日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞M1型極化

艾 敏，史曉娜,2，苑純秀,3，趙小超，李玉梅,2，侯旖旎,2，馮新港

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞M1型極化

艾 敏1，史曉娜1,2，苑純秀1,3，趙小超1，李玉梅1,2，侯旖旎1,2，馮新港1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

通過(guò)分析日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1（Schistosoma japonicum high mobility group protein B1，SjHMGB1）刺激的巨噬細(xì)胞的表型相關(guān)分子的表達(dá)情況，研究SjHMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化的功能。分別用LPS及IFN-γ和IL-4誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞成M1型和M2型作為陽(yáng)性對(duì)照組，以SjHMGB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。分別利用Griess法、FCM、RTPCR和酶活性檢測(cè)巨噬細(xì)胞中iNOS、CD16/32、ArginaseⅠ、CD206等主要標(biāo)志分子。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，SjHMGB1刺激組和M1型陽(yáng)性對(duì)照組巨噬細(xì)胞NO分泌顯著增加，精氨酸酶活性變化不顯著，M2型巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)相反的表型。流式結(jié)果顯示SjHMGB1刺激組和M1型陽(yáng)性對(duì)照組的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）和CD16/32表達(dá)上調(diào)，而CD206變化不明顯。RT-PCR結(jié)果顯示SjHMGB1蛋白刺激組和M1型陽(yáng)性對(duì)照組的巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)上調(diào)，而arginaseⅠ和CD206變化不明顯；M2型巨噬細(xì)胞arginaseⅠ表達(dá)水平明顯升高，CD206表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明SjHMGB1能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞往M1型巨噬細(xì)胞分化。

SjHMGB1蛋白；M1型巨噬細(xì)胞；精氨酸酶；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶

日本血吸蟲病是一種人畜共患寄生蟲病，在我國(guó)主要流行于長(zhǎng)江流域和洞庭湖、鄱陽(yáng)湖等湖區(qū)，截止2015年底仍有二十多萬(wàn)人受到血吸蟲病的困擾[1]。目前吡喹酮化療在血吸蟲病防治中具有重要作用，但長(zhǎng)時(shí)間使用吡喹酮導(dǎo)致耐藥蟲株的產(chǎn)生越來(lái)越引起人們的關(guān)注和憂慮[2]。因此，開發(fā)安全高效的抗血吸蟲疫苗來(lái)控制血吸蟲病顯得尤為急迫[3]。研究人員基于輻照致弱（radiation-attenuated，RA）疫苗保護(hù)性免疫的有效機(jī)制，提出了抗血吸蟲病分子疫苗的研制思路。RA血吸蟲尾蚴免疫小鼠后，在肺部誘導(dǎo)了以CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1型為主的高保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中來(lái)源于T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的IFN-γ和TNF-ɑ等炎性因子發(fā)揮了重要的效應(yīng)功能[4,5]，但是這種免疫微環(huán)境的形成和作用機(jī)制仍然不清楚。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱“本實(shí)驗(yàn)室”）的初步研究表明，日本血吸蟲高遷移率族蛋白B1（Schistosoma japonicum high mobility group protein B1，SjHMGB1）作為一類蟲源性的應(yīng)激分子，可能在RA血吸蟲童蟲誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫中起到重要作用，其機(jī)制可能是通過(guò)其刺激宿主免疫細(xì)胞，形成Th1型極化的先天免疫微環(huán)境，進(jìn)而參與免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮免疫保護(hù)作用[6]。

