構(gòu)建韌帶組織工程脫細(xì)胞支架的可行性研究

王倩 王帥 徐仲陽(yáng) 李咸周 邢寶華

（山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨科，山東濟(jì)寧 272011）

構(gòu)建韌帶組織工程脫細(xì)胞支架的可行性研究

王倩 王帥 徐仲陽(yáng) 李咸周 邢寶華*

（山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨科，山東濟(jì)寧 272011）

背景：十二烷基磺酸鈉脫細(xì)胞在脫細(xì)胞的同時(shí)對(duì)支架結(jié)構(gòu)存在一定的損傷，降低了支架的生物學(xué)性能；胰酶等脫細(xì)胞方法較為溫和，雖最大程度保留支架結(jié)構(gòu)與生物學(xué)性能，但脫細(xì)胞效果并不徹底。目的：制備并分析脫細(xì)胞牛肌腱作為組織工程韌帶支架的可行性。方法：取新鮮小牛跟腱，通過(guò)物理法去除肌腱表面腱膜、滑膜及軟組織，制備50個(gè)跟腱，隨機(jī)分為兩組，均行凍干處理。實(shí)驗(yàn)組以Triton X-100行脫細(xì)胞處理，對(duì)照組不予脫細(xì)胞處理。兩組均以PBS沖洗后室溫干燥備用。行組織學(xué)、DNA含量、細(xì)胞增殖、生物力學(xué)（最大應(yīng)力、彈性模量以及剛度）檢測(cè)，比較兩組的差異。結(jié)果：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的DNA殘留量分別為（0.34±0.15）μg/mg和（0.7±0.03）μg/mg，實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組支架DNA含量對(duì)比顯示，支架脫細(xì)胞效果徹底，無(wú)顯著的免疫原性。兩組在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差異。細(xì)胞增殖顯示脫細(xì)胞支架對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。實(shí)驗(yàn)組的最大應(yīng)力小于對(duì)照組，彈性模量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，剛度試驗(yàn)顯示兩組無(wú)明顯差異。結(jié)論：脫細(xì)胞支架在保留天然支架生物學(xué)性能的基礎(chǔ)上可作為組織工程支架的選擇。

組織工程韌帶；免疫原性；組織相容性；脫細(xì)胞；肌腱

脫細(xì)胞技術(shù)能保留韌帶良好的生物力學(xué)特性，仿生三維結(jié)構(gòu)，使得宿主對(duì)異體、異種韌帶支架的免疫排斥顯著降低[1,2]。脫細(xì)胞支架實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分泌的產(chǎn)物，組織或器官在其基礎(chǔ)上形成。理想的脫細(xì)胞支架制備方法應(yīng)既能有效去除組織中的細(xì)胞成分，最大程度降低材料的免疫原性，又能保留相對(duì)完整的三維支架結(jié)構(gòu)，保持足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度，以滿足組織修復(fù)重建的需要[3]。由于肌腱韌帶的特殊性質(zhì)及其高強(qiáng)度的工作環(huán)境，使得該方面的組織工程研究變得異常困難。

脫細(xì)胞處理的典型方法包括在低滲鹽水中廣泛漂洗，用稀釋的過(guò)氧乙酸（0.1%）處理或在Triton 100×中培育，然后用環(huán)氧乙烷或γ輻照消毒。這些方法已被證明可完全去除細(xì)胞成分，降解＜300 bp的核酸碎片且保留生長(zhǎng)因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生物活性[4-6]。除此之外，尚有胰酶、SDS、Triton X-100等脫細(xì)胞方法。胰酶脫細(xì)胞較為溫和，但脫除腱膜等能力較弱，脫細(xì)胞不夠徹底；SDS在脫除細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)支架結(jié)構(gòu)的破壞較多，顯著降低支架的生物學(xué)性能，不能滿足韌帶力學(xué)特征需求。故而，本研究選用能實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞又能將對(duì)支架的損傷降到最低的Triton X-100。脫細(xì)胞處理前，利用反復(fù)凍融處理，能最大程度地破壞支架內(nèi)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，利于在不損傷細(xì)胞外基質(zhì)的情況下較為徹底的脫除細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究比較經(jīng)過(guò)特殊方式處理的牛肌腱，從肌腱的生物力學(xué)、脫細(xì)胞情況、細(xì)胞相容性等方面探討其在臨床應(yīng)用上的前景。

