紫斑谷螟豹皮樟蟲茶小鼠急性毒性和骨髓紅細胞微核試驗研究

王 芳，陳 松，劉仁普，楊茂發(fā)

(貴州大學昆蟲研究所/貴州山地農業(yè)病蟲害重點試驗室，貴州 貴陽 550025)

紫斑谷螟豹皮樟蟲茶小鼠急性毒性和骨髓紅細胞微核試驗研究

王 芳，陳 松，劉仁普，楊茂發(fā)*

(貴州大學昆蟲研究所/貴州山地農業(yè)病蟲害重點試驗室，貴州 貴陽 550025)

用小鼠最大耐受量法、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗等方法，究紫斑谷螟豹皮樟蟲茶對小鼠的急性毒性和致突變性作用。結果顯示，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的小鼠急性經口LD50>30 g/kg·bw，小鼠骨髓紅細胞微核試驗結果為陰性。結果表明，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶屬無毒物，對小鼠體細胞無致突變性。

急性毒性；微核試驗；致突變作用；小鼠

蟲茶被譽為“茶中奇珍”，是一種絕佳的醫(yī)藥保健飲品，由特定種類昆蟲取食相應的特定寄主植物后所產排泄物精制而成[1-4]。據《本草綱目》記載，蟲茶具有清熱、解毒、健脾胃、祛暑、助消化等功效，對腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種重要的清涼飲料[4]。據報道[5～7]，我國民間用來生產蟲茶的昆蟲種類主要有7種：即米縞螟(Aglossadimidiata)、化香夜蛾(Hydrillodesmorosa)、白條谷螟(Fujimaciabicoloralis)、黃條谷螟(Herculiaglaucinalis)、弓須夜蛾(Hhdrillodesrepugnalis)、雪疽夜蛾(Nodarianiphona)、紫斑谷螟(Pyralisfarinalis)等。寄主植物包括三葉海棠(Malussieboldii)、化香樹(Platycaryastrebilacea)、苦藤茶(Sageretiathea)、苦丁茶(Rubushenryi)和豹皮樟(Litseacoreana)等。其中取食三葉海棠、苦藤茶和苦丁茶的多是米縞螟、白條谷螟和黃條谷螟(灰直紋螟)，取食化香樹葉的則是化香夜蛾、弓須夜蛾和雪疽夜蛾，取食豹皮樟的有米縞螟和紫斑谷螟。

不同昆蟲種類取食同種寄主植物，或者同種昆蟲取食不同的寄主植物所產的蟲茶，其顆粒的大小、色澤會有所不同，營養(yǎng)成分、功效以及利用角度也有較大的差異[8]。紫斑谷螟(PyralisfarinalisLinnaeus)，屬鱗翅目 (Lepidoptera)螟蛾科 (Pyralidae)螟蛾屬(PyralisLinnaeus)，是貴州地區(qū)用以生產蟲茶的主要昆蟲種類之一[7]。紫斑谷螟幼蟲取食豹皮樟(Litseacoreana)所產的排泄物經系列加工后即為紫斑谷螟-豹皮樟蟲茶(下稱“紫樟蟲茶”，PLIT)。目前尚無針對紫斑谷螟豹皮樟蟲茶安全性毒理學方面的研究報道。本文將選用急性毒性試驗和小鼠骨髓微核試驗研究其急性毒性和體內致突變性，以期為紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的安全性毒理學評價提供參考依據。

