正交優(yōu)化石榴花多糖提取工藝

彭立鑫　程遠(yuǎn)夢(mèng)　孟凡蕾

摘要：采用水提醇沉法提取石榴花中多糖。為優(yōu)化石榴花多糖提取條件，選取單因素試驗(yàn)中影響差異顯著的提取溫度、固液比、提取時(shí)間和乙醇沉淀最終濃度4個(gè)因素，并運(yùn)用正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果顯示，石榴花多糖最佳水提醇沉工藝條件為：提取溫度95 ℃、提取時(shí)間3 h、固液比1∶20（g∶mL）、乙醇濃度80%醇沉。其中提取溫度、固液比、提取時(shí)間及醇沉終濃度對(duì)多糖得率影響依次減小。

關(guān)鍵詞：石榴花；多糖；正交試驗(yàn)；提取優(yōu)化

中圖分類號(hào)：R284.2；TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）20-3929-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.033

Abstract： Pomegranate flowers as row material were used for extraction of polysaccharide with water and alcohol. In order to optimize extraction conditions for polysaccharide， on the basis of single factor experiments， the orthogonal experiment were used to design the four factors， including extracting temperature， extracting time， solid-liquid ratio and final concentration of ethanol precipitation. The optional conditions were as follows： water temperature of 95 ℃， an extraction time of 3 h， solid-liquid ratio of 1∶20（g∶mL）， ethanol precipitation concentration of 80%. The effects of extraction temperature， solid-liquid ratio， extraction time and final concentration of alcohol precipitation on the yield of polysaccharides decreased in turn.

Key words： pomegranate flowers； polysaccharides； orthogonal experiment； extraction optimization

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬植物，其漿果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。目前在中國(guó)已形成山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、河南滎陽(yáng)、四川會(huì)理、陜西臨潼、新疆葉城和云南蒙自7大石榴主產(chǎn)地[1]。其中山東棗莊已擁有10余萬(wàn)畝的石榴栽種面積，40個(gè)石榴品種，被譽(yù)為“冠世榴園”。石榴5～7月開花，石榴花不僅觀賞價(jià)值和文化價(jià)值較好，其藥用價(jià)值也逐漸成為研究熱點(diǎn)。石榴花的藥用價(jià)值早在《本草綱目》[2]中記有“榴花主治：陰干為末，和鐵丹（即鐵粉）服一年變白發(fā)如漆。干葉治心熱吐血，又研末塞鼻止衄血，亦傅金瘡出血”?！吨兴幋筠o典》記載其主治中耳炎、鼻衄、肺癰和創(chuàng)傷出血，可內(nèi)服亦可外用。維吾爾族醫(yī)療中常用于治療白內(nèi)障、惡心及神經(jīng)衰弱等，素稱“古麗娜”[3]。研究表明，石榴花抗氧化活性較高[4]，可用于降血脂及降血糖[5]。而石榴開花量大，常分3批開花，剛現(xiàn)蕾時(shí)需疏除不結(jié)實(shí)的鐘狀花，后期部分二花及所有三花也需疏除大部分，其價(jià)值沒(méi)有得到充分的利用[3]。石榴花不僅含有多酚、黃酮及萜類物質(zhì)，還含有多糖成分。多糖在自然界中廣泛存在，因其具有多種生物活性而被廣泛作為中草藥的有效成分，可用于抗腫瘤[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、抗輻射[9]、抗菌抗病毒[10]等。多糖類藥物的研制已逐步成為世界新藥發(fā)展的一大方向[11，12]。目前有關(guān)植物多糖提取的研究已有許多報(bào)道，而對(duì)于石榴花多糖提取的研究較少，為了合理開發(fā)和利用石榴花多糖，本研究根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，利用正交試驗(yàn)對(duì)石榴花多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝，為今后石榴花多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴花樣品（品種為崗榴）于2014年6月采自棗莊學(xué)院校園，由棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室李思健副教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴的花，樣品于40 ℃恒溫烘干，置于冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

苯酚、濃硫酸、氯仿、甲醇、無(wú)水乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外可見分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；FA110413電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；LK-2000A組織搗碎機(jī)（新昌縣紅利機(jī)械有限公司）；HH-S4恒溫水浴箱（常州普天儀器制造有限公司）；16L-206高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴花多糖提取工藝 石榴花→清洗→烘干→粉碎至200目→氯仿∶甲醇（2∶1）45 ℃脫脂→脫單糖→干燥→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→離心→沉淀去乙醇→烘干→石榴花粗多糖。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[13]，稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加水溶解定容至250 mL，配成80 μg/mL的母液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，置于具塞試管中，各加去離子水至1.0 mL，加入濃度為5%的苯酚0.5 mL，迅速滴加濃硫酸2.5 mL，搖勻，室溫放置40 min后于490 nm處測(cè)吸光度（以去離子水1.0 mL加苯酚和硫酸作參比）。同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)3個(gè)重復(fù)。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸曲線等。endprint