1 材料與方法

1.1 原料

牛肌腱纖維，由屠宰場(chǎng)提供，-20℃保存。Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）購(gòu)自Sigma。以上原料使用時(shí)均不再需要純化。DNA含量定量檢測(cè)試劑盒Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Assay Kit（Invitrogen 公司，美國(guó)）；DAPI（Vector公司，美國(guó)）。冰凍切片機(jī)、偏振光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀（Leica公司，德國(guó)）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；熒光生物顯微鏡（Nikon公司，日本）；冷凍干燥機(jī)（Christ公司，德國(guó)）；球磨儀（Retsch公司，德國(guó)）；生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（Instron公司，美國(guó)）；游標(biāo)卡尺（精確度0.02 mm；上海三圈公司）。

1.2 支架制備

自冷凍冰箱取出小牛跟腱，37℃水浴箱內(nèi)快速解凍。清除牛肌腱表面筋膜、滑膜及軟組織，PBS緩沖液沖洗肌腱組織，物理方法制備小牛跟腱50根，長(zhǎng)度約為5 cm，直徑5 mm[7]，隨機(jī)分為兩組，每組25根。A組為對(duì)照組，未做處置；B組為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)脫細(xì)胞及反復(fù)凍融處理：將肌腱裝入橡膠盒內(nèi)，密封后于液氮、37℃恒溫水浴箱反復(fù)凍融：液氮1 min→恒溫水浴5 min，循環(huán)6次。將凍融處理后的肌腱放入含有0.5%Triton X-100的離心管內(nèi)，密封：37℃恒溫?fù)u床24 h→PBS緩沖液反復(fù)沖洗5次→37℃恒溫?fù)u床24 h→PBS緩沖液反復(fù)沖洗5次，共循環(huán)5次。脫細(xì)胞后PBS反復(fù)清晰30 min后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 支架內(nèi)DNA含量殘留的檢測(cè)

各組隨機(jī)取3根跟腱，凍干，剪碎，稱重，球磨，0.5 mg/ml木瓜蛋白酶60℃消化48 h，4℃以5000×g離心5 min，取上清液。采用Quant-iT?PicoGreen?dsD?NA Assay Kit進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下。①配制樣本稀釋液。取2 ml×TE加入38 ml雙蒸水，混勻得40 ml 20×TE。PicoGreen試劑制備：取 100 μl PicoGreen，加入19.9 ml稀釋液混勻后避光保存。②配制標(biāo)準(zhǔn)品。高濃度組：1、0.1、0.01、0.001、0 μg/ml各180 μl；低濃度組：50、5、0.5、0.05、0 ng/ml各180 μl；檢測(cè)吸光度（A）值。各樣本和標(biāo)準(zhǔn)品中均加入180 μl PicoGreen試劑。于96孔板分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔（各設(shè)4個(gè)復(fù)孔）。各加入50 μl空白液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本上清液（5 min內(nèi)加完）。散射波長(zhǎng)為485 nm，放射波長(zhǎng)為538 nm，于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)A值。③計(jì)算樣本濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的A值，分別繪制高濃度和低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合各樣本的A值計(jì)算樣本濃度。

