巴西橡膠樹6個PP2C家族基因成員分子信息學(xué)與抗旱功能分析

張 冬 李曉娜 肖厚貞 陸燕茜 張 宇* 王 萌

(1.海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，?？?570228； 3.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，?？?570228)

巴西橡膠樹6個PP2C家族基因成員分子信息學(xué)與抗旱功能分析

張 冬1李曉娜2肖厚貞3陸燕茜1張 宇1*王 萌1

(1.海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，?？?570228；3.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海口 570228)

PP2C是一類絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶，在高等植物ABA信號途徑中起著重要的作用。為闡明巴西橡膠樹中PP2C基因的結(jié)構(gòu)與功能，本研究通過生物信息學(xué)方法,從橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定并獲得6個PP2C家族基因，均含有PP2CD、F1和F2亞族。通過qRT-PCR技術(shù)對6個PP2C家族基因進(jìn)行了干旱處理下的差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)6個基因都不同程度上響應(yīng)橡膠樹干旱脅迫。本研究為探究PP2C基因在橡膠樹抗干旱反應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)。

巴西橡膠樹；PP2C基因；生物信息學(xué)；表達(dá)分析；干旱

巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisMull.Arg.)原產(chǎn)于亞馬遜森林，是一種優(yōu)質(zhì)天然橡膠資源。作為“工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資”[1],天然橡膠在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起重要作用。在中國，巴西橡膠樹主要栽植于海南等地，自海南省種植橡膠樹以來，承擔(dān)生產(chǎn)天然橡膠的主要任務(wù)，為中國的經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會發(fā)展作出顯著貢獻(xiàn)[2]。但是長期的適應(yīng)過程使其形成了怕強風(fēng)干旱和低溫的生長習(xí)性，每年11月至次年4月為海南的旱季，即使是雨季，因降水時空分布不均，也會導(dǎo)致夏旱和秋旱，一些年份甚至全年干旱[3～4]。干旱是限制我國橡膠發(fā)展的主要原因之一，大量的實驗表明，干旱脅迫抑制橡膠樹可溶性蛋白合成和光合生理[5]，導(dǎo)致次生根數(shù)量減少。當(dāng)植膠區(qū)面臨干旱威脅時，橡膠樹葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膠樹生長遲緩[6]，膠產(chǎn)量下降[7]，引發(fā)死皮病蟲害，嚴(yán)重時致死[8]。干旱對我國的天然橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著巨大的威脅，影響宏觀經(jīng)濟(jì)，所以，研究橡膠樹抗旱機(jī)制對橡膠產(chǎn)業(yè)以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展意義重大。然而橡膠樹干旱脅迫的應(yīng)答機(jī)制尚不清楚，目前已在擬南芥[9]、番茄[10]、黃花蒿[11]和玉米[12]等植物中發(fā)現(xiàn)了PP2C基因響應(yīng)干旱脅迫，筆者推測PP2C基因在橡膠樹抗旱過程中也存在作用。

PP2C(PP2C-typeproteinphosphatase)是一類單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶[13～14]，其活性依賴于Mg2+或Mn2+等離子，進(jìn)化保守[15]，廣泛存在于古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、植物和動物中[16]。相較于其他生物，植物中PP2C類蛋白數(shù)量最大[17]。大部分植物PP2C蛋白包含3個基序，1個具有保守催化結(jié)構(gòu)域的C末端，1個具有功能各異的膜定位信號序列延伸區(qū)的N端，還有1個類似受體激酶互作結(jié)構(gòu)域[18]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有80個PP2C基因，水稻中90個[9]，二穗短柄草中86個[16]。擬南芥的80個PP2C候選基因被分為13個亞類：A-D、Ea、Eb、F1、F2、G-J亞族[9]。其中，A亞族調(diào)控脫落酸(abscisic acid，ABA)信號途徑，胡楊PeHAB1基因[19]、擬南芥ABI1，ABI2和AtPP2CA基因?qū)儆贏亞族[20]，是ABA信號途徑中的調(diào)控基因[21～22]，ABA誘導(dǎo)PYL-PP2C相互作用，激活SnRK2蛋白激酶，從而調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子促使基因表達(dá)。B亞族在蛋白激酶MAPK途徑起作用，擬南芥中B亞族PP2C基因AP2C1，在病原體應(yīng)激、受到機(jī)械傷害后，影響MPK4或MPK6基因，抑制MAPK活性[23]。苜蓿中B亞族PP2C(MP2C)受逆境脅迫誘導(dǎo)，是MAPK途徑中的負(fù)調(diào)控因子[24～25]。C亞族與花器官發(fā)育有關(guān)[26]，而關(guān)于PP2C基因其他亞族的研究并不多。

本研究利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段，鑒定橡膠樹6個PP2C家族基因，并分析其在干旱處理下的差異表達(dá),以期為探究PP2C家族基因參與干旱脅迫分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為培育抗旱橡膠樹品種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

巴西橡膠樹(HeveabrasiliensisMull.Arg)品種‘熱研7-33-97’芽接苗由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院儋州校區(qū)種植基地提供。

