)，最適pH值為7.0。進(jìn)入穩(wěn)定期后期，pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響下降，該菌株在pH 5.09.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，表明75B對(duì)環(huán)境pH值有較強(qiáng)的適應(yīng)能力(圖4)。

2.2.3不同接種量及裝液量對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 設(shè)置4個(gè)不同接種量接種菌液，結(jié)果表明，在接種量為1%時(shí)，75B菌株的菌體生長(zhǎng)量低于其余3個(gè)處理，而當(dāng)接種量為5.0～10.0%范圍內(nèi)時(shí)，菌體OD600值并無(wú)顯著差異(p<0.05)。 因而，適當(dāng)加大接種量可使菌體縮短適應(yīng)期而進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，但接種量與菌體生長(zhǎng)量之間并不呈完全對(duì)應(yīng)增長(zhǎng)趨勢(shì)，降解菌株75B的最適接種量為5.0%。而在3個(gè)不同的裝液體積下，菌體生長(zhǎng)量并無(wú)明顯差異(圖5)。

注：上圖為不同pH值，下圖為不同NaCl濃度，*代表差異顯著(p0.05)

圖4 培養(yǎng)基不同pH值及NaCl濃度對(duì)芐嘧磺隆降解菌株75B生長(zhǎng)的影響
Fig.4 Growth Effects on different pH and NaCl concentration of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

2.2.4不同培養(yǎng)溫度對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 溫度通常對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響較大。在4個(gè)不同的溫度條件下培養(yǎng)75B菌株，34℃條件下的菌體生長(zhǎng)量略高；除在培養(yǎng)初期(12 h)，測(cè)試的最低溫度(26℃)及最高溫度(38℃)下菌體OD600值略低于其余處理外；總體上，在26～38℃溫度范圍內(nèi)，芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)良好，菌株可以耐受較廣的溫度范圍。

注：上圖為不同接種量，下圖為不同裝液量，*代表差異顯著(p0.05)

圖5 接種量及裝液量對(duì)芐嘧磺隆降解菌株75B生長(zhǎng)的影響
Fig.5 Growth Effects on different inoculum size and medium volume of Bensulfuron-methyl degrading strain 75B

圖6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)芐嘧磺隆降解菌75B生長(zhǎng)的影響Fig.6 Growth Effects on different temperature of Bensulfuron-methyl degrading strain75B

2.3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長(zhǎng)及降解

將活化的75B菌株培養(yǎng)液以5%接種量、轉(zhuǎn)接入以芐嘧磺隆為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH 7.0，含2.0% NaCl)中，34℃搖床振蕩培養(yǎng)監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)量。結(jié)果表明，菌體在150 mg/L芐嘧磺隆的培養(yǎng)基中基本無(wú)生長(zhǎng)；而50 mg/L和100 mg/L濃度下菌體的延滯期達(dá)3 d左右，之后OD600值開(kāi)始逐漸呈上升趨勢(shì)。在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基中，75B菌株的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于另兩組處理(p0.05)(圖7)。收集該濃度下的菌體培養(yǎng)液，經(jīng)萃取、蒸干后進(jìn)行HPLC測(cè)定，顯示75B菌株對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養(yǎng)至10 d時(shí)的降解率高達(dá)97.65%(圖8)。

注：*代表差異顯著(p0.05)

圖7 降解菌株75B在以不同濃度芐嘧磺隆為唯一碳源MSM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)
Fig.7 Growth on MSM containing different concentration Bensulfuron-methyl of strain 75B

圖8 芐嘧磺隆降解菌株75B對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的降解能力Fig.8 Degrading capability on 50 mg/L Bensulfuron-methyl of strain 75B

3 結(jié) 論

芐嘧磺隆是20世紀(jì)80年代中期開(kāi)發(fā)的一種新型磺酰脲類(lèi)除草劑，是我國(guó)水稻田中使用面積廣、時(shí)間長(zhǎng)、用量大的除草劑之一。由于其在土壤中的持效期較長(zhǎng)，大量施用后會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定危害。本研究采集長(zhǎng)期施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%)的稻田土壤，經(jīng)富集、馴化后分離到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，形態(tài)學(xué)、生理生化研究及分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示該菌株為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)，該菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，生長(zhǎng)在pH 7.0、含50 mg/L芐嘧磺隆的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(2.0%NaCl)中，34℃條件下培養(yǎng)10 d，對(duì)芐嘧磺隆的降解率可達(dá)97.65%。

