hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響

高 琪，張國超，何 琦，董信芳，雒艷萍，車團結，馬興銘

（1蘭州大學基礎醫(yī)學院，2甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，甘肅蘭州730000）

hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響

高 琪1，張國超1，何 琦1，董信芳1，雒艷萍1，車團結2，馬興銘1

（1蘭州大學基礎醫(yī)學院，2甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，甘肅蘭州730000）

目的：構建hMASP2 DNA納米脂質體復合物，探討hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響.方法：構建pcDNA3.1?hMASP2重組表達質粒，以脂質體作為載體，制備質粒DNA納米脂質體復合物并檢測Zeta電位和粒徑；經鼻滴入1×109CFU BCG 100 μL，建立結核分枝桿菌感染小鼠模型，實驗分DNA納米脂質體組（pcDNA3.1?hMASP2組）和對照組，在感染當天小鼠尾靜脈分別注射pcDNA3.1?hMASP2 200 μL（25 μg DNA）和PBS 200 μL，每3天注射一次，連續(xù)治療三周后處死小鼠；分離肺組織淋巴細胞，流式細胞儀檢測T細胞亞群；肺組織免疫組化分析AKT、pAKT蛋白表達.結果：pcDNA3.1?hMASP2 DNA納米脂質體復合物Zeta電位52.6 mV、平均粒徑279.9 nm；與對照組相比，pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4＋T細胞亞群百分比明顯升高（P＜0.05）、CD4＋PD?1＋T細胞亞群百分比降低（P＜0.05）；pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織AKT和pAKT的陽性細胞百分比明顯增高（P＜0.05）.結論：構建穩(wěn)定的pcDNA3.1?hMASP2 DNA納米脂質體復合物，pcDNA3.1?hMASP2納米脂質體增加BCG感染小鼠的肺組織的CD4＋T細胞、促進肺組織pAKT蛋白的表達，降低肺組織的PD?1＋T細胞亞群，從而上調小鼠T細胞功能.

納米脂質體；MASP2；結核病；PD?1；AKT

0 引言

結核?。╰uberculosis，TB）現已成為備受大家關注的全球性健康問題.2015年，世界各地估計有1040萬例新發(fā)活動性結核病，同年全球造成約140萬人死亡［1］.結核病是嚴重危害人類健康的經呼吸道傳播的慢性傳染病，近年來，我國每年報告肺結核發(fā)病人數約100萬，始終位居全國甲乙類傳染病的前列；耐多藥肺結核危害日益凸顯，每年新發(fā)患者人數約12萬，未來數年內可能出現以耐藥菌為主的結核病流行態(tài)勢［2］.現如今，在藥物治療的基礎上，免疫學療法為結核病的治療提供了新方法和新思路，其中結核分枝桿菌疫苗和IL?12使用最多，DNA疫苗以Ag85B效果最好，它能夠刺激肉芽腫組織淋巴細胞的應答，達到延長動物壽命的目的［3］.IL?12能夠推進CTL細胞成熟、引誘Th1分化、刺激T細胞、釋放IFN?γ，免疫治療具有較大應用潛力.

補體系統被認為是在炎癥過程中具有重要作用的先天免疫系統的重要組成部分.可以通過經典途徑、替代途徑或凝集素途徑激活，產生具有廣泛免疫功能的C3a和C5a，以及能夠直接裂解靶細胞的末端補體裝置膜攻擊復合物［4］.甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2（mannan?binding lectin associated ser?ine proteases，MASP2）是啟動補體凝集素途徑的關鍵效應酶，其基因位于染色體1p36上，由12個外顯子組成，長約20 kb［5－6］.甘露糖結合凝集素（mannan?binding lectin，MBL）識別結合病原體后，與之結合的MASP2被激活，引發(fā)補體系統的抗體非依賴性活化途徑，裂解C4和C2并激活后續(xù)補體級聯反應，從而誘導炎癥反應，并破壞并清除病原體［5］，因此，凝集素途徑效應酶MASP2在發(fā)揮抗細菌感染方面具有重要的作用.

本實驗室曾對MASP2蛋白進行表達和純化，但其性質不穩(wěn)定，在30 min即可降解，當MASP2蛋白濃度＞3 μg/L時，在無MBL參與的情況下可發(fā)生自行激活，使得MASP2蛋白難以大量純化［7］.在前期的研究中，以腺病毒為載體構建的rAd?hMASP2對小鼠結核性肉芽腫的治療具有明顯治療效果［8－11］，但腺病毒載體存在靶向性差、免疫原性強、半衰期短等缺點，限制了其在治療中的應用［12］.為此，我們構建MASP2 DNA納米脂質體復合物，由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成的脂質體進入人體內，被網狀內皮系統吞噬而激活機體自身免疫功能，脂質體容易浸染細胞，并能夠改變藥物的體內分布，使藥物主要在肝、肺等組織器官中積蓄，提高藥物治療效率.因此，在本實驗構建hMASP2重組質粒，以脂質體為載體，制備DNA納米脂質體復合物，評價其對BCG感染小鼠肺組織T細胞亞群和AKT/pAKT蛋白表達的影響.