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種染色質(zhì)相關(guān)的核蛋白，也是細(xì)胞外損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子，是細(xì)胞死亡和存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)組分[7]。當(dāng)機(jī)體組織損傷時(shí)釋放內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，HMGB1非特異性地與DNA結(jié)合，可通過(guò)核孔穿梭于胞核和胞漿，遇到危險(xiǎn)刺激時(shí)釋放到細(xì)胞外發(fā)揮作用[8]。研究表明，HMGB1是一種能夠介導(dǎo)感染、損傷和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子[9]，可參與炎癥反應(yīng)的全身性應(yīng)答和局部反應(yīng)[10]。曼氏血吸蟲來(lái)源的HMGB1（SmHMGB1）通過(guò)誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞釋放大量的TNF-ɑ、IL-6、IL-13等炎性細(xì)胞因子，在宿主血吸蟲相關(guān)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[11]；與此同時(shí)，磷酸化的SmHMGB1也可調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)輸與分泌[12]。反過(guò)來(lái)，活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠分泌HMGB1[13]，也能通過(guò)自身耗竭間接減少炎癥，調(diào)節(jié)趨化因子產(chǎn)物，招募效應(yīng)T細(xì)胞到肺，最終形成肺部炎性反應(yīng)環(huán)境[14]。本實(shí)驗(yàn)室李丹丹等[6]發(fā)現(xiàn)SjHMGB1能夠通過(guò)TLR2/TLR4途徑活化巨噬細(xì)胞，釋放TNF-ɑ、IL-1β等炎性細(xì)胞因子。

本研究用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系為模型，通過(guò)分析SjHMGB1刺激的巨噬細(xì)胞表型相關(guān)分子的表達(dá)情況，研究SjHMGB1是否具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化的功能，旨在為深入研究RA血吸蟲童蟲誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫的細(xì)胞核分子機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 蛋白 SjHMGB1蛋白由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)[15]。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（Gibco，11995-065）、胎牛血清（Gibco，10099-141）、TRYPSIN 0.25% EDTA（Gibco，25200072）、小鼠重組IFN-γ（Peprotech）、IL-4（Peprotech）等購(gòu)自上海達(dá)科為生物科技有限公司；LPS（Sigma）購(gòu)自上海少辛生物科技有限公司；TRIZOL REAGENT（Ambion，15596018）購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；DEPC水（Solarbio）；NO檢測(cè)試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；QuantiChromTMArginase Assay Kit (BioAssay Systems, DARG-200)試劑盒購(gòu)自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；SYBR? Premix ExTaq（TaKaRa，RR420A）、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，RR047A）等購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD206（BD Pharmingen）、PE/Cy7標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD16/32（BD Pharmingen）、PE標(biāo)記的兔抗小鼠iNOS（CST）等購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物 由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7巨噬細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)及體外刺激 RAW264.7巨噬細(xì)胞系用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃ 5%CO2的生化培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。該細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，先用PBS洗去培養(yǎng)基，再加入2 mL、TRYPSIN 0.25% EDTA/5 mL DMEM消化25～30 min后，用PBS洗去胰酶，最后用完全培養(yǎng)基脫落細(xì)胞，48 h傳代1次。收集成熟的巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)成2×106cells/mL，2×106cells/孔鋪于24孔板，以IFN-γ（100 U/mL）和LPS（200 ng/mL）共同刺激培養(yǎng)24～48 h，誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞；以IL-4（10 ng/mL）刺激培養(yǎng)24～48 h誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞；SjHMGB1 50 μg/mL刺激培養(yǎng)24～48 h，同時(shí)以100 μL PBS為空白對(duì)照組。

1.2.2 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活性檢測(cè) 收集上述培養(yǎng)24 h的細(xì)胞上清，按照說(shuō)明書要求取50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，每孔加入50 μL Griess R1室溫避光放置5 min；再每孔加入50 μL的Griess R2室溫避光放置5 min；540 nm測(cè)定吸光度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算NO的濃度。