1.4 脫細(xì)胞韌帶的拉伸力學(xué)測(cè)試

各組隨機(jī)取8根跟腱，修剪成長(zhǎng)4 cm的肌腱節(jié)段，于冰凍切片機(jī)上沿肌腱縱向切成600 μm薄片，PBS清洗3次，每次5 min，游標(biāo)卡尺測(cè)量各切片寬度（0.4～0.6 cm）。用砂紙包住肌腱切片兩端，固定至生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)的夾具上，游標(biāo)卡尺測(cè)量拉伸前樣本的初始長(zhǎng)度（兩夾具之間的長(zhǎng)度）。以5 mm/min加載速度進(jìn)行單軸拉伸試驗(yàn)，直至載荷值下降至最大值的50%時(shí)終止。根據(jù)系統(tǒng)采集的拉伸載荷、位移、應(yīng)力和應(yīng)變的數(shù)值，計(jì)算各樣本的最大拉力、彈性模量和剛度。

1.5 細(xì)胞-支架復(fù)合

在脫細(xì)胞韌帶支架上種植并培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs），參考相關(guān)學(xué)者[8-10]描述的方法，提取原代SD大鼠的MSCs。將2種支架分別裁剪成1.2 cm×1.2 cm大小的方形。裁剪后的支架材料通過(guò)紫外線照射2 h進(jìn)行消毒，并將支架浸沒(méi)于70%的酒精溶液4 h中，增加支架的親水性。消毒處理后的支架置于24孔板中使用干細(xì)胞專用培養(yǎng)基（美國(guó)Sciencell公司）孵育過(guò)夜。每個(gè)支架表面種植MSCs的數(shù)目為5×104，置于37℃，5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基隔天換液。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（MTT）對(duì)MSCs在2種支架上的增殖情況進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞增殖測(cè)試選擇接種細(xì)胞的第1天和第7天進(jìn)行。分別提取24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入MTT溶液20 μl，避光孵育2 h后，使用Model550型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）于450 nm進(jìn)行度數(shù)。根據(jù)前期繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出每個(gè)支架上的細(xì)胞量。

1.7 細(xì)胞外機(jī)基質(zhì)分泌的檢測(cè)

基因表達(dá)的檢測(cè)：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)細(xì)胞支架復(fù)合體標(biāo)本（實(shí)驗(yàn)組）放入液氮中，使用時(shí)各切取100 mg，于麻醉下切取3只健康3月齡新西蘭大白兔正常椎間盤纖維環(huán)（共3個(gè)）放入液氮中，使用時(shí)各標(biāo)本切取100 mg設(shè)為正常纖維環(huán)組。RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達(dá)。組織總RNA抽提：常規(guī)Tripure法提取總RNA，貯存于70%乙醇并保存于-80℃。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0（美國(guó)IBM公司）對(duì)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)注差表示，均數(shù)間比較采用方差分析，p＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞支架DNA含量的檢測(cè)

對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的DNA殘留量分別為（0.70±0.03）μg/mg和（0.34±0.15）μg/mg，實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

2.2 脫細(xì)胞韌帶支架的拉伸力學(xué)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的最大應(yīng)力顯著小于對(duì)照組（p＜0.05），而彈性模量和剛度試驗(yàn)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）。結(jié)果表明，脫細(xì)胞支架在保留天然支架生物學(xué)性能的基礎(chǔ)上可作為組織工程支架的選擇。

表1 兩組生物力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比較（

表1 兩組生物力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比較（

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組P值最大拉力（N）62.73±8.27 55.80±7.03＜0.05彈性模量（MPa）186.55±58.29 157.72±20.76＞0.05剛度（N/m）39.41±16.39 37.48±8.56＞0.05

2.3 細(xì)胞增殖情況

MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的結(jié)果顯示（圖1），在第1和7天，兩種支架表面的MSCs均快速增殖，兩種支架上第7天的細(xì)胞數(shù)目均較第1天時(shí)明顯增加，但是2種支架上的細(xì)胞數(shù)目在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 兩種支架表面的MSCs均快速增殖

2.4 細(xì)胞外基質(zhì)的檢測(cè)

