新孢子蟲NcSRS2和NcSAG1重組蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答

劉夢麗，許正茂，吉爾格勒，張 楊，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，庫爾勒841000）

新孢子蟲NcSRS2和NcSAG1重組蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答

劉夢麗1，許正茂1，吉爾格勒2，張 楊1，巴音查汗1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，庫爾勒841000）

為了研究新孢子蟲NcSRS2和NcSAG1重組蛋白對動(dòng)物的免疫效果，利用重組表達(dá)的NcSRS2和NcSAG1蛋白與弗氏佐劑混勻后免疫BALB/c小鼠，檢測小鼠抗新孢子蟲抗體水平和血清中IL-4和IFN-γ含量。結(jié)果表明，免疫后的BALB/c小鼠IgG、IgG2a和IFN-γ抗體表達(dá)水平升高，IgG1抗體和IL-4表達(dá)水平也升高，表明NcSRS2和NcSAG1重組蛋白可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫反應(yīng)，且NcSRS2重組蛋白的免疫增強(qiáng)效果與NcSAG1重組蛋白免疫組的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果為研制高效安全的抗新孢子蟲的新型疫苗提供了參考。

新孢子蟲；重組蛋白；NcSRS2；NcSAG1

新孢子蟲病是由犬新孢子蟲寄生于多種動(dòng)物共患的一種胞內(nèi)寄生性原蟲病。犬既是它的中間宿主也是終末宿主。新孢子蟲可感染牛等多種動(dòng)物，造成母畜流產(chǎn)、產(chǎn)出木乃伊胎、死胎、繁殖障礙等經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。還能使患病動(dòng)物體重減輕、營養(yǎng)不良，造成產(chǎn)奶量下降和飼養(yǎng)費(fèi)用的浪費(fèi)，以及產(chǎn)生對奶牛的撲殺、更換、對環(huán)境造成污染所帶來間接的費(fèi)用和損失[5-7]。目前還沒有能夠預(yù)防新孢子蟲病的疫苗投入市場的有關(guān)報(bào)道。新孢子蟲重組蛋白因具有較強(qiáng)免疫作用，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫，所以成為新孢子蟲病疫苗研究的熱點(diǎn)[8]。為此，本文對新孢子蟲的重組蛋白疫苗展開研究，旨在為抗新孢子蟲感染的新型疫苗研發(fā)及進(jìn)一步篩選研究提供基礎(chǔ)信息。

在疫苗的研究方面，抗原的獲得是重要途徑之一。新孢子蟲表面抗原是新孢子蟲粘附和侵入宿主細(xì)胞的重要抗原，也是新孢子蟲疫苗最有希望的候選抗原[9]。已有研究結(jié)果證明，表面抗原NcSAG1可激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且可產(chǎn)生IFN-γ和IL-4，宿主感染新孢子蟲后腦內(nèi)新孢子蟲的數(shù)量顯著降低[10-12]。Nishikwa等[13]分別用攜帶有NcSRS2和NcSAG1基因的重組痘苗病毒免疫BALB/c小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生了保護(hù)性免疫力，且NcSRS2的免疫效果較NcSAG1好，表明融合疫苗的效果可以更好的預(yù)防新孢子蟲對宿主動(dòng)物的感染。

新孢子蟲可感染多種中間宿主動(dòng)物，其中危害最大的是奶牛，但奶牛成本高，體格碩大，因此研究有一定的局限。由于小鼠感染模型較為常見[14]。且近交系小鼠更易感新孢子蟲[15]，如C57BL/6和BALB/c小鼠。因此本實(shí)驗(yàn)利用新孢子蟲重組蛋白苗對BALB/c小鼠的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平進(jìn)行評估，從而檢驗(yàn)重組蛋白苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 HRP-山羊抗小鼠抗體、山羊抗小鼠IgG1抗體和山羊抗小鼠IgG2a抗體購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；弗氏佐劑購自Sigma生物公司；玻璃毛細(xì)管、山羊抗小鼠IgG抗體、小鼠IL-4檢測試劑盒和小鼠IFN-γ檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 50只 6～8 周齡BALB/c小鼠購自于新疆醫(yī)科大學(xué)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.3 主要儀器 JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；5452EH981575低溫水平離心機(jī)購自Eppendorf公司；SPX-70L生化培養(yǎng)箱購自北京中儀國科科技有限公司；SYNERGY酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQLS-50A立式壓力蒸汽滅菌器購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BCD-196F 低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將50 只6～8 周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：對照組、弗氏佐劑組、NcSRS2重組蛋白苗組(NcSRS2+弗氏佐劑)、NcSAG1重組蛋白苗組(NcSAG1+弗氏佐劑)、聯(lián)合組（NcSRS2+NcSAG1+佐劑），每組10只小鼠。