1 試驗材料

1.1受試物

紫斑谷螟豹皮樟蟲茶溶液制備：紫斑谷螟豹皮樟蟲取自貴州大學昆蟲研究所蟲茶飼養(yǎng)室；將紫斑谷螟自初孵幼蟲起便以貴州赤水樟樟科植物豹皮樟(Listseacoreana)葉進行飼養(yǎng)，收集到的蟲茶經網篩去除雜質粉塵，再依次進行紫外線殺菌15 min，再經50℃恒溫干燥箱烘至恒重備用。根據《受試物試驗前處理方法(GB15193.21-2014)》[9]，獲得的紫斑谷螟豹皮樟蟲茶采用常壓、溫度80～90℃，十倍的蒸餾水的浸泡30 min提取，重復兩次，合并浸泡液150目網篩濾除茶渣，將提取液減壓濃縮、干燥至干粉狀，室溫儲藏備用，每1 g濃縮干粉狀樣品相當于紫斑谷螟原來生藥樣品5 g的量。使用時，將濃縮后的受試物樣品以80～90℃蒸餾水沖泡溶解制得飽和溶液，然后稀釋至所需濃度。

1.2試劑

Giemsa染液：稱取Giemsa 染料3.8 g，加入375 mL甲醇研磨，待完全溶解后，再加入125 mL 甘油。置37℃恒溫箱保溫48 h，期間搖蕩數次，取出過濾，兩周后可用。Giemsa 應用液：取一份Giemsa 染液與6份磷酸緩沖液混合而成，現用現配。環(huán)磷酰胺購于浙江天杭生物科技有限公司，含量97.0～103.0%(HPLC)，分子量279.10，規(guī)格1 g，批號302A037，CAS6055-19-2；新生胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司，規(guī)格100 mL，批號20160328。

1.3儀器

解剖器械、生物顯微鏡、載玻片、注射器、計數器等。

1.4試驗動物

根據《試驗動物 環(huán)境及設施(GB 14925-2010)》[10]國家標準中相關規(guī)定，試驗動物選用SPF級KM小鼠和SPF級SD大鼠，購自解放軍第三軍醫(yī)大學試驗動物中心，試驗動物使用許可證號SCXK(渝)2012-2003。試驗環(huán)境即飼養(yǎng)地點選擇貴州大學貴州省生化工程中心SPF級動物試驗室，動物飼養(yǎng)許可證號SYXK(黔)2013-00001。動物房為無菌隔離屏障環(huán)境，室內溫度控制在23±2℃，濕度60±5%。

2 試驗方法

2.1急性經口毒性試驗

鑒于受試物特點，根據急性經口毒性試驗國家標準(GB15193.3-2014)[11]本次試驗采用限量法，測定皮樟蟲茶對小鼠的急性毒性作用。試驗選用20只體重在18～22 g的KM小鼠，雌雄各10只，雌雄分開飼養(yǎng)，每籠5只，用品紅染色編號標記，試驗前在SPF級動物飼養(yǎng)房觀察適應5 d，試驗期間自由飲水和食物。灌胃前禁食4 h，自由飲水，給予受試物后繼續(xù)禁食1～2 h；采用30 g/kg·bw劑量一次性經口灌胃，灌胃后連續(xù)觀察兩周，參照標準記錄小鼠各系統(tǒng)中毒指標，試驗末期進行解剖檢查，若大體解剖有異常病理改變則應做進一步的病理組織學觀察。觀察期每周記錄體重一次。按照標準判定結果。

2.2小鼠骨髓紅細胞微核試驗

根據國家標準(GB15193.3-2014)[12]取SPF級健康KM小鼠50只，每組10只(雌雄各半)，體重在25～35 g，雌雄隨機分籠飼養(yǎng)，每籠5只；小鼠隨機分為5組，即按10、5和2.5 g/kg·bw灌服紫斑谷螟豹皮樟蟲茶的高、中、低三個劑量組，腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg·bw)的陽性對照組，灌服等體積蒸餾水的陰性對照組。試驗采用30 h灌胃法，即兩次給予受試物，期間間隔24 h，末次給予后6 h采集骨髓1次，試驗末期頸椎脫臼處死動物，取大腿股骨，參照國家標準制作小鼠骨髓涂片，經甲醇中固定，Giemsa和吖啶橙染色油鏡鏡檢嗜多染紅細胞，計數嗜多染紅細胞(PCE)和正染紅細胞(NCE)在總細胞中的比例，觀察嗜多染紅細胞，計數有微核(MNPCE)的嗜多染紅細胞頻率，以千分率表示。