1 材料和方法

1.1 hMASP2DNA納米脂質體制備hMASP2全基因質粒pYr?ads?1?hMASP2由本實驗室構建，E.coli DH5α和E.coli BL?21為本實驗室保存；真核表達載體pcDNA3.1購自蘇州金唯智有限公司；hMASP2的上下游引物由華大基因科技有限公司合成.以本實驗室pYr?ads?1?hMASP2為模板進行PCR擴增，獲取hMASP2全基因，上游引物序列GGGGTACCGCCAC?CATGAGGCTGCTGACCCTCCT，下游引物序列GGAATTCTTAAAAATCACTAATTATGTTCTC，酶切位點EcoRⅠ和KpnⅠ，將構建好的重組質粒交由華大基因科技有限公司測序，結果顯示序列匹配，表明重組質粒構建成功.參考文獻方法［13］構建hMASP2 DNA納米脂質體復合物：用實驗室已經制備的脂質體，調整其及質粒DNA的濃度，將脂質體與DNA 3∶1混合，剩余量用5%葡萄糖補足，用加樣槍反復吹打混勻，置于4℃冰箱中過夜，次日用于小鼠尾靜脈注射.

1.2 hMASP2 DNA納米脂質體表征hMASP2 DNA納米脂質體用Malvern Zetasizer Nano?ZS（Malv?ern Instruments，Worcestershire，UK）儀器檢測MASP2其Zeta電位和粒徑大小，判斷其穩(wěn)定性和納米脂質體大小.

1.3 小鼠BCG感染模型建立與干預SPF級6～8周齡雌性昆明種小鼠（蘭州大學實驗動物中心），溫濕度適宜、干凈清潔的條件下飼養(yǎng).擴增培養(yǎng)牛型結核分枝桿菌減毒株BCG D1331菌株（蘭州大學結核病研究中心惠贈），第0天小鼠經鼻滴入1×109CFU 100 μL，建立小鼠結核病模型并隨機將小鼠分為hMASP2脂質體復合物組（pcDNA3.1?hMASP2組）和PBS對照組，每組四只.BCG感染當天分別給予尾靜脈注射pcDNA3.1?hMASP2脂質體復合物和等體積PBS，注射體積為200 μL（25 μg DNA），每隔三天注射一次.在第21天處死小鼠，取左肺組織分離淋巴細胞，流式細胞儀分析CD4、CD8、PD?1淋巴細胞亞群，右肺組織免疫組化染色檢測AKT和pAKT的表達情況，并計算其陽性細胞百分比.

1.4 肺淋巴細胞分離與流式細胞術參考文獻方法［14］分離肺組織淋巴細胞，即用40%的Percoll（Pharmacia，America）分離小鼠肺組織的淋巴細胞，用D?Hanks液洗滌兩次，棄去上清后用PBS洗滌，100 μLPBS重懸后細胞計數.調整細胞濃度，取2×106個淋巴細胞進行染色，其中PE?抗CD4單克隆抗體（0.625 μL），APC?抗CD8單克隆抗體（0.625 μL），FITC?抗PD?1單克隆抗體（0.8 μL）加入后（三株熒光抗體購自eBioscience公司），輕輕渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，然后加入預冷的PBS 1 mL進行重懸洗滌，上機檢測（BD FACSCalibur），結果由FlowJo 7.6.1統計分析.

1.5 肺組織免疫組織化學染色用常規(guī)SABC免疫組化法檢測小鼠右肺組織中AKT、pAKT的表達水平，常規(guī)石蠟切片脫蠟，乙醇水化，檸檬酸鈉修復，3%H2O2孵育10 min，加兔抗鼠一抗（1∶100）（抗AKT抗體購自Bioss公司，抗pAKT抗體購自bioswamp公司），4℃過夜孵育，加Maxvision二抗（1∶100）37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片，顯微鏡下觀察，自上向下隨機取10個高倍視野（×400），用Image?Pro plus 6.0軟件進行分析，以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性信號，計算陽性細胞百分比.

