姜黃素對豬圓環(huán)病毒滅活苗細胞免疫效果的影響

余建國，周 立

（浙江省金華職業(yè)技術學院，金華 321007）

·簡報·

姜黃素對豬圓環(huán)病毒滅活苗細胞免疫效果的影響

余建國，周 立

（浙江省金華職業(yè)技術學院，金華 321007）

為評價姜黃素對豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）滅活疫苗在仔豬免疫效果中的作用，將60頭三元雜交仔豬隨機平均分成3組，Ⅰ組于14日齡注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素0.5 mL，Ⅱ組于14日齡注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素1 mL，對照組于14日齡接種PCV2滅活疫苗1頭份。結果顯示，Ⅰ組和Ⅱ組仔豬淋巴細胞轉化率均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義，外周血NK細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量也顯著增加。結果表明PCV2滅活疫苗與姜黃素聯(lián)合應用，可提高仔豬對PCV2的細胞免疫水平，且在一定劑量范圍內，姜黃素濃度增加有利于免疫活性的增強。

姜黃素；PCV2；滅活疫苗；細胞免疫；仔豬

豬圓環(huán)病毒病是當前一種重要的豬傳染病，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）滅活疫苗有較好的安全性和免疫保護效力[1]，但臨床應用發(fā)現(xiàn)，PCV2滅活疫苗免疫后存在空白期比較長，免疫保護期比較短等缺點。

姜黃素是一種黃色素，從姜黃中提取，多用于食品著色，是一種常用的天然色素。諸多研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗人免疫缺陷病毒等作用[2]，且副作用極小，藥源穩(wěn)定，提取便利，在臨床上得到廣泛的使用。安全性評估研究表明姜黃素具有較好的耐受性，是一種具有廣泛應用前景的新藥。

目前，國內外對姜黃素的研究主要集中于藥物代謝動力學以及抗腫瘤、抗炎和抗病毒效應，而對機體的免疫調節(jié)研究較為少見，關于免疫調節(jié)的機制更是鮮見報道。姜黃素對自由基的清除作用和誘導凋亡的作用都提示它存在免疫調節(jié)的潛力。具有鄰二羥基基因的姜黃素在抗氧化過程中，會產生穩(wěn)定性很好的醌類物質，使其成為抗氧化物質的冠軍。姜黃素具有較強的抗自由基，抗脂質過氧化和穩(wěn)定細胞膜的作用，可抑制氧自由基的產生，增加谷胱甘肽的水平，進而保護機體組織器官免受侵害[3]。有研究表明，姜黃素能促進淋巴細胞轉化，刺激B細胞增殖、分化和免疫球蛋白產生，促進T細胞生長[4]。本試驗將中藥姜黃素與豬PCV2滅活疫苗聯(lián)合應用，研究其對仔豬細胞免疫效果的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料與儀器 姜黃素溶液（1 g/mL滅菌懸液）由安吉豐牧獸藥公司提供(中試液）；PCV2滅活疫苗（WH株）購自中牧股份有限公司（150918）；豬圓環(huán)病毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒購自杭州康嘉動物營養(yǎng)科技公司；Uritest－3000型全自動血細胞分析儀為優(yōu)利特集團有限公司產品。

1.2 試驗豬的選擇與分組 選用溫嶺市某豬場提供的遺傳背景相近、經ELISA檢測PCV2抗體一致（P＞0.05）的14日齡“杜洛克×（長白×大約克）”三元雜交健康仔豬60頭，隨機分為3組。常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由采食和飲水。Ⅰ組于14日齡頸部肌肉注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素0.5 mL混合液；Ⅱ組于14日齡頸部肌肉注射PCV2滅活疫苗1頭份+姜黃素1 mL 混合液；對照組于14日齡頸部肌肉接種PCV2滅活疫苗1頭份+1 mL生理鹽水混合液。

1.3 樣品的采集 免疫后d21、35、49，分別從各組隨機選取5頭仔豬，每頭仔豬采集靜脈血液2份。其中，1份2 mL肝素鈉抗凝，用于血液淋巴細胞轉化試驗；1份EDTA-K2抗凝血1 mL，用于血細胞分類計數(shù)。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血液淋巴細胞轉化率測定 參照文獻[5]，采用四甲基偶氮唑鹽法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。

1.4.2 NK細胞活性測定實驗 采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定法。免疫后d21、35、49，分別從各實驗組隨機選取3頭仔豬，處死后無菌取脾臟，進行研磨，制成單個細胞懸液；離心，棄上清，將細胞加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細胞后加入0.5 mL的2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液；離心，將細胞懸浮于1640培養(yǎng)液中，用1%冰醋酸稀釋，計數(shù)并調整細胞濃度為2×107個/mL。實驗前24 h將靶細胞（YAC - 1細胞）傳代培養(yǎng)，調整細胞濃度為4×105個/mL。取YAC-1細胞和培養(yǎng)液各100 μL加入96孔培養(yǎng)板，YAC-1細胞自然釋放孔加YAC-1細胞和培養(yǎng)液各100 μL，YAC-1細胞最大釋放孔加YAC-1細胞和1%1640各100 μL，均設3個重復[6]。5%CO2條件下37℃孵箱培養(yǎng)4 h，離心，取上清100 μL。置于96孔培養(yǎng)板，同時加入LDH基質液100 μL，反應5 min，每孔加入1 mol/L的HCl30 μL，酶標儀于490 nm處檢測光密度值，取3個數(shù)平均值。

1.4.3 外周血細胞分類計數(shù)的測定 采用全自動血細胞分析儀（Uritest－3000）測定對外周血細胞分類計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和LDS多重比較。