1.3.3 石榴花多糖得率計(jì)算

得率=×100%。其中，M1為石榴花原料的質(zhì)量（g）；M2為多糖的質(zhì)量（g）。

1.4 工藝優(yōu)化試驗(yàn)說(shuō)明

1.4.1 單因素試驗(yàn) 脫脂、脫單糖石榴花粉末，提取溫度分別設(shè)定為65、75、85、95、100 ℃，提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，固液比（g∶mL）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取液加乙醇醇沉的最終濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，分別考察其對(duì)石榴花多糖得率的影響，確定最佳的提取條件。

1.4.2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分析提取溫度、固液比、提取時(shí)間、醇沉終濃度這4個(gè)因素的3個(gè)水平間相互關(guān)系，以優(yōu)化提取條件，選擇L9（34）正交表，設(shè)計(jì)方案見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取5份1.000 g脫脂、脫單糖石榴花粉末于100 mL錐形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶30加去離子水后，分置于梯度溫度的各水浴鍋中浸提3 h，離心后取上清液測(cè)其多糖含量，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在65～95 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率提升幅度較大。當(dāng)溫度升高至100 ℃時(shí)，得率反而下降，可能是由于溫度過(guò)高，雜質(zhì)溶出增多，影響多糖的溶解，得率下降。綜合考慮選取提取溫度為80～95 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取5份1.000 g脫脂、脫單糖石榴花粉末于100 mL錐形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶30加去離子水后，置于85 ℃恒溫水浴鍋中，分別浸提1、2、3、4、5 h，離心后取上清液測(cè)其多糖含量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在1～3 h時(shí)，多糖得率增加的幅度較大，超過(guò)3 h后，多糖得率增幅較緩，對(duì)效能綜合考慮后選取提取時(shí)間為1～3 h。

2.1.3 固液比對(duì)多糖得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取5份1.000 g脫脂、脫單糖石榴花粉末于100 mL錐形瓶中，依次按固液比（g∶mL）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加去離子水后，置于85 ℃恒溫水浴鍋中浸提3 h，離心后取上清液測(cè)其多糖含量。從圖3可以看出，在固液比1∶10～1∶20時(shí)隨著提取溶劑的增加，多糖得率上升，固液比超過(guò)1∶20后提取效果呈降低趨勢(shì)，這可能是由于后期溶液濃縮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所致。

2.1.4 醇沉終濃度對(duì)多糖得率的影響 分別準(zhǔn)確稱取5份1.000 g脫脂、脫單糖石榴花粉末于100 mL錐形瓶中，按固液比（g∶mL）1∶20加去離子水后，置于85 ℃恒溫水浴鍋中浸提3 h，離心取上清液加入無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度依次為50%、60%、70%、80%、90%。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)醇沉終濃度為50%時(shí)多糖析出不明顯，而在60%～90%范圍內(nèi)隨乙醇濃度增大，多糖析出不斷增加，但因乙醇用量大而致使成本升高。

綜合考慮各種因素，本試驗(yàn)選取提取時(shí)間、提取溫度、固液比（g∶mL）和醇沉終濃度為主要影響因素，各因素對(duì)應(yīng)水平依次為：1、2、3 h；85、90、95 ℃；1∶10、1∶20、1∶30；70%、80%、90%。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取1.000 g脫脂、脫單糖石榴花粉末于100 mL錐形瓶中，依次按固液比（g∶mL）1∶30加去離子水后，置于85 ℃恒溫水浴鍋中浸提3 h，過(guò)濾后取上清液測(cè)其多糖含量；濾渣重復(fù)提取3次，檢測(cè)每次浸提液中多糖含量。結(jié)果（圖5）表明，隨浸提次數(shù)的增加，多糖得率不斷增加。但1次提取的提取率已基本穩(wěn)定，再增加提取次數(shù)對(duì)多糖提取率影響不大，而成本增加較大，故選擇1次提取。

2.2 正交試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案對(duì)石榴花多糖醇沉工藝優(yōu)化的結(jié)果見表2。由表2可知，試驗(yàn)因素的主次順序?yàn)锳（提取溫度）>B（液固比）>D（提取時(shí)間）>C（醇沉終濃度），最優(yōu)水平搭配為A3B1C2D3。即溫度95 ℃，固液比1∶20，醇沉終濃度80%，提取時(shí)間3 h。為了直觀起見，用因素的水平變化為橫坐標(biāo)，指標(biāo)的平均值為縱坐標(biāo)，作水平與指標(biāo)關(guān)系圖，如圖6所示。由極差分析得知，提取溫度是影響石榴花多糖提取率的最顯著因素，其次是固液比、提取時(shí)間及醇沉終濃度。

3 小結(jié)

本研究對(duì)影響石榴花多糖提取的提取時(shí)間、固液比、溫度、次數(shù)和醇沉終濃度做了單因素試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)提取時(shí)間、固液比、提取溫度和醇沉終濃度4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)。極差分析表明，提取溫度和液固比對(duì)石榴花多糖提取的影響最大，其次是提取時(shí)間和醇沉終濃度。本研究中石榴花提取所得多糖為粗多糖，而多糖的純度直接關(guān)系到多糖類物質(zhì)具有的高生物活性。后期將對(duì)粗多糖進(jìn)一步除雜，分離純化得到高純度多糖，并深入探究多糖的組成和結(jié)構(gòu)，有關(guān)這方面的工作有待進(jìn)一步報(bào)道。

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