選取兩組長勢一致的同齡橡膠芽接苗，一組對照，一組實驗，每組3個重復(fù)。干旱處理采用方法如下：對兩組苗持續(xù)10 d飽和澆水后，實驗組做斷水處理，對照組正常澆水,持續(xù)觀測橡膠樹表型變化直至葉片干枯，在第0、1、3、6、9 d采取同一時段的實驗組和對照組橡膠芽接苗葉片，所有采集的樣品迅速保存于液氮中備用。

1.2 巴西橡膠樹生物信息學(xué)分析

1.2.1 巴西橡膠樹6個PP2C基因家族成員的鑒定

PP2C基因家族成員序列來源于橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。使用NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)看基因的開放閱讀框(ORF)是否完整，預(yù)測基因的氨基酸序列。利用SWTSS-PROT數(shù)據(jù)庫中ExPASyProteomics Sever(http://expasy.org/)對PP2C蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子量、等電點的預(yù)測；通過NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam database(http://pfam.xfam.org/)在線分析其保守結(jié)構(gòu)域。在MEME的Multiple Em for Motif Elicitation(http://meme-suite.org/)分析保守元件。NCBI在線BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析HbPP2Cs與其他物種間的相似序列。通過DNAman 6.0軟件分析了橡膠樹與其他物種的PP2C氨基酸序列。

1.2.2 巴西橡膠樹6個PP2C基因家族成員分類

從擬南芥信息資源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥全序列，導(dǎo)入本地PowerBlast，對比找出橡膠樹PP2C基因同源性最高的擬南芥基因；利用NCBI Basic Local Alignment Search Tool(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找出與橡膠樹PP2C基因同源性最高的水稻(OryzasativaL.)基因，分析比對它們的氨基酸序列。ClustalX(1.83)程序多重序列比對擬南芥、水稻PP2C基因和橡膠樹6個PP2C基因，對比結(jié)果利用軟件MEGA6構(gòu)建鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成

用天根的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取橡膠芽接苗葉片總RNA，Thermo公司的RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 實時熒光定量qRT-PCR分析

使用Primer 6.0設(shè)計6個PP2C基因?qū)崟r熒光定量PCR的特異性引物，以巴西橡膠樹Actin為內(nèi)參基因，分析各基因相對表達(dá)量。設(shè)計的引物見表1。

表1橡膠樹6個PP2C基因qRT-PCR引物序列

Table1PrimerssequenceofsixPP2CgenesinRubbertreeforqRT-PCR

基因名稱Genename正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerHbPP2C7GATAAGGCACTCGTCTTCTTCAATGTCAAGGTCCATAGGTHbPP2C10GACATACAAGACACCATCATAGGACACCAGGATAACGATAGTHbPP2C11AACCTCCAGCATCTTCAATCCTAGAGTGGTAGCCAGTAGAHbPP2C16TTCCGCAACTGACAATACTCCGATGAGGCTGTTACTGHbPP2C42CTCTTGTGTCTGAGTTATGGACTGAATAGCAGCAATGTCTCHbPP2C46CCTCTACATTGCTAACCTTGGCCACATTATGCTCTGATGHbACTINGATGTGGATATCAGGAAGGACATACTGCTTGGAGCAAGA

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

基因表達(dá)的數(shù)據(jù)是3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。利用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，單因素方差分析和Duncan檢驗分析不同處理之間的差異顯著性。使用Origin2015和Adobe Photoshop CS5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西橡膠樹6個PP2C基因的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)方法，從橡膠樹轉(zhuǎn)錄組中鑒定獲得6個具有完整ORF的候選PP2C基因家族成員，分別是CL10879.Contig2、CL224.Contig3、CL4996.Contig1、CL10902.Contig1、CL2659.Contig3和CL10104.Contig2。根據(jù)與擬南芥同源性將橡膠樹6個PP2C基因分別命名為HbPP2C7、HbPP2C10-11、HbPP2C16、HbPP2C42和HbPP2C46。NCBI Consered Domains和Pfam database的分析結(jié)果顯示，6個橡膠樹PP2C家族基因均含有PP2C保守結(jié)構(gòu)域(圖2B)。利用ExPASy在線分析得出，這6個HbPP2C基因家族成員中，蛋白質(zhì)編碼最長的545 aa，最短的241 aa，等電位范圍從4.71～8.7(表2)。

表2 橡膠樹6個PP2C家族基因信息

使用NCBI的在線BLAST分析核酸序列得出，HbPP2C7與蓖麻(RicinuscommunisL.，XM_002514049.2)相似性83%，麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.，XM_012221592.1)相似性86%；HbPP2C10與麻風(fēng)樹XM_012212487.1相似性81%，蓖麻XM_002513878.2相似性86%；HbPP2C11與麻風(fēng)樹XM_012210755.1相似性90%，蓖麻XM_015719900.1相似性89%；HbPP2C16與蓖麻XM_002521322.2相似性83%，麻風(fēng)樹XM_012213539.1相似性88%；HbPP2C42與麻風(fēng)樹XM_012228710.1相似性86%，蓖麻XM_015719271.1相似性83%；HbPP2C46與蓖麻XM_015726275.1相似性89%，麻風(fēng)樹XM_012233075.1相似性89%。橡膠樹PP2C基因與蓖麻和麻風(fēng)樹等物種的相似性較高。將橡膠樹6個PP2C基因的氨基酸序列與水稻、擬南芥、蓖麻和麻風(fēng)樹中部分PP2C基因?qū)Ρ?圖1)，發(fā)現(xiàn)PP2C家族成員絕大多數(shù)含有高度保守的PP2C結(jié)構(gòu)域，證明6個HbPP2C基因是PP2C基因家族成員。