1.2.3 精氨酸酶（ArginaseⅠ）活性檢測(cè) 收集刺激培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，PBS洗1次，4℃、1000×g離心10 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）含1μmol/L pepstatin A、1μmol/L leupeptin和0.4%（w/v）TritonX-100裂解10 min，RT；4℃、14 000×g離心10 min，收集上清，用于ArginaseⅠ活性檢測(cè)。設(shè)置1 mmol/L Urea standard和ddH2O組各50 μL/孔，按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。樣品組（添加arginine底物）和空白對(duì)照組（未添加arginine底物）組，37℃孵育2 h，加入200 μL Urea Reagent A和B（1:1，V/V）混合終止反應(yīng)，空白對(duì)照組再加入10 μL arginine底物，RT孵育60 min，430 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白CD206、CD16/32和膜內(nèi)蛋白iNOS的表達(dá) 刺激培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，4℃、1000×g離心5 min，細(xì)胞用200 μL 含2%BSA的PBS懸起，加入FITC-CD206、PE/Cy7-CD16/32，4℃染色30 min；用含2%BSA的PBS洗1次，4%多聚甲醛室溫固定20 min；含2%BSA的PBS洗1次，加入100 μL 0.1%皂素（含1%BSA、0.1%NaN3、0.1%saponin的PBS）室溫破膜10 min；再加入PE-iNOS染色30 min（4℃）；用預(yù)冷的PBS洗1次，400 μL PBS懸起細(xì)胞轉(zhuǎn)至流式管，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 總RNA的抽提及RT-PCR

1.2.5.1 總RNA的抽提 巨噬細(xì)胞刺激培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)上清全部棄去，PBS洗滌細(xì)胞1遍，棄去所有液體，每2×106cells加入500 μL TRIzol，脫落細(xì)胞收集至無(wú)RNase的1.5 mL EP管內(nèi)，充分震蕩裂解細(xì)胞，另加200 μL氯仿，混勻成乳狀，冰上靜置3 min，出現(xiàn)上下分層現(xiàn)象；4℃、12 000×g離心15 min，液體分成3層，從上到下依次是透明澄清液體、白色層、紅色層，收集透明液體于新的EP管中，加入600 μL的異丙醇，劇烈混勻，于-80℃放置24 h后取出。冰上溶解后加入DEPC水配制的75%乙醇（V/V）沖洗RNA，輕柔渦旋，4℃、7500×g離心5 min，吸去所有上清，保留沉淀，空氣中傾斜干燥5 min，加入10 μL RNase free water 55℃水浴鍋溶解1 min，檢測(cè)RNA濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 RT-PCR 基因組DNA的去除：將RNA稀釋成500 ng/μL，各試劑添加比例及條件如下，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、Total RNA 2μL、RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μL，42℃ 2 min，4℃?zhèn)溆?；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×PrimeScript? Buffer 2（for Real Time） 4 μL、PrimeScript? RT Enzyme MixI 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、反應(yīng)液10 μL、RNase free water 補(bǔ)足至20 μL，輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃ 5 s，4℃。按照SYBR? Premix Ex Taq說(shuō)明書使用ABI7500 real-time PCR system進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃預(yù)變性2 min；95℃預(yù)變性15 s和60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。添加擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線來(lái)確定反應(yīng)的特異性。利用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism5.0、ABI7500Software v2.0.1或FlowJo7.6.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間差異比較采用Student’s t檢驗(yàn)，P<0.05視為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01視為差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SjHMGB1蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO的影響 以Griess法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌到上清中的NO含量，由圖1可以看出，LPS和SjHMGB1的刺激能夠促使巨噬細(xì)胞分泌NO，且SjHMGB1刺激組的含量與對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。表明SjHMGB1蛋白可以刺激巨噬細(xì)胞釋放大量NO，說(shuō)明此時(shí)巨噬細(xì)胞精氨酸代謝主要是iNOS途徑。

2.2 巨噬細(xì)胞精氨酸酶（ArginaseⅠ）活性的變化 在體外培養(yǎng)條件下，參照經(jīng)典方法以IFN-γ及LPS將RAW264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞，以IL-4將其誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1蛋白刺激組的巨噬細(xì)胞精氨酸酶活性較空白對(duì)照組稍有上升，對(duì)比LPS+IFN-γ組幾乎沒(méi)有變化，對(duì)比IL-4組明顯降低，說(shuō)明SjHMGB1蛋白不能誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞合成量增加，此時(shí)精氨酸酶途徑不占主導(dǎo)地位（圖2）。

圖1 重組SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞NO釋放Fig.1 The release of NO from Macrophage stimulated by rSjHMGB1

圖2 重組SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞的精氨酸酶活性Fig.2 ArginaseⅠ activity of macrophage stimulated by rSjHMGB1