2 結果與討論

2.1 姜黃素對仔豬淋巴細胞轉化率的影響 采用MTT法測定血液淋巴細胞轉化率，結果顯示，I組和II組不同日齡仔豬淋巴細胞轉化率均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ⅱ組不同日齡仔豬淋巴細胞轉化率均高于試驗Ⅰ組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。結果表明，姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能顯著提高細胞免疫活性，且在一定劑量范圍內，隨姜黃素濃度增加而增強?？梢?，PCV2滅活疫苗加入外源性姜黃素，淋巴細胞增殖反應上升，明顯提高血液中淋巴細胞轉化能力，有效促進仔豬的細胞免疫功能，這與金光明等[7]研究結果相一致。

姜黃素在體外能直接促進或協(xié)同細胞表達的凝集素ConA，促進仔豬脾臟T淋巴細胞的增殖反應，加速細胞免疫機能的完成[8]，從而加強對外界刺激的免疫應答。姜黃素能提高T淋巴細胞的轉化率，且與劑量有關，推測該機制與抑制免疫細胞NF-κB的活化有關。

表1 姜黃素對仔豬血液淋巴細胞轉化率的影響Table 1 Effect of curcumin on lymphocyte transformation rate of piglets

2.2 姜黃素對仔豬NK細胞活性的影響 采用LDH法測定血NK細胞活性，結果顯示實驗組不同日齡NK細胞活性均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Ⅱ組不同日NK細胞活性均高于Ⅰ組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2），表明姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫能顯著提高NK細胞免疫活性，且在一定劑量范圍內，隨姜黃素濃度增加而增強。

結果提示，姜黃素能通過持續(xù)增強仔豬NK細胞的活性，表現(xiàn)出一定的免疫增強作用。活化的NK細胞可以合成和分泌細胞因子，發(fā)揮和調節(jié)免疫和造血作用以及直接殺死靶細胞作用。加入姜黃素后，NK細胞活性明顯提高，原因可能是姜黃素具有較強的抗自由基、抗脂質過氧化和穩(wěn)定細胞膜作用, 并可抑制黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶的轉化，從而抑制氧自由基產生，增加谷胱甘肽的水平，進而保護機體組織器官免受侵害[9,10]。

表2 姜黃素對仔豬NK細胞活性的影響(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

表2 姜黃素對仔豬NK細胞活性的影響(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

注: 同列標有不同小寫字母者表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 標有不同大寫字母者差異極顯著(P＜0.01)，標有相同字母者表示差異不具有顯著統(tǒng)計學意義(P＞0.05)Note: The values with different superscripts letter in the same column indicated there were signi fi cant difference between groups(P＜0.05), with the same superscripts capital letter indicated insigni fi cant difference(P＞0.05)

天數(shù)Days組別Group NK細胞活性NK cell activity（%）21試驗Ⅱ組67.25±10.58a試驗Ⅰ組58.25±13.33b對照組48.53±9.87c 35試驗Ⅱ組76.95±14.13a試驗Ⅰ組64.78±13.42b對照組49.64±12.62c 49試驗Ⅱ組83.67±8.57a試驗Ⅰ組74.24±13.64b對照組65.73±6.89c

2.3 姜黃素對仔豬外周血細胞分類計數(shù)的影響 采用全自動血細胞分析儀對外周血細胞分類計數(shù)，結果顯示，首免后21 d和35 d試驗組外周血白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量高于對照組和空白組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），首免后35 d對照組外周血白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量高于空白組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），紅細胞和中性粒細胞數(shù)量有上升的趨勢，但差異不具備顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1），表明姜黃素與PCV2滅活疫苗聯(lián)合免疫比單獨使用PCV2滅活疫苗免疫能增加外周血白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量，增強細胞免疫功能。

血細胞是參與機體免疫反應的主要成分[11,12]，本研究中，實驗組比對照組仔豬外周血紅細胞和中性粒細胞數(shù)量有所上升，外周血白細胞數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量顯著增加，這在一定程度上說明姜黃素對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能的提高有促進作用，有利于提高機體非特異性免疫力和清除體內的病原微生物，增強細胞免疫功能。

圖1 姜黃素對仔豬外周血細胞分類計數(shù)的影響Fig.1 Effects of curcumin on peripheral blood cell differential counts of piglets

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ENHANCEMENT OF CURCUMIN ON IMMUNE RESPONSE OF INACTIVATED PORCINE CIRCONVIRUS TYPE 2 VACCINE IN PIGS

YU Jian-guo, ZHOU Li

(Jinhua Polytechnic, Zhejiang Province, Jinhua 321007, China)

The purpose of this experiment was to evaluate the enhancement effect of curcumin on inactivated Porcine circovirus type 2(PCV2) vaccine. Sixty piglets were randomly divided into 3 groups, 20 pigs each and immunized at 14-days old. The piglets in group 1 were injected with one dose of PCV2 vaccine plus 0.5 mL curcumin liquid, group 2 with one dose of PCV2 vaccine plus 1 mL curcumin liquid and group 3 with one dose of PCV2 vaccine only. Blood samples were collected and lymphocyte transformation was examined. The results showed signi fi cantly higher lymphocyte transformation in curcumin groups 1 and 2 than non-curcumin control group as evaluated from lymphocyte and NK cell counts.

Curcumin; PCV2; inactivated vaccine; cellular immunity; piglets

R282.710.5

B

1674-6422（2017）05-0060-04

2016-08-16

浙江省公益科技項目（2011c22093）

余建國，男，副教授，主要從事動物傳染病及免疫教學科研工作

余建國，E-mail：yjg-74@163.com