負(fù)壓吸附法進(jìn)行支架復(fù)合培養(yǎng)，分別于1、2、3周時(shí)，對(duì)干細(xì)胞-支架復(fù)合物取3個(gè)樣本，正常新鮮脫細(xì)胞支架作為對(duì)照組。RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ型膠原基因表達(dá)，觀察細(xì)胞-支架復(fù)合后Ⅰ、Ⅱ型膠原分泌情況。

圖2 細(xì)胞外基質(zhì)的檢測(cè)

3 討論

3.1 膠原纖維的脫細(xì)胞

去除肌腱組織抗原性是本研究的重點(diǎn)，而脫細(xì)胞方法的選擇難點(diǎn)。首先，分離制作肌腱脫細(xì)胞支架，再經(jīng)凍融循環(huán)處理，凍融循環(huán)在保留肌腱生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上能最大限度促進(jìn)肌腱纖維的分離[11-13]。再選用Triton X-100洗滌劑對(duì)肌腱纖維進(jìn)行脫細(xì)胞處理，既能去除肌腱表面的纖維膜，又能最大限度的保留膠原纖維蛋白，經(jīng)Triton X-100脫細(xì)胞處理后，肌腱纖維支架的結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度和干重均未出現(xiàn)明顯改變，這可能與牛肌腱纖維結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌以及Triton X-100試劑相對(duì)溫和有關(guān)。傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉(SDS)、TBP等對(duì)肌腱纖維的損傷較大，膠原纖維有一定程度的損傷。SDS、TnBP均是通過(guò)溶解細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，破壞蛋白質(zhì)之間相互作用從而降低材料抗原性。Vavken等研究表明，SDS、Trypsin處理時(shí)肌腱細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖顯著減少；Deeken等發(fā)現(xiàn)采用TnBP處理會(huì)顯著破壞肌腱的力學(xué)性能。而胰酶和EDTA的組合因牛肌腱結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，卻不能有效地清除肌腱纖維中的抗原成分，體內(nèi)植入更易產(chǎn)生明顯的免疫排斥反映。Whitlock等發(fā)現(xiàn)單純采用DNase/RNase處理肌腱脫細(xì)胞效果并不十分理想。生物力學(xué)研究表明脫細(xì)胞方法處理前后肌腱纖維支架的力學(xué)性能出現(xiàn)明顯差異，但能滿足人體膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷修復(fù)的力學(xué)需求。脫細(xì)胞處理后最大應(yīng)力與彈性模量的下降說(shuō)明該脫細(xì)胞方法可能對(duì)肌腱纖維間的彈性纖維造成了損傷，針對(duì)該方面不足，結(jié)合非生物材料合成辦法，可結(jié)合相關(guān)化學(xué)物理辦法來(lái)彌足該方面不足。

3.2 脫細(xì)胞韌帶支架的生物力學(xué)性能

DNA殘留量檢測(cè)結(jié)果顯示脫細(xì)胞處理后DNA含量降低了約80%。結(jié)果表明反復(fù)凍融結(jié)合核酸酶處理是一種對(duì)于完整小牛跟腱組織較為有效的脫細(xì)胞方法。且反復(fù)凍融結(jié)合核酸酶處理是一種較溫和的脫細(xì)胞方法，對(duì)膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分影響較小。Qin等[14]研究表明，成年犬肌腱組織承受拉伸載荷最小的力學(xué)單元是直徑約為300 μm纖維束，因此當(dāng)肌腱切片厚度在300 μm以上時(shí)，其強(qiáng)度能基本反映完整肌腱的生物力學(xué)特性。本研究采用了600 μm厚度的切片作為拉伸試樣，并計(jì)算其強(qiáng)度值以反映完整小牛跟腱的力學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)測(cè)得脫細(xì)胞處理后小牛跟腱的拉伸強(qiáng)度為（23.00±6.01）MPa，約保留了原始強(qiáng)度值的90%，雖然與待修復(fù)肌腱/韌帶組織真實(shí)的力學(xué)強(qiáng)度值存在較大差異，但較SIS、真皮、羊膜等脫細(xì)胞材料在力學(xué)性能方面仍具有較大優(yōu)勢(shì)，因而探究脫細(xì)胞小牛跟腱支架修復(fù)韌帶或肌腱缺損是一個(gè)有潛在應(yīng)用前景的研究方向。

