hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響

趙剛 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響

趙剛 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

目的構(gòu)建含hBMP2(human bone morphogenetic proteins 2)質(zhì)粒DNA的β-TCP/膠原(β-tricalcium phosphate/collagen)支架材料，并研究其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響。方法制備納米級(jí)多孔β-TCP/膠原支架并負(fù)載含hBMP2目的DNA基因及對(duì)照質(zhì)粒形成基因修飾的支架材料。建立MC3T3-E1細(xì)胞株與復(fù)合支架的體外培養(yǎng)體系。將其分為支架組hBMP2組(Z)對(duì)照質(zhì)粒組(Z0)，平皿hBMP2組(M)和對(duì)照質(zhì)粒組(M0)。復(fù)合培養(yǎng)后取樣通過掃描電鏡觀察支架表面形態(tài)，成骨誘導(dǎo)1、3、7、14 d檢測(cè)不同濃度BMP2支架組和非支架組細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)的活性，并在成骨誘導(dǎo)的不同時(shí)間點(diǎn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè) Runx2、OCN、ALP、OPN等成骨相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果含hBMP2為目的基因的質(zhì)粒DNA修飾納米β-TCP/I型膠原溶液復(fù)合材料表面呈多孔樣結(jié)構(gòu)；支架組和平皿組中加入hBMP2質(zhì)粒DNA都能提高ALP的活性以及成骨相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)；支架組對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨促進(jìn)能力優(yōu)于平皿組。結(jié)論負(fù)載hBMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的骨誘導(dǎo)性。

BMP2； β-TCP/膠原； 成骨能力； 骨缺損

骨缺損是一種常見、多發(fā)又治療相當(dāng)復(fù)雜的先天性、發(fā)育性及后天疾患。組織工程支架材料在骨缺損修復(fù)中被廣泛應(yīng)用，β磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)是最重要的支架材料，它具有良好的生物相容性，但其生物響應(yīng)性(即受植區(qū)組織)對(duì)其反應(yīng)性,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如自體骨組織，因此解決此類問題成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。越來越多的研究開始使用包裹生物活性因子[1]的緩釋材料(如納米微囊)，或者以生化技術(shù)搭載生物活性因子相關(guān)基因載體并由種子細(xì)胞吞噬后，可大量表達(dá)生物活性因子的材料。這種技術(shù)雖然已經(jīng)非常先進(jìn)，但仍然需要不斷探索。本實(shí)驗(yàn)將具有骨傳導(dǎo)性能的β-TCP/膠原支架與具有成骨活性的因子BMP2載體進(jìn)行復(fù)合，形成的復(fù)合支架材料以期其具備更優(yōu)越的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料分組

2015-03～2016-01于佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室完成；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：體外細(xì)胞觀察性實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)材料分組：支架組(Z)：根據(jù)支架上復(fù)合hBMP2質(zhì)粒的量分為2 組：Z0組(支架含14 μg對(duì)照質(zhì)粒)和Z14組(支架含14 μg hBMP2質(zhì)粒)。平皿組(M)：根據(jù)轉(zhuǎn)染時(shí)在12 孔板中所加hBMP2質(zhì)粒的量分為2 組：M0組(平皿加1 μg對(duì)照質(zhì)粒)和M1(平皿加1 μg hBMP2質(zhì)粒)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：層流超聲工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，超低溫冰箱(Thermo，美國)，掃描電鏡(島津，SSX-550，日本)、倒置顯微鏡(Olympus BX5，日本)，輔助電動(dòng)移液槍、離心管、微量移液器(Brand，德國)，高速M(fèi)egafuge離心機(jī)、NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì)、渦旋離心機(jī)(Thermo Scientific，美國)，LightCycler@480 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Roche，瑞士)，PCR儀(Biorad，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成帶有hBMP2基因的質(zhì)粒DNA hBMP2為目的基因的質(zhì)粒DNA購于大連寶生物工程有限公司，按參考文獻(xiàn)[2]制備出含hBMP2目的基因的真核表達(dá)載體，以購自ATCC的hBMP2基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，hBMP2基因的序列號(hào)為：NM-001200.2，ID：650，PCR的產(chǎn)物通過分離純化后經(jīng)Xba I、Hind Ⅲ雙酶切，插入相同雙酶切的pcDNA3.1(-)表達(dá)載體，再經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定后大量擴(kuò)增并純化，制備液態(tài)hBMP2/pcDNA3.1(-)，其濃度為3 μg/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 負(fù)載hBMP2為目的基因質(zhì)粒DNA修飾納米β-TCP/膠原溶液復(fù)合材料 復(fù)合材料購于北京奧精醫(yī)藥科技有限公司，納米級(jí)復(fù)合材料按參考文獻(xiàn)[3]制備：將已經(jīng)制備好的含hBMP2目的基因液體的質(zhì)粒DNA滴加至支架材料，然后經(jīng)過低溫凍干處理后，制備成含不同質(zhì)粒濃度的支架材料，并切割成5 mm×5 mm×2 mm的小長方體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞購于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。經(jīng)過復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。