1.6 統計學處理采用SPSS18.0軟件學進行數據分析，計算出各組的M±SD，同時采用單因素方差分析計算P值，組間分析采用t檢驗，當P＜0.05時認為差異有統計學意義.實驗數據制圖使用Graph Pad Prism軟件.

2 結果

2.1 hMASP2 DNA納米脂質體表征hMASP2 DNA納米脂質體經Malvern Zetasizer Nano?ZS（Malv?ern Instruments，Worcestershire，UK）儀器檢測，測得其平均Zeta電位為52.6 mV，平均粒徑大小為279.9 nm（圖1）.制備的hMASP2 DNA納米脂質體復合物性質穩(wěn)定（Zeta＞40 mV，粒徑100～300 nm）［9］，可用于小鼠尾靜脈注射.

圖1 MASP2 DNA納米脂質體Zeta電位和粒徑峰值

2.2 肺組織T細胞亞群流式細胞儀檢測小鼠肺組織T細胞數量、亞群及百分比結果見圖2～4.兩組小鼠肺組織T細胞數、CD8＋T細胞亞群和CD8＋PD?1＋T細胞亞群百分比無統計學差異（P＞0.05）（圖2、3）.與對照組相比，pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4＋T細胞百分比明顯增多，差異具有統計學意義（P＝0.028）；pcDNA3.1?hMASP2組小鼠肺組織CD4＋PD?1＋T細胞百分比明顯降低，差異具有統計學意義（P＝0.023）.表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織淋巴細胞的浸潤和募集，并抑制CD4＋T淋巴細胞膜表面抑制性分子PD?1的表達.

圖2 兩組小鼠肺組織淋巴細胞總數

圖3 兩組小鼠肺組織CD4＋、CD8＋、CD4＋PD?1＋、CD8＋PD?1＋T細胞亞群百分比

圖4 兩組小鼠肺組織淋巴細胞亞群流式細胞術檢測代表圖

2.3 肺組織免疫組化檢測每個切片觀察4個高倍鏡視野，每高倍鏡視野計數100個細胞，綜合判斷陽性細胞染比例和染色強度.小鼠肺組織免疫組化檢測結果見圖5、6.與對照組相比，pcDNA3.1?hMASP2組AKT和pAKT陽性細胞百分比明顯增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）.對照組小鼠肺組織中有較少的棕黃色陽性細胞分布，而hMASP2 DNA納米脂質體組小鼠肺組織中有較多、集中分布的棕黃色陽性細胞.hMASP2DNA納米脂質體組小鼠肺組織AKT、pAKT的表達水平均顯著增加，表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織細胞AKT表達，并增加磷酸化的pAKT水平.

圖5 小鼠肺組織中AKT和pAKT免疫組化結果（IHC×100）

圖6 小鼠肺組織中AKT和pAKT陽性細胞百分比

3 討論

程序性死亡因子（PD?1/CD279）是共刺激分子CD28家族中的受體，主要表達于T細胞表面，通過與其配體PDL?1/2結合，抑制淋巴細胞增殖和細胞因子產生［15］.PD?1/PD?L1對調節(jié)T細胞功能起著至關重要的作用.在慢性感染、腫瘤患者體內，T細胞高表達PD?1分子，被認為是T細胞耗竭的標志［16－17］.結核患者的免疫力受損與巨噬細胞和T細胞活化受損、IFN?γ的產生減少密切相關［18］，結核分枝桿菌特異性CD4＋T細胞在活動性肺結核中的作用比CD8＋T細胞更重要［19］，并且活動性肺結核CD4＋T細胞高表達PD?1分子［20］.故通過下調T細胞PD?1分子的表達，改善患者的T細胞功能，是治療慢性感染的策略之一.在本實驗中，pcDNA3.1?hMASP2治療組CD4＋T細胞比例明顯升高、CD4＋PD?1＋T細胞比例降低，表明hMASP2 DNA納米脂質體能夠促進小鼠肺組織CD4＋T細胞的浸潤和募集，并抑制PD?1分子的表達，從而上調CD4＋T細胞功能.磷酸肌醇三磷酸激酶?絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinsitol 3?OH kinase?RAC?alphaserine/threonine?protein kinase，PI3K?AKT）信號通路廣泛存在于細胞中，是細胞內重要信號通路之一，通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)發(fā)揮其作用［21］.AKT也稱為蛋白激酶B，一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過絲氨酸473和蘇氨酸308的磷酸化激活，在多種細胞過程中起重要作用［22］.AKT是PI3K/AKT通路的中心環(huán)節(jié)，可被PI3K激活成為具有磷酸激酶活性的pAKT（磷酸化AKT），pAKT可誘導干擾細胞凋亡功能的信號，并且可能通過激活哺乳動物的雷帕霉素靶標和阻滯靶細胞通過正常的細胞周期等來促進細胞存活，增殖和運動［23－24］.在本實驗中，pcDNA3.1?hMASP2組棕黃色的陽性細胞分布更廣泛，并且AKT和pAKT陽性細胞百分比明顯增高，其在小鼠肺組織中顯著表達.一方面hMASP2 DNA納米脂質體抑制BCG感染誘導的肺組織細胞凋亡，有利于肺組織修復.另一方面，肺肉芽組組織中有大量浸潤T細胞，hMASP2 DNA納米脂質體通過影響AKT和pAKT表達，促進浸潤T細胞增殖、活化，拮抗PD?1對T細胞的下調作用，可能是其下調PD?1分子的表達機制之一，繼而增強T細胞抗感染的效應功能.總之，結核病的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后是一個復雜的多因素參與的過程，本實驗主要通過檢測PD?1和AKT水平來初步評價hMASP2 DNA納米脂質體對小鼠結核性肉芽腫的影響.hMASP2 DNA納米脂質體作用于小鼠后，T細胞PD?1表達水平降低，AKT和pAKT表達均增加，表明hMASP2 DNA納米脂質體對BCG感染小鼠肺組織局部免疫具有上調作用.但hMASP在小鼠體內的表達、hMASP2 DNA納米脂質體對PD?1和AKT水平的調控機制需要進一步研究.