人體各個(gè)部位肌腱的彈性模量均不相同，主要原因在于人體各個(gè)部位肌腱所承擔(dān)的功能不同，對(duì)肌腱形變的要求均不相同，所以真正的人工肌腱需高度與正常肌腱的彈性模量相吻合。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脫細(xì)胞支架在經(jīng)過(guò)處理后彈性模量并未出現(xiàn)顯著下降，這表明了經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理的肌腱能夠在一定程度上模仿正常肌腱的運(yùn)動(dòng)功能。課題組前期進(jìn)行了有關(guān)異體兔臏韌帶脫細(xì)胞支架材料生物相容性的初步研究，結(jié)果也提示脫細(xì)胞支架的免疫原性和生物相容性能夠適應(yīng)機(jī)體損傷的修復(fù)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，反復(fù)凍融結(jié)合Tri?ton X-100處理小牛肌腱可有效脫去細(xì)胞成分，同時(shí)較好地保留組織天然形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)組分以及生物力學(xué)特性。后期我們將進(jìn)一步定量探究小牛肌腱脫細(xì)胞處理后糖胺聚糖、纖維連接蛋白以及部分生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外基質(zhì)成分的保留情況，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物活性，皮下植入實(shí)驗(yàn)觀察其炎性反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)，進(jìn)一步研究脫細(xì)胞小牛肌腱用于修復(fù)肌腱/韌帶缺損的可能性。

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Construction of acellular tendon scaffold for ligament tissue engineering

WANG Qian,WANG Shuai,XU Zhongyang,LI Xianzhou,XING Baohua*
(Department of Orthopaedics,Jining First People′s Hospital,Jining 272011,Shandong,China)

Background:The cells can be removed completely by sodium dodecyl sulfate(SDS),but the scaffold structure may be damaged and result in decreased biological characteristics.The scaffold structure and biological characteristics can be maximally preserved by pancreatic enzyme,while the cells couldn't be removed completely because the pancreatic enzyme are relatively mild.Objective:To prepare and analyze the feasibility of acellular bovine tendon as scaffold of tissue engineered ligament.Methods:Fifty fresh bovine tendons were obtained.Their tendon membrane,synovial membrane and soft tissue were removed by physical method.Then the tendons were randomly divided into two groups and the freeze-drying was used for them.The experimental group was decellullarised with Triton X-100,and control group was not decellullarised.All the cells in both groups were dried up at room temperature after PBS flushed.Then histological slices were performed.DNA content,cell proliferation,and biomechanics(maximum stress,elastic modulus and stiffness)were measured and compared between the two groups.Results:The residual amount of DNA was(0.34±0.15)μg/mg and(0.7±0.03)μg/mg in the control group and experimental group,respectively(p＜0.05).The significant difference of DNA residual amount between the two groups showed that the cells could be removed completely with no significant immunogenicity.There was no significant difference in morphological structure between the two groups.The decellularized scaffold did not affect the cell proliferation.The maximal stress of the experimental group was significantly lower than that of the control group,while no significant difference was found in the elastic modulus or the stiffness between the two groups.Conclusions:The acellular tendon can be used as the scaffold of tissue engineering ligament based on biological properties of natural scaffolds.

Tissue Engineering Ligament;Immunogenicity;Histocompatibility;Decellullarised;Tendon

2095-9958（2017）08-0 347-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.04-16

*通信作者：邢寶華，E-mail：xingbhspine@163.com