1.2.4 材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng) 細(xì)胞接種：所有支架材料經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，再經(jīng)紫外線光照射3 h，從而達(dá)到分組材料滅菌的目的。將支架材料放入24 孔板中，再加入1 ml含10%FBS的α-MEM預(yù)先潤濕過夜。采用負(fù)壓將支架材料上的液體抽干，將5×104個(gè)小鼠前成骨MC3T3-E1細(xì)胞細(xì)胞滴加到支架上，并在37 ℃，5%CO2濃度的孵箱中孵育3 h，之后加1 ml完全培養(yǎng)基。平皿培養(yǎng)是直接在24 孔板中每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待24 孔中細(xì)胞達(dá)到70%匯合率時(shí)，進(jìn)行BMP2轉(zhuǎn)染。含BMP2的質(zhì)粒由大連寶生物工程有限公司合成，轉(zhuǎn)染前先將完成培養(yǎng)基換成無血清α-MEM。分別在2 個(gè)1.5 ml EP管中加入50 μl α-MEM，其中一管中加入2.4 μl脂質(zhì)體(漢恒生物，中國)，另一管中加入1 μg含BMP2的質(zhì)粒DNA或?qū)φ召|(zhì)粒，混勻后孵育5 min，將脂質(zhì)體滴加到質(zhì)粒DNA中孵育20 min后，均勻滴加到12 孔內(nèi)。支架組只加脂質(zhì)體。6 h后換為正常的完全培養(yǎng)基。

1.3 檢測(cè)方法與指標(biāo)

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 體外細(xì)胞預(yù)處理后，掃描電鏡、光鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 堿性磷酸酶活性(ALP)檢測(cè) 配置成骨誘導(dǎo)液，將平皿與支架上成骨誘導(dǎo)1、3、7、14 d的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2 遍，胰酶消化后離心去上清，加入100 μl 0.1% triton X-100(Amresco,USA)，打散細(xì)胞后4 ℃放置6 h離心取上清。根據(jù)堿性磷酸酶測(cè)試盒說明書(南京建成，中國)對(duì)ALP活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 各組細(xì)胞在第1、3、7、14天4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)用TRIzol進(jìn)行裂解細(xì)胞，使用氯仿、異丙醇等提取mRNA，1 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用LightCycler@480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)細(xì)胞成骨相關(guān)基因Runx2、OCN、ALP、OPN的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)?；蛞镆姳?1。

表 1 RT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 支架電鏡圖 含hBMP2質(zhì)粒DNA修飾的納米級(jí)β-磷酸三鈣/I型膠原復(fù)合材料的掃描電鏡下觀察形態(tài)(圖 1)。顯示復(fù)合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。從而判斷復(fù)合材料中的微孔都是相互連通的。連通的微孔能夠?yàn)槌晒羌?xì)胞在材料內(nèi)的活動(dòng)提供有利通道。

2.1.2 hBMP2轉(zhuǎn)染效率 MC3T3-E1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞顯示有綠色熒光超過90%(圖 2A、2B)，說明我們成功將外源基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。同時(shí)我們對(duì)轉(zhuǎn)染了hBMP2的MC3T3-E1細(xì)胞中BMP2的mRNA表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP2的表達(dá)升高(圖 2C)。

圖 1 支架電鏡圖

2.2 堿性磷酸酶ALP活性檢測(cè)結(jié)果

將MC3T3-E1細(xì)胞接種在平皿和支架材料的表面，在誘導(dǎo)后的1、3、7、14 d對(duì)成骨細(xì)胞中ALP的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在成骨誘導(dǎo)過程中平皿組和支架組ALP表達(dá)均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在成骨細(xì)胞接種早期(1、3 d)，平皿組和支架組ALP的活性較低，在各組間差異不是很顯著；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，接種于支架材料的成骨細(xì)胞的ALP活性明顯且高于平皿組；平皿培養(yǎng)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染hBMP2或復(fù)合hBMP2質(zhì)粒的支架組均表現(xiàn)出較高的ALP活性(圖 3)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果

MC3T3-E1細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)1、3、7、14 d的過程中, 成骨相關(guān)標(biāo)志基因Runx2，OCN，ALP，OPN表達(dá)均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(圖 4)，其中支架組成骨相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)升高較平皿組明顯；成骨誘導(dǎo)中后期，復(fù)合hBMP2質(zhì)粒的支架組成骨標(biāo)志基因表達(dá)明顯高于對(duì)照支架組。