1.4.2 重組蛋白疫苗的制備 NcSRS2重組蛋白疫苗組，蛋白濃度為1 mg/mL，50 μL/只，弗氏佐劑50 μL/只；NcSAG1重組蛋白疫苗組，蛋白濃度為1 mg/mL，50 μL/只，弗氏佐劑50 μL/只；聯(lián)合組，NcSRS2蛋白 25 μL/只，NcSAG1蛋白 25 μL/只，蛋白濃度均為1 mg/mL，弗氏佐劑50 μL/只。

1.4.3 重組蛋白疫苗的無菌試驗(yàn) 將制備好的三種重組蛋白疫苗，分別接種于普通瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無細(xì)菌長出。無菌長出方可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫 分別用相應(yīng)的重組蛋白疫苗對3組小鼠進(jìn)行免疫，共免疫3 次。第1次用弗氏不完全佐劑配制成相應(yīng)疫苗，第2次和第3次用弗氏完全佐劑配制成相應(yīng)疫苗。對照組免疫同體積的無菌PBS；佐劑組免疫同體積的佐劑；其余3組，佐劑體積與重組蛋白體積相同，所用重組蛋白為50 μL/只，免疫途徑均為腹腔注射，每只小鼠免疫量為100 μL/只。每次免疫間隔10 d，免疫結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行尾尖采血，5165×g離心10 min，在冰上析出血清，運(yùn)用間接ELISA方法檢測血清中IgG、IgG1及IgG2a的抗體水平。3免后1周，對各組小鼠進(jìn)行眼齜靜脈采血，用小鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒按照操作說明對血清內(nèi)的細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平進(jìn)行測定。

1.4.5 重組蛋白苗安全性檢驗(yàn) 分別對NcSRS2重組蛋白苗組、NcSAG1重組蛋白苗組、NcSRS2+NcSAG1聯(lián)合蛋白苗組進(jìn)行安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，觀察各組小鼠覓食、精神狀態(tài)有無異常，注射部位有無病變壞死。

1.4.6 檢測血清中IgG、IgG1及IgG2a的抗體 用已純化的重組NcSRS2蛋白和NcSAG1蛋白和包被酶標(biāo)板，每孔100 μL（含重組蛋白0.5 μg），4℃過夜，用PBST清洗3 次后拍干；加入5%的脫脂乳200 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST清洗3次后拍干；加入血清樣品（1:200），37℃孵育2 h，PBST清洗3 次后拍干；加入IgG、IgG1或IgG2a抗體（1:2000）稀釋，37℃孵育2 h，PBST 清洗3次后拍干；加入 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，PBST 清洗3 次后拍干；加入底物溶液（0.75% H2O2），37℃孵育10 min，在加入終止液（2 mol/L H2SO4），用酶標(biāo)儀測OD490處的吸光度值。每次每板同時(shí)設(shè)立陰性血清對照組和空白組，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.7 檢測免疫血清中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平 將小鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒室溫放置30 min，取出酶標(biāo)板，先將標(biāo)準(zhǔn)品按比例進(jìn)行稀釋，在酶標(biāo)包被板上加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min. 用清洗液（濃縮洗滌液用ddH2O按1:30 稀釋）清洗酶標(biāo)板5次拍干；在每孔中加入酶標(biāo)試劑50 μL，（空白對照孔中不加），用封板膜封板后，置37℃溫育30 min；再次洗板重復(fù)5次后，每孔依次加入50 μL顯色劑A、50 μL顯色劑B，混勻后37℃下避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀測OD450處的吸光度值。用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 無菌試驗(yàn)結(jié)果 將三組重組蛋白苗分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察得出三組重組蛋白苗均無細(xì)菌長出。

2.2 安全性試驗(yàn)結(jié)果 觀察三次注射疫苗后的實(shí)驗(yàn)小鼠，發(fā)現(xiàn)覓食正常，精神狀態(tài)良好，無任何異常反應(yīng)，注射部位無病變壞死。三免后10 d將小鼠處死解剖，取其疫苗注射部位組織，將組織制成懸液后接種于普通瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，均無發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長，結(jié)果表明重組蛋白苗安全性較好。

2.3 免疫小鼠后IgG、IgG1、IgG2a抗體水平的測定 每次免疫1周測血清中IgG、IgG1、IgG2a抗體效價(jià)（OD490）。結(jié)果表明，血清中的抗體效價(jià)隨著免疫次數(shù)的增加而增高，IgG和IgG1抗體在一免后與對照組和佐劑組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在二免后差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1和圖2）。IgG2a抗體在三免后與對照組和佐劑組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

圖1 IgG抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig.1 IgG antibody titer determination

