克痹寧凝膠劑對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用

陶新知，徐志立，王素娟，李洋楊，何思雨，管錫昆，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

克痹寧凝膠劑對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用

陶新知，徐志立，王素娟，李洋楊，何思雨，管錫昆，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的：探討克痹寧凝膠劑對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用.方法：建立完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型，測(cè)定繼發(fā)性足趾腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、棉球肉芽腫、血清一氧化氮含量，并觀察克痹寧對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)的影響.結(jié)果：克痹寧治療后，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的繼發(fā)性足腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、棉球肉芽腫質(zhì)量及一氧化氮含量均明顯下降，病理結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)組織水腫及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕.結(jié)論：克痹寧可降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中異常增高的一氧化氮含量，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的炎癥癥狀.

克痹寧凝膠劑；佐劑性關(guān)節(jié)炎；抗炎

0 引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）為全球分布的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎，是使人類喪失勞動(dòng)力和致殘的主要疾病之一［1］.RA的發(fā)病原因仍未完全清楚，目前尚無(wú)根治藥物及根治方案，治療目的主要是緩解癥狀，保持關(guān)節(jié)功能，提高生活質(zhì)量.常用的藥物包括非甾體類抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）、慢作用抗風(fēng)濕藥（slow?acting antirheumatic drugs，SAARDs）及糖皮質(zhì)激素類（glucocorticoid，GC）［2］.雖然各類藥物對(duì)RA的臨床癥狀均有不同程度的緩解，但長(zhǎng)期用藥后會(huì)發(fā)生如消化道潰瘍、骨髓抑制、免疫力低下、肝腎損害及心臟毒性等多種不良反應(yīng)，從而導(dǎo)致治療中斷、治療失敗甚至藥源性疾病.

中醫(yī)藥治療RA療效確切，不良反應(yīng)少，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).中醫(yī)辨證之“痹證”的臨床表現(xiàn)，西醫(yī)學(xué)中的風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等均屬于本病的范疇.“痹證”是因機(jī)體感受風(fēng)寒濕熱之邪，閉阻經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢等引起的病證，主要癥狀為肢體關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、酸楚、麻木、重著以及活動(dòng)不利等［3］.關(guān)于治療RA的中藥及方劑的藥理作用及作用機(jī)制研究始終是中醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，近年來(lái)采用中藥復(fù)方綜合治療取得了較大進(jìn)展，在緩解癥狀、改善證候方面具有不可替代的臨證價(jià)值［4］.

克痹寧凝膠劑來(lái)源于由獨(dú)活、杜仲、桑寄生、威靈仙、丹參等15味中藥組成的臨床驗(yàn)方，在此基礎(chǔ)上遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院采用現(xiàn)代工藝將其制備為使用方便、價(jià)廉、安全、穩(wěn)定的中藥凝膠制劑.為考察克痹寧凝膠劑對(duì)RA的治療活性，本研究采用經(jīng)典的完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant?induced arthritis，AA）結(jié)合風(fēng)、寒、濕刺激，制備AA大鼠動(dòng)物模型［5］，觀察克痹寧凝膠劑對(duì)RA的抗炎作用，為其進(jìn)一步開發(fā)與臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2010?0001.動(dòng)物飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，控制照明時(shí)間為14 h.適應(yīng)兩周后開始實(shí)驗(yàn).

1.2 藥品與試劑方中藥材（杜仲、桑寄生、威靈仙、丹參、地龍、生地、木瓜、烏梢蛇、三七、獨(dú)活、紅花、白芍、雞血藤、當(dāng)歸、蜈蚣）購(gòu)自大連市國(guó)藥大藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王榮祥教授鑒定為正品.干燥藥材分別經(jīng)醇提（白芍、杜仲、威靈仙、桑寄生、丹參、三七、獨(dú)活、紅花）或水提（生地、地龍、雞血藤、當(dāng)歸、蜈蚣、烏梢蛇、木瓜）后，由旋蒸儀濃縮，與配制的凝膠基質(zhì)均勻混合，制備為每100 g凝膠劑中含有30 g生藥的新型中藥凝膠劑.

完全弗氏佐劑（Sigma，SLBM9312V）；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，20161112）.

1.3 儀器MR?96A酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；UV?5600紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；MA240D型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）；TG?16W型臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司）.

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及AA大鼠模型建造［6－8］隨機(jī)選出10只SD大鼠作為正常對(duì)照組，其余均用于造模.禁食12 h后，除正常對(duì)照組外，其余大鼠置于4℃～8℃冷水中，水面高度2 cm，30 min后取出，電風(fēng)扇吹干大鼠身體，然后于大鼠右后足墊皮內(nèi)注射CFA，0.1 mL/只，正常組大鼠注射等體積生理鹽水，連續(xù)2 d.致炎后9 d大鼠左后足相繼出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀（非致炎及雙前肢的關(guān)節(jié)紅腫），精神萎靡、毛發(fā)松散，表明AA大鼠模型建造成功.選出造模成功大鼠40只，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，高、中、低劑量組（1.2、0.6、0.3g/kg）.給藥組大鼠四肢涂抹新型中藥凝膠劑，正常組及模型對(duì)照組大鼠四肢涂抹凝膠基質(zhì).1次/d，連續(xù)28 d.