圖 3 4 組MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)ALP的活性

Fig 3 ALP activity of MC3T3-E1 cells at different time points after transfection

3 討 論

近年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞載體的重要性并開始不斷探索，Green[4]1977 年就預(yù)言有可能在新型生物相容性材料上種植細(xì)胞并形成可以被移植的成骨新組織。臨床上大量試驗(yàn)研究充分證實(shí)BMP2具有優(yōu)良的骨形成誘導(dǎo)能力[5-6]。但是也有研究指出BMP2在體內(nèi)的半衰期比較短，容易被蛋白酶降解，發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用能力低[7]。本課題組體外實(shí)驗(yàn)將編碼具備hBMP2基因的質(zhì)粒DNA承載到納米級(jí)多孔β-TCP/膠原支架材料上，檢測(cè)其成骨活性能力。掃描電鏡、光鏡下顯示轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞有超過90%的細(xì)胞顯示有綠色熒光(圖 2A、2B)，說明我們已成功將外源基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了hBMP2的細(xì)胞中hBMP2的表達(dá)升高。這表明β-TCP/膠原支架材料具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性，以實(shí)現(xiàn)臨床上的骨組織的爬行替代過程。ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)過程中ALP活性呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，第7天開始接種于支架材料的成骨細(xì)胞分泌的ALP開始增加明顯且高于平皿組，并且在平皿培養(yǎng)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染hBMP2可促進(jìn)ALP活性的表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)hBMP2基因修飾材料良好的骨誘導(dǎo)活性。

圖 4 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)4 組MC3T3-E1 細(xì)胞中成骨相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)

質(zhì)粒載體臨床上有較高安全性，廣泛的應(yīng)用于基因工程中[8]。在成骨誘導(dǎo)分化過程中，ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志[9]。本課題組ALP活性和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)hBMP2在體外實(shí)驗(yàn)MC3T3-E1細(xì)胞中得到了較好的表達(dá)，并且檢測(cè)因子在14d時(shí)hBMP2的表達(dá)更加增強(qiáng)，但是對(duì)照組單純DNA支架組中的BMP2的表達(dá)相對(duì)較弱。從而說明了平皿和支架組均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性有良好的生物相容性，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示支架組的成骨活性要優(yōu)于平皿組。Keeney[10]研究也發(fā)現(xiàn)磷酸鈣/膠原復(fù)合支架材料可以作為裸DNA的高效載體,與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

BMP2是一種具有多功能作用的蛋白，在骨形成過程中的作用已被廣泛研究[11]。BMP2可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，加速骨缺損的修復(fù)。其中BMP2用來治療骨缺損取得良好療效[12]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建hBMP2真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞，β-TCP可促進(jìn)細(xì)胞分化，分化后的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和生物學(xué)行為。β-TCP具有很好的誘導(dǎo)MC3T3-E1分化成骨的能力，經(jīng)ALP及RT-PCR鑒定，結(jié)果表明MC3T3-E1細(xì)胞能夠成功表達(dá)目的蛋白。郝偉等[13]基于脂肪干細(xì)胞I型膠原凝膠PLGA-β-TCP支架的新型仿生骨組織工程也已經(jīng)證明復(fù)合支架材料的生物性能明顯優(yōu)于材料復(fù)合培養(yǎng)之前分別對(duì)成骨細(xì)胞成骨能力的影響。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明含hBMP2為目的基因的質(zhì)粒DNA修飾的納米級(jí)β-TCP/膠原溶液的復(fù)合材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨能力的影響優(yōu)于3 種材料分別對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響。

綜上所述，負(fù)載BMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的生物相容性、優(yōu)良的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，具有良好的臨床應(yīng)用前景，是一種理想的骨缺損修復(fù)材料?？梢詰?yīng)用于口腔種植修復(fù)、口腔頜面外科及其與口腔正畸聯(lián)合修復(fù)骨缺損治療中。

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Theeffectsofβtricalciumphosphate/collagenscaffoldloadedwithhumanbonemorphogeneticprotein2plasmidontheosteogenesisabilityofMC3T3-E1cells

ZHAOGang,ZENGJuan,LIDechao,DINGYuansheng,ZHUXujia,SONGTianxi.

154007,JiamusiUniversitySchoolofStomatology,China

Objective: To study the effects of beta tricalcium phosphate(β-TCP)/collagen scaffold loaded with human bone morphogenetic protein 2(hBMP2) plasmid on the osteogenesis ability of MC3T3-E1 cells.MethodshBMP2 DNA plasmid-modified β-TCP/collagen scaffold and the naked plasmid(control) were constructed. MC3T3-E1 cells were respectivelyinvitrocultured onto the β-TCP/collagen scaffold with hBMP2(Z) and with control plasmid(Z0),on peace dish with the saffold and hBMP2(M) and with the control plasmid(M0). The surface morphology of the samples was observed by SEM. Osteogenesis of the cells was examined by alkaline phosphatase activity(ALP) test, real-time fluorescent quantitative PCR for the detection of Runx2, OCN, ALP and OPN mRNA expression. Data were statistically analyzed.ResultsThe composite sample surface of plasmid DNA containing hBMP2 modified β-TCP/collagen was porous; group Z and M showed highter ALP activity and higher mRNA expression of Runx2, OCN, ALP and OPN than group Z0 and M0; so did group Z than group M.ConclusionPorous β-TCP/collagen scaffold loaded with BMP2 DNA is potential for osteoinduction.

BMP2；β-TCP/collagen；Osteogeneticability；Bonedefect

黑龍江省自然科學(xué)基金(編號(hào)： H201487)

154007， 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科

趙剛 E-mail： 13504545575@126.com

R329.24

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.006

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-07)