圖2 IgG1抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig.2 IgG1 antibody titer determination

圖3 IgG2a抗體效價(jià)測定結(jié)果Fig.3 IgG2a antibody titer determination

圖4 血清內(nèi) IL-4的測定結(jié)果Fig.4 The levels of IL-4 determination

圖5 血清內(nèi)IFN-γ的測定結(jié)果Fig.5 The levels of IFN-γ determination

2.4 細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的測定結(jié)果 三免后的1周，對小鼠進(jìn)行眼齜靜脈采血并制備血清，利用小鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒對血清內(nèi)的細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ進(jìn)行測定。結(jié)果表明，NcSRS2重組蛋白苗組免疫血清中IL-4和IFN-γ水平極顯著高于對照組和弗氏佐劑組（P＜0.01），顯著高于NcSAG1重組蛋白苗組和NcSRS2+NcSAG1聯(lián)合組（P＜0.05）（圖4和圖5）。

3 討論

新孢子蟲是一種寄生于有核細(xì)胞內(nèi)的原蟲，在其感染宿主過程中可以激發(fā)宿主體內(nèi)的Th1、Th2型免疫應(yīng)答，尤其在研究重組蛋白苗的過程中，評定疫苗效果的一個(gè)重要指標(biāo)往往就是看血清中抗體以及細(xì)胞因子水平的變化[16,17]，之所以重組蛋白抗原能大量的用于疫苗領(lǐng)域，除考慮重組抗原的天然結(jié)構(gòu)之外，佐劑的選擇也是制備重組蛋白苗最關(guān)鍵的步驟之一，目前制備疫苗應(yīng)用最為廣泛的佐劑是弗氏佐劑，它能夠?qū)C(jī)體可產(chǎn)生程度不同的免疫增強(qiáng)作用[18]。本試驗(yàn)對照組的小鼠抗體產(chǎn)生緩慢，且效價(jià)低，加入佐劑后小鼠抗體的產(chǎn)生較快，由此可知在提高疫苗的免疫效果方面佐劑起著至關(guān)重要的作用。

新孢子蟲的體液免疫研究主要體現(xiàn)在對IgG抗體的研究上，IgG亞群抗體的研究集中在IgG1、IgG2a上。當(dāng)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ激發(fā)IgG2a的抗體水平，Th2型細(xì)胞因子IL-4水平可上調(diào)B細(xì)胞分泌的IgG1抗體水平。結(jié)合IgG、IgG1、IgG2a效價(jià)結(jié)果，由于Th1型免疫反應(yīng)的主要指標(biāo)是IgG2a抗體和IFN-γ，Th2型免疫反應(yīng)的主要指標(biāo)是IgG1和IL-4[19]，抗體和細(xì)胞因子的升高表明NcSRS2和NcSAG1都可激發(fā)機(jī)體的Th1和Th2型免疫反應(yīng)。

本研究在小鼠體內(nèi)探討了該疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，基于小鼠模型的研究,下一步的工作是測定小鼠的保護(hù)性效果，為后期將新孢子蟲重組蛋白苗應(yīng)用到本體動(dòng)物牛身上，看是否該疫苗在本體動(dòng)物上也同樣能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫效果，更有力地驗(yàn)證疫苗的免疫效力奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)新型疫苗提供新思路。

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IMMUNE RESPONSES OF RECOMBINANT NCSRS2 AND NCSAG1 PROTEINS OF NEOSPORA CANINUM IN MICE

LIU Meng-li1, XU Zheng-mao1, JI Ergele2, ZHANG Yang1, BA Yinchahan1

(1.Veterinary Medicine College of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. BaYin Guoleng Technology College, Korla 841000, China)

The objective of the present study was to investigate immune responses of recombinant proteins NcSRS2 and NcSAG1 of Neospora caninum in mice. BALB/c mice were immunized with recombinant NcSRS2 and NcSAG1 proteins emulsified in Freund's adjuvant and blood samples were collected for detection of IgG, IgG1, IgG2a, IL-4 and IFN–γ expression levels using ELISA methods.The results indicated that both proteins elicited Th1 immune response with elevated IgG2a and IFN-γ levels and Th2 immune response with elevated IgG1 and IL-4 levels. In addition, NcSRS2 induced signi fi cantly higher (P＜0.05) immune response than NcSAG1. This study provided a reference for the study of NcSRS2 and NcSAG1 recombinant protein vaccine against N.caninum.

Neospora caninum; recombinant protein; NcSRS2; NcSAG1

S852.72

A

1674-6422（2017）05-0047-06

2017-01-14

新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目（201454129）

劉夢麗，女，碩士，主要從事動(dòng)物寄生蟲學(xué)及免疫學(xué)的研究

巴音查汗，E-mail：2514062881@qq.com