2.5數據處理

試驗數據用SPASS20.0軟件進行處理，以Mean±S表示，急性經口毒性試驗體重數據采用均值分析；紅細胞骨髓細胞微核試驗微核率和P/N比值采用雙側T檢驗[13]。

3 試驗結果

3.1急性經口毒性試驗

選用最大可使用劑量(30 g/kg·bw)給20只SPF級小鼠(雌雄各半)一次性經口灌胃后，14 d內未見小鼠死亡，說明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶對小鼠LD50大于30 g/kg·bw。試驗期內小鼠瞳孔、皮膚、毛色、采食、飲水、糞便和行為等均未見異常；未觀察到震顫、驚厥、流涎、呆滯、嗜睡、昏迷等異常狀況；試驗末期頸椎脫臼處死小鼠，大體解剖檢查所見小鼠心、肝、脾、肺、胃和腎等主要內臟結構以及生殖系統(tǒng)未發(fā)現顏色、形態(tài)異常，未見血點或其他異常病變，故尸檢未見異常。按照國標判斷：紫斑谷螟豹皮樟蟲茶在最大可使用劑量(30 g/kg·bw)下對小鼠未觀察到有害作用。

3.2小鼠骨髓紅細胞微核試驗

本試驗結果表明(表1)：陽性試驗組的微核數和與陰性對照組相比較微核數、微核率和PCE/NCE值均差異極顯著(P<0.01)，而紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物各劑量組與陰性對照組相比較微核數、微核率和PCE/NCE值均差異不顯著(P>0.05)。

表1 PLIT對雄性小鼠骨髓紅細胞微核的影響(mean±s)Tab.1 Effect of PLIT on bone narrow cell micronucleus of male mice

注：CP：環(huán)磷酰胺；“*”表示與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)；“**”表示與陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

根據國家標準評價，在本試驗條件下，紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物不引起哺乳動物嗜多染紅細胞含微核細胞率增加。

4 討 論

急性毒性是指機體次接觸或內多次接觸化學物質后在短期最長到內所發(fā)生的毒性效應，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應。是檢測和評價受試物毒性作用最基本的一項試驗，即經口一次性或24 h內多次給予受試物后，在短期內觀察動物所產生的毒性反應，包括中毒體征和死亡體征，通常用LD50來表示。急性毒性試驗是毒理研究的主要內容之一，目的是測試和求出化學毒物對一種或幾種試驗動物的致死量以表示以及其他的急性毒性參數，了解急性毒作用的強度。并通過觀察動物中毒表現和死亡的情況，了解急性毒作用性質、可能的靶器官和致死原因，提供化學毒物的急性中毒資料。初步評價對人體產生損害的危險性，探求化學毒物急性毒性的劑量一反應關系，為進一步毒理學試驗的劑量設計和觀察指標的選擇提供參考依據，還可作為化學毒物分級和標簽管理的基礎。本次試驗結果證明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶LD50遠大于30 g/kg·bw，試驗過程中未出現死亡現象，即未觀察到有害作用劑量(NOVEL)為30 g/kg·bw，按照急性毒性分級標準屬于實際無毒級別。

微核(Micronucleus)，是在細胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核時，仍然滯留在細胞質中的染色單體或染色體的無著絲點斷片，或因紡錘體受損而丟失的整條染色體，它在末期以后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細胞的胞質內而形成，比主核小，大約為主核的1/5～1/20，故稱為微核。微核試驗簡單、經濟、快速，是國際公認的致突變首選方法[13]。本次試驗結果證明紫斑谷螟豹皮樟蟲茶受試物對小鼠沒有明顯致突變作用。這與之前所報道的貴州白茶[14]、三葉蟲茶[15-17]等研究結果相一致。但對于新食品資源的安全性確定還需要更多、更全面、多次重復反復的科學研究和更多的數據結果并且在充分考慮多種因素、生物學意義、不同人群群體差異等等多種情況下才能獲得較準確的判斷和評價[18]。

[1] 楊立昌，乙 引. 貴州白蟲茶生物安全毒性理學評價研究[J]. 安徽農業(yè)科學，2010，38(15)：7826-7828.