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Effects of hMASP2 DNA nano-liposomes on T-lymphocytesubsetsandexpressionof AKT/pAKT protein in lung tissue of BCG-infected mice

GAO Qi1，ZHANG Guo-Chao1，HE Qi1，DONG Xin-Fang1，LUO Yan-Ping1，CHE Tuan-Jie2，MA Xing-Ming11Department of Immunology，School of Basic Medical Science，Lanzhou University，2Gansu Key Laboratory of Functional Genom?ics and Molecular Diagnosis，Lanzhou 730000，China

AIM：To evaluate the potential impacts of human MASP2（hMASP2）DNA nano liposomes on T?lymphocyte sub?sets and AKT/pAKT protein expression in lung tissue of BCG?in?fected mice through constructing the hMASP2 DNA nano?lipo?somes complex.METHODS：The pcDNA3.1?hMASP2 recombi?nant plasmids were constructed and then the hMASP2 DNA nano?liposomes complex were prepared with a carrier of liposome.The zeta potential and particle size of hMASP2 DNA nano?liposomes were detected.After infection with 100 μL of 1×109CFU BCG，mice were randomly divided into two groups and

the fol?lowing treatments：the mice of hMASP2 DNA nano?liposomes group were injected by tail vein with 200 μL（25 μg DNA）of DNA nano?liposomes and the mice of control group were received PBS（200 μL）by tail vein.All mice were injected every three days and treated for 3 weeks，then were killed.Lymphocytes were isolated from lung tissue and PD?1＋T cell subsets were detected by flow cytometry.The expression of AKT/pAKT protein was detected with immunohistochemical staining.RESULTS：The zeta potential of pcDNA3.1?hMASP2 DNA nano?liposome complex was 52.6 mV and the average particle size was 279.9 nm.Com?pared with the control group，the percentage of CD4＋T?lympho?cyte subsets in the lung tissue of mice treated with hMASP2 DNA nano?liposomes were significantly increased（P＜0.05）and the percentage of CD4＋PD?1＋T?lymphocyte subsets were significantly decreased（P＜0.05）.The percentage of AKT and pAKT positive cells in hMASP2 DNA nano?liposomes group were significantly increased（P＜0.05）.CONCLUSION：A stable pcDNA3.1?hMASP2 DNA nano?liposome complex is firstly constructed，which shows the positive efficacy in increasing the number of CD4＋T cells，reducing the number of PD?1＋T?lymphocyte sub?sets，and promoting the expression of pAKT of BCG?infected mice.These findings provide experimental evidence that hMASP2 DNA nano?liposomes display a potential role of up?regulating T?cell?mediated immunity in tuberculosis.

nano?liposomes；MASP2；tuberculosis；PD?1；AKT

R730.45

A

2017－07－21；接受日期：2017－08－03

蘭州大學中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（lzujbky－2017－117）；蘭州市科技計劃項目（2016－3－107）

高 琪.碩士.E?mail：gaoqijy＠163.com

雒艷萍.副教授.馬興銘（共同通訊作者）.教授.E?mail：maxm＠lzu.edu.cn

2095?6894（2017）10?35?04