1.4.2 AA大鼠一般體征及關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI） 測(cè)定并觀察造模及給藥前后大鼠體毛色澤、神志、四肢活動(dòng)、食量增減、體質(zhì)量變化.測(cè)定AI：大鼠給藥后3 d（佐劑致炎后12 d）開始觀察記錄大鼠四肢關(guān)節(jié)病變程度，根據(jù)文獻(xiàn)［9－10］記錄臨床評(píng)分.0分：無(wú)紅腫；1分：?jiǎn)蝹€(gè)趾關(guān)節(jié)明顯紅腫；2分：數(shù)個(gè)足趾關(guān)節(jié)明顯紅腫；3分：整個(gè)足及足跖關(guān)節(jié)明顯紅腫；4分：嚴(yán)重的關(guān)節(jié)腫脹或變形.

1.4.3 AA大鼠棉球肉芽腫形成的測(cè)定［11］給藥后第18天，各組大鼠乙醚麻醉，背部正中線一側(cè)切約1 cm長(zhǎng)小口，將20 mg高壓滅菌棉球從切口處植入皮下，縫合，青霉素浸潤(rùn)傷口.第28天處死大鼠，打開切口取出棉球聯(lián)通周圍結(jié)締組織，剔除脂肪組織，70℃烘干，分析天平稱重.

1.4.4 AA大鼠的繼發(fā)性對(duì)側(cè)足腫脹度測(cè)定［12］分別在給藥后第14天（致炎后第23天），第28天（致炎后第37天）測(cè)定繼發(fā)性的左后足腫脹.腫脹率（%）＝（給藥后足掌厚度－給藥前足掌厚度）/給藥前足掌厚度×100%.

1.4.5 AA大鼠血清中NO含量測(cè)定［13］末次給藥2 h后，各組大鼠眼眶后靜脈叢采血，離心取上清，按試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定血清中NO含量.

1.4.6 AA大鼠踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀察［14］末次給藥2 h后，各組大鼠處死，取下包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個(gè)右后足，4%多聚甲醛固定48 h，10%硝酸脫鈣完全后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用IBM SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 克痹寧對(duì)AA大鼠一般癥狀及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響在免疫初期，大鼠飲食量、精神狀態(tài)、自主活動(dòng)等無(wú)明顯改變，免疫后12 d（給藥3 d），模型大鼠四肢從足趾部分開始出現(xiàn)紅、腫等炎癥表現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高（P＜0.01）.免疫16 d（給藥7 d）后大鼠四肢持續(xù)嚴(yán)重腫脹，部分大鼠在尾部、耳部出現(xiàn)炎癥小結(jié)，后肢關(guān)節(jié)硬化，并逐漸喪失運(yùn)動(dòng)功能，體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢.連續(xù)給藥14 d、21 d及28 d后，高、中劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯下降（P＜0.05，P＜0.01，表1），表明克痹寧可顯著抑制AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀.

表1 克痹寧對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表1 克痹寧對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常對(duì)照組；aP＜0.05 vs模型對(duì)照組；dP＜0.01 vs模型對(duì)照組.

組別關(guān)節(jié)炎指數(shù)（分）給藥3 d給藥7 d給藥14 d給藥21 d給藥28 d正常對(duì)照組0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0模型對(duì)照組6.2±1.2b8.1±1.0b9.8±2.0b9.5±1.2b8.8±0.8b高劑量組6.1±1.68.0±1.17.2±1.2d5.4±1.6d4.1±1.4d中劑量組6.1±1.57.9±0.98.4±1.4a6.9±1.2d5.6±0.8d低劑量組6.2±1.07.8±0.89.3±1.88.6±1.37.7±1.4

2.2 克痹寧對(duì)AA大鼠繼發(fā)性對(duì)側(cè)足腫脹的影響各組AA大鼠給藥后14 d、28 d均出現(xiàn)繼發(fā)性左后足腫脹，與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），AA大鼠給予1.2、0.6 g/kg的克痹寧14 d、28 d后，繼發(fā)性足腫脹顯著減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2）.

表2 克痹寧對(duì)AA大鼠繼發(fā)性對(duì)側(cè)足腫脹的影響（±s，n＝10）

表2 克痹寧對(duì)AA大鼠繼發(fā)性對(duì)側(cè)足腫脹的影響（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常對(duì)照組；dP＜0.01 vs模型對(duì)照組.