2.3 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白CD206、CD16/32和膜內(nèi)蛋白iNOS 的表達(dá) 巨噬細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的差異是鑒定不同類型巨噬細(xì)胞的重要方法。應(yīng)用FCM對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD16/32（FcγIII/FcγII receptor）、iNOS（inducible nitric oxide synthase）和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志CD206（mannose receptor）的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，SjHMGB1和LPS刺激組CD16/32、iNOS較對(duì)照組有明顯上升，而CD206沒(méi)有明顯變化（圖3）。說(shuō)明SjHMGB1蛋白可誘導(dǎo)膜表面分子CD16/32和膜內(nèi)分子iNOS表達(dá)量上升，而不能誘導(dǎo)CD206表達(dá)增加，該蛋白刺激可使巨噬細(xì)胞向M1型分化。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞CD16/32、iNOS和CD206的表達(dá)Fig. 3 The expression of CD16 / 32, iNOS and CD206 in macrophages detected by fl ow cytometry

2.4 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志及細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá) 為檢測(cè)在LPS+IFN-γ、IL-4以及SjHMGB1蛋白刺激下，巨噬細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志分子iNOS、CD206和ArginaseⅠ的情況。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)3種刺激物及空白對(duì)照組處理下，3種標(biāo)志分子的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平如圖4所示。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，SjHMGB1蛋白刺激組和LPS刺激組的巨噬細(xì)胞iNOS的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，而CD206和ArginaseⅠ的mRNA水平?jīng)]有明顯提高，進(jìn)一步說(shuō)明了SjHMGB1可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型分化。

圖4 RT-PCR分析巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志分子iNOS、CD206 和ArginaseⅠFig. 4 Analysis of macrophage - associated markers including iNOS, CD206 and ArginaseⅠby RT – PCR

3 討論

近年來(lái)的研究表明，輻照和某些藥物可以使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD），與此同時(shí)這些細(xì)胞會(huì)分泌或釋放一些損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如HMGB1、熱休克蛋白( heat shock proteins，HSPs）和ATP等，這些DAMPs分子具有免疫刺激功能，從而可以激活宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答[16]。本課題組前期研究也提示，輻照血吸蟲來(lái)源的細(xì)胞也可能具有ICD的特征，能夠分泌或釋放DAMPs分子，如SjHMGB1和SjHSP70等可分泌至細(xì)胞表面或胞外，活化小鼠巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞[17]。因此，研究RA血吸蟲尾蚴或童蟲來(lái)源的SjHMGB1和SjHSP70等分子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向致炎性的M1型方向極化的分子機(jī)理，可闡明輻照血吸蟲尾蚴或童蟲誘生的Th1極化的微環(huán)境的形成機(jī)制。

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系是用于研究固有免疫的常用細(xì)胞模型，在不同抗原的刺激下巨噬細(xì)胞可以分化為不同的表型（M1型和M2型）[6]。M1型主要被LPS、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子激活，表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而M2型分別由IL-4或IL-13誘導(dǎo)成M2a型表現(xiàn)為損傷修復(fù)，由TLRs和免疫復(fù)合物誘導(dǎo)成M2b型表現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能，由IL-10誘導(dǎo)成M2c表現(xiàn)免疫抑制效應(yīng)。M1型主要標(biāo)志分子及細(xì)胞因子有iNOS、CD16/32、TNF-ɑ、IL-6、IL-1β等，IL-12表達(dá)上調(diào)，IL-10表達(dá)下調(diào)；M2型主要標(biāo)志分子及細(xì)胞因子有Arg-1、CD206、CD163、VEGF、TGF-β等，IL-12表達(dá)下調(diào)，IL-10表達(dá)上調(diào)[18]。因此，本文通過(guò)測(cè)定SjHMGB1刺激的巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志分子，初步提示該蛋白能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化。本實(shí)驗(yàn)室李丹丹等[6]發(fā)現(xiàn)SjHMGB1蛋白刺激后，巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7表達(dá)明顯上調(diào)，具有致炎性M1型巨噬細(xì)胞的功能。至于巨噬細(xì)胞M1極化后，微環(huán)境中細(xì)胞因子變化，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