Zhu等在2005年首次報(bào)道可降解芐嘧磺隆的短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)BH菌株，在2535℃條件下、pH7.07.5時(shí)，培養(yǎng)7 d對(duì)100 mg/L BSM的降解率為29.4%[11]。張松柏等從農(nóng)藥廠工業(yè)廢水和污泥中富集分離到光合細(xì)菌PSB07-6，鑒定為Rhodopseudomonaspalustris(沼澤紅假單胞菌)，在pH6.5的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中30℃條件下培養(yǎng)5 d后，對(duì)350 mg/L芐嘧磺隆的降解率為25.03%[12]。Lin等分離到BacillusmegateriumL1菌株，培養(yǎng)84 h對(duì)50 mg/L BSM的降解率為12.8%[13]。Xiong等篩選到的Rhodococcussp. BX2菌株對(duì)20 mg/L BSM的7d降解率為92%[14]。除此外，彭星星等分離篩選到的芐嘧磺隆降解真菌Aspergillussp. BP-H-01菌株，最適pH 7.5、28℃條件下對(duì)25 mg/L BSM的2 d降解率為84.5%[15]。Peng等分離到Penicilliumpinophilum(嗜松青霉) BP-H-02菌株，在30℃條件下置于pH 6.5的培養(yǎng)基中，對(duì)50 mg/L BSM的60 h降解率為87%[16]。以上報(bào)道的芐嘧磺隆降解菌株最適pH值均為中性或酸性條件。Sabadie等的研究表明BSM在土壤中主要經(jīng)化學(xué)水解和生物學(xué)降解進(jìn)行，其化學(xué)水解是pH依賴(lài)性的、在酸性或中性條件下(pH8.0)可通過(guò)脲橋斷裂水解形成穩(wěn)定的嘧啶胺和苯甲磺酰氨[17]。本研究獲得的Klebsiellapneumoniae75B菌株在堿性條件下(pH 7.09.0)生長(zhǎng)良好，更有利于堿性土壤中生物降解的進(jìn)行。另外，該菌株的溫度適應(yīng)范圍(2638℃)更廣、對(duì)50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率可達(dá)74.11%，培養(yǎng)至10 d時(shí)幾乎可完全降解，是一株降解效果優(yōu)良的菌株，對(duì)于該菌株的進(jìn)一步研究可為其用于污染土壤的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

Klebsiella屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，在環(huán)境中廣泛存在，其分離株或具有內(nèi)生性固氮作用、或者是條件性致病菌[18]。Klebsiellapneumoniae是可定殖和感染多種動(dòng)植物的克雷伯氏菌屬成員[19]。早期的研究表明該菌為條件性致病菌，可致人肺炎及奶牛乳腺炎[20]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Klebsiellapneumoniae分離株具有代謝多樣性，占據(jù)了不同類(lèi)型的環(huán)境生態(tài)位；菌種的不同分離株也表現(xiàn)出遺傳和表型的多樣性[21]。多位研究者發(fā)現(xiàn)在玉米或水稻中有該種微生物內(nèi)生定殖并具有固氮活性[22]，而且玉米分離株較臨床分離株的毒力更低[23]。Klebsiellapneumoniae不同地區(qū)分離株還被報(bào)道具有降解石油、降解苯并芘和芘，可利用單寧酸[24]等多種能力。本研究中分離到的Klebsiellapneumoniae菌株被首次發(fā)現(xiàn)還具有降解芐嘧磺隆的能力，也充分表明了該種微生物具有一定的環(huán)境生物修復(fù)潛能。

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Isolation，GrowthandDegradationCharacteristicsofBensulfuron-methylDegradingStrain

CHENSen，WANGHuan，LUMin，HANLi-zhen*

(CollegeofLifeSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

Bensulfuron-methyl(BSM) is a kind of sulfonylurea herbicide and widely used to control broad-leaf weeds in paddy fields. Over-utilization can have negative impact on damaging sensitive succeeding crops because of BSM’s long persistence. Microbial degradation was considered to be the main mechanisms of reducing bensulfuron-methyl herbicide in soil. In this study， A BSM-degrading bacterium， strain 75B， was isolated from paddy soil used this herbicide several years. It was identified asKlebsiellapneumoniaebased on its morphological， physiological， biochemical properties， and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences. Strain 75B grew well at pH 5.0 to 9.0， 0.5% to 5.0% NaCl concentration and temperature range from 26℃ to 38℃. Under optimal conditions (5% inoculum size， pH 7.0 minimal salt medium containing 2.0% NaCl concentration， culture temperature 34℃)， 74.11% of the initially added BSM (50 mg/L) was degraded after 5 days and almost complete degradation (97.65%) could be achieved after 10 days. These results revealed that 75B can biodegrade bensulfuron-methyl efficiently and could potentially be used to bioremediate sulphonylurea herbicides contamination.

Bensulfuron-methyl degrading bacteria；Klebsiellapneumoniae； growth and degrading characteristics

2017-06-28；

2017-09-19

貴州省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2014]2065號(hào))。

*

韓麗珍(1972-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：環(huán)境微生物及微生物生態(tài)學(xué)；E-mail： hanlizhen11@163.com。

Q939.9

A

1008-0457(2017)05-0046-07國(guó)際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.008