組別給藥前左后足掌厚度（mm）給藥后左后足掌腫脹率（%）14 d28 d正常對(duì)照組5.17±0.331.13±0.241.37±0.43模型對(duì)照組5.25±0.4526.23±7.03b20.77±6.00b高劑量組5.29±0.3713.23±4.15bd8.92±1.56bd中劑量組5.26±0.2915.69±3.30bd12.87±4.20bd低劑量組5.27±0.3420.59±2.99b17.90±2.76b

2.3 克痹寧對(duì)AA大鼠棉球肉芽腫形成及NO含量的影響AA大鼠給予克痹寧后，肉芽腫形成受到明顯抑制（P＜0.01），高、中劑量克痹寧可顯著抑制AA大鼠血清中NO含量（P＜0.01）.

表3 克痹寧對(duì)AA大鼠棉球肉芽腫形成及NO含量的影響（ ±s，n＝10）

表3 克痹寧對(duì)AA大鼠棉球肉芽腫形成及NO含量的影響（ ±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常對(duì)照組；dP＜0.01 vs模型對(duì)照組.

組別肉芽腫重量（mg）NO含量（μmol/L）正常對(duì)照組56.33±13.5426.94±6.94模型對(duì)照組127.99±6.77b68.61±12.70b高劑量組59.30±10.87d30.00±3.88d中劑量組69.94±22.85d42.78±8.61d低劑量組87.53±15.76d52.78±11.11

2.4 克痹寧對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化的影響

正常大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜無(wú)充血、水腫，滑膜皺褶處無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜有明顯的充血、水腫，滑膜皺褶處上皮細(xì)胞明顯增生并見明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn).給予克痹寧治療后，AA大鼠關(guān)節(jié)水腫及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕（圖1）.

圖1 克痹寧對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化的影響（HE×200）

3 討論

RA是一種關(guān)節(jié)慢性炎癥性、反復(fù)發(fā)作的全身疾病.AA是以關(guān)節(jié)滑膜組織的慢性增生為主要表現(xiàn)的免疫功能障礙性關(guān)節(jié)炎模型，其關(guān)節(jié)炎特征與人的RA較為接近［15］，因此多利用弗氏佐劑制備AA大鼠模型來(lái)考察RA治療藥物的活性.

RA受多種免疫細(xì)胞、炎癥因子調(diào)控，疾病過(guò)程中存在多種細(xì)胞因子的合成和分泌異常.NO既是一種炎癥細(xì)胞因子，亦是一種自由基.生理量的NO即介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，過(guò)量的NO則造成組織損害.研究［16］表明，NO參與自身免疫疾病的組織破壞和炎癥過(guò)程.NO可激活NF?κB途徑，加速關(guān)節(jié)炎癥的進(jìn)程；也可直接參與自由基反應(yīng)，直接導(dǎo)致軟骨損害；亦可抑制蛋白多糖合成，增加PGE2的合成，引起關(guān)節(jié)疼痛并抑制軟骨細(xì)胞增殖［17］.

本研究結(jié)果顯示，克痹寧能降低CFA引起的AA大鼠足趾腫脹及關(guān)節(jié)炎指數(shù)，明顯抑制AA大鼠棉球肉芽腫形成.組織病理學(xué)結(jié)果也表明，AA大鼠踝關(guān)節(jié)水腫及滑膜淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減輕，提示克痹寧凝膠劑可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改善AA的各種炎性癥狀.克痹寧明顯降低AA大鼠血清中NO含量，表明克痹寧可能通過(guò)抑制AA大鼠體內(nèi)NO合成發(fā)揮緩解AA的藥理作用，有關(guān)其作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)仍需進(jìn)一步研究.

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Anti-inflammatory effects of Kebining gel on adjuvant arthritis in rats

TAO Xin-Zhi，XU Zhi-Li，WANG Su-Juan，LI Yang-Yang，HE Si-Yu，GUAN Xi-Kun，ZHANG Ming-Bo
College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China

AIM：To investigate the anti?inflammatory effects of Kebining gel on adjuvant arthritis in rats.METHODS：The rat model of arthritis was established by subcutaneous injection of complete Freund's adjuvant and the therapeutic effects of Kebining gel on the foot swelling，arthritis index，cotton ball granuloma and serum nitric oxide contents were determined，respectively.Addi?tionally，the pathological changes of ankle joint in rats with arthri?tis were observed.RESULTS：After treatment with Kebining gel，foot swelling，arthritis index，cotton ball granuloma and serum nitric oxide contents were obviously decreased，and the edema and infiltration of lymphocytes in ankle joints were significantly reduced in arthritic rats according to the pathological findings.CONCLUSION：Kebining gel could reduce the nitric oxide con?tent，and then inhibit the inflammation of rheumatoid arthritis（RA）induced by complete Freund's adjuvant.

Kebining gel；adjuvant arthritis；anti?inflammation

R285.5

A

2017－06－14；接受日期：2017－06－29

2016年遼寧省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610162016）

陶新知.E?mail：1434537502＠qq.com

徐志立.博士，副教授，碩導(dǎo).研究方向：中藥藥理學(xué).E?mail：xu＿zhili＠126.com

2095?6894（2017）10?47?04