正常情況下，iNOS與ArginaseⅠ的表達(dá)和活性在巨噬細(xì)胞中受到嚴(yán)格調(diào)控，兩者的動(dòng)態(tài)平衡在維持巨噬細(xì)胞的功能穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[19]。ArginaseⅠ能夠代謝精氨酸，產(chǎn)生鳥氨酸、尿素等；而一氧化氮合酶（iNOS或NOS）則將其代謝產(chǎn)生瓜氨酸和NO，瓜氨酸再為精氨酸的合成所利用，NO作為第二信使利用或釋放[20]。有研究顯示，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO可以參與殺滅肺期血吸蟲童蟲[21,22]；ArginaseⅠ高表達(dá)的M2型巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致小鼠發(fā)生肺實(shí)變和纖維化[23]。本研究通過(guò)檢測(cè)NO含量來(lái)代表相關(guān)酶的活性，可進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞分化方向。本研究中我們主要采用測(cè)定巨噬細(xì)胞的表型標(biāo)志分子的方法，來(lái)初步鑒定小鼠巨噬細(xì)胞在SjHMGB1刺激下是否會(huì)向M1型方向極化，為深入研究RA血吸蟲尾蚴或童蟲保護(hù)性免疫的分子機(jī)制提供資料。至于RA SjHMGB1是否也通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO參與殺滅肺期血吸蟲童蟲，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本文檢測(cè)到小鼠巨噬細(xì)胞在經(jīng)過(guò)SjHMGB1刺激后，與M1型相關(guān)的表型標(biāo)志分子的表達(dá)都明顯上調(diào)，這與用IFN-γ及脂多糖（LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生的M1型巨噬細(xì)胞的相應(yīng)的表型標(biāo)準(zhǔn)分子的表達(dá)圖譜類似。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分表明SjHMGB1具有類似于致炎性細(xì)胞因子的功能，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞往M1型巨噬細(xì)胞分化，這一結(jié)果很可能與輻照血吸蟲誘生的Th1極化的微環(huán)境的形成密切相關(guān)。因此，SjHMGB1很可能是一個(gè)重要的免疫刺激分子，在RA血吸蟲尾蚴或童蟲誘導(dǎo)的高保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要的作用。

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M1 TYPE POLARIZATION OF MURINE RAW264.7 MACROPHAGES INDUCED BY HIGH MOBILITY GROUP PROTEIN B1 OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

AI Min1, SHI Xiao-na1,2, YUAN Chun-xiu1,3, ZHAO Xiao-chao1, LI Yu-mei1,2, HOU Yi-ni1,2,FENG Xin-gang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The role of Schistosoma japonicum high mobility group protein B1 (SjHMGB1) in the induction of macrophages to M1 type polarization was investigated through the analysis of expression of phenotype-related molecules on stimulated macrophages. The mouse RAW264.7 macrophages induced by LPS and IFN-γ or IL-4 respectively to M1 or M2 type were set as positive control groups. Griess,FCM, RT-PCR and enzyme activities were analyzed to detect the expression of major marker molecules including iNOS, CD16/32,arginaseⅠand CD206 in macrophages. As compared with the positive control groups, a few changes were observed, including signi fi cant increase of the NO secretion of macrophages in SjHMGB1 treatment group and M1 group, slight increase in the activity of arginaseⅠand opposite phenotype of M2 type macrophages. In addition, fl ow cytometry analysis showed signi fi cant up-regulation of the expression of iNOS and CD16/32 of macrophages in SjHMGB1 group and M1 group except CD206. RT-PCR results also indicated up-regulated expression of iNOS in SjHMGB1 group and M1 group as well as CD206 and enzyme activities of M2 macrophages. However, the expression level and arginase I did not change signi fi cantly. In conclusion, SjHMGB1 induced the differentiation of macrophages into M1 type polarization.

Schistosoma japonicum high mobility group protein B1; M1 type macrophage; arginaseⅠ; iNOS

S852.735

A

1674-6422（2017）05-0053-07

2017-03-02

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2015CB150303）

艾敏，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馮新港，E-mail：fengxingang@shuri.ac.cn