[2] Xu L， Pan H， Lei Q，etal. Insect tea， a wonderful work in the Chinese tea culture[J].FoodResearchInternational， 2013， 53(2)： 629-635.

[3] 高 閩. 茶中奇珍-蟲茶[J]. 商品知識，1999：34.

[4] 李時珍. 本草綱目(下冊)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1982.

[5] 劉健鋒，楊茂發(fā)，胡吉鳳，等. 貴州蟲茶資源及其利用的現狀調查[J]. 貴州農業(yè)科學，2015，43(2)：62-65.

[6] 文禮章， 郭海明. 關于中國蟲茶若干問題的考察報告[J]. 茶葉通訊， 1997， 29-31.

[7] 尚小麗，楊茂發(fā)，白智江，等. 紫斑谷螟-白茶蟲茶的營養(yǎng)成分分析與評價[J]. 營養(yǎng)學報，2013，35 (5)：511-513.

[8] 彭建文， 周石涓. 湖南城步蟲茶[J]. 林業(yè)科學研究， 1991(6)： 194.

[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 15193.21-2014受試物試驗前處理方法[S].

[10] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 1925-2010試驗動物環(huán)境及設施[S].

[11] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 15193.3-2014急性經口毒性試驗[S].

[12] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 15193.5-2014哺乳動物紅細胞微核試驗[S].

[13] 張均田， 杜冠華， 現代藥理試驗方法(下冊)[M]. 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社， 2012：2221-2234.

[14] 楊立昌， 乙 引. 貴州白蟲茶生物安全性毒理學評價研究[J]. 安徽農業(yè)科學， 2010(15)： 7826-7828.

[15] 易定宏， 文禮章， 楊中俠，等. 三葉蟲茶對大鼠一般毒性試驗[J]. 毒理學雜志， 2007(05)： 430-431.

[16] 文禮章， 郭海明， 黎家文，等. 三葉蟲茶的生物安全性及其主要化學成分分析[J]. 湖南農業(yè)大學學報， 1996(06)： 75-80.

[17] 文禮章， 沈佐銳， 藏雪冰，等. 三葉蟲茶的安全性毒理學評價[J]. 中國食品學報， 2004(02)： 86-90.

[18] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 15193.1-2014食品安全毒理學評價程序[S].

AcuteToxicityTestandMicronucleusTestofPyralisFarinalis-LitseaCoreanaInsectTeainMice

WANGFang，CHENSong，LIURen-pu，YANGMao-fa*

(InstituteofEntomology，GuizhouKeyLaboratoryforPlantPestsManagementofMountainousRegion，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

The acute toxicity and mutagenicity ofPyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea in mice were investigated. Acute toxicity test， bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus test in mice were adopted. The results showed that the acute oral maximum LD50was higher than 30 g/kg·bw； the micronucleus test indicated that the difference between treating group and negative control group was not remarkable. The results proved that thePyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea is belongs to practical actox-ic and could not cause mutagenesis.

acute toxicity test； bone-marrow micronucleus test； mutation； mice

2017-05-09；

2017-09-16

國家自然科學基金項目“貴州主要蟲茶昆蟲生物學生態(tài)學及所產蟲茶評價研究”(31260526)。

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楊茂發(fā)(1968-)，男，教授，博士生導師，主要研究方向：昆蟲及螨類系統(tǒng)學、害蟲綜合治理以及資源昆蟲學；E-mail： gdgdly@126.com。

Q291

A

1008-0457(2017)05-0058-04國際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.010