圖1 橡膠樹PP2C基因與其他植物PP2C基因蛋白序列多重比對Fig.1 Multiple protein sequence alignment of Rubber tree PP2Cs with other PP2C proteins

圖2 6個橡膠樹PP2C基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(A)、保守結(jié)構(gòu)域(B)和保守元件(C)分析Fig.2 Phylogenetic tree(A),conserved domains(B) and conserved motifs(C) of 6 Rubber tree PP2Cs

圖3 6個橡膠樹PP2C基因的保守元件模型Fig.3 The conserved motif logoof the 6 Rubber tree PP2Cs

2.2巴西橡膠樹6個PP2C基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析與分類

為探究6個橡膠樹PP2C基因蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究構(gòu)建了6個橡膠樹PP2C基因的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖2A)，6個PP2C基因在進(jìn)化發(fā)育樹中形成3個分支。為了進(jìn)一步確定橡膠樹PP2C基因基因間的關(guān)系，用MEME軟件構(gòu)建了保守元件結(jié)構(gòu)圖(圖2C)?？煽闯?個PP2C基因具有11個保守元件，這導(dǎo)致功能的多樣性。盡管橡膠樹PP2C基因的蛋白長度有241～545個氨基酸，但MEME保守元件結(jié)構(gòu)圖表明，聚類在一起的橡膠樹PP2C基因擁有相同蛋白基序位置。同時，從橡膠樹PP2C基因的保守元件模型(圖3)可看出，橡膠樹PP2C基因的進(jìn)化是保守的。

將巴西橡膠樹6個PP2C基因在NCBI在線BLAST，同時與擬南芥全序列進(jìn)行本地PowerBlast，結(jié)果表明，HbPP2Cs分別與擬南芥中的AtPP2C10、16、79、11、42、7同源性最高，與水稻中的OsPP2C41、6、60、10、60、6同源性最高。將HbPP2Cs與擬南芥和水稻中同源性最高的基因進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，根據(jù)擬南芥和水稻PP2C基因的分類，HbPP2Cs可被分為4個亞族：A、D、F1、F2亞族(圖4)。HbPP2C7和HbPP2C16屬于A亞族，HbPP2C42和HbPP2C46屬于D亞族，HbPP2C10屬于F1亞族，HbPP2C11屬于F2亞族。

2.3巴西橡膠樹6個PP2C基因在干旱處理下的表達(dá)分析

干旱處理橡膠樹芽接苗后，葉片表型變化如圖5。橡膠樹芽接苗在第6 d時表現(xiàn)出受害癥狀，葉片變黃；在干旱處理第9 d時，葉片完全枯萎。所以，本研究取對照組與干旱處理下0、1、3、6和9 d的橡膠樹芽接苗葉片，分析巴西橡膠樹6個PP2C基因在干旱處理下的表達(dá)量變化情況。

圖4 巴西橡膠樹、擬南芥和水稻PP2C基因進(jìn)化關(guān)系Fig.4 Phylogenetic relationship of Hevea brasiliensis,Arabidopsis and Oryza sativa PP2C genes

圖5 干旱對橡膠樹葉片影響的表型圖Fig.5 The phenotypic map of rubber tree after non-irrigation treatment

圖6 橡膠樹葉片中HbPP2Cs基因在干旱條件下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of HbPP2Cs in H.brasiliensis leaves after non-irrigation treatment

巴西橡膠樹芽接苗葉片在干旱處理下表達(dá)量變化情況如圖6,巴西橡膠樹6個PP2C基因在干旱處理1～3 d下調(diào)，第6 d時上調(diào)。HbPP2C7是PP2C家族A亞族基因，在干旱處理6 d后的表達(dá)較顯著，干旱處理9 d時顯著上調(diào)表達(dá)，是對照處理的12倍，而其他五個基因均呈下調(diào)表達(dá)，HbPP2C10、11、16下調(diào)表達(dá)較顯著。橡膠樹6個PP2C基因在干旱處理6 d時都顯著上調(diào)，其表達(dá)量變化情況說明這6個基因都不同程度地參與了橡膠樹干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制。由此說明，HbPP2Cs是橡膠樹干旱脅迫應(yīng)答的較為關(guān)鍵的上游基因。

3 討論

本研究在橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找出并鑒定了6個具有完整ORF的PP2C基因家族成員，分析蛋白質(zhì)序列得出，PP2C蛋白C端含有保守的蛋白磷酸酶，橡膠樹6個PP2C基因家族成員都有PP2C保守結(jié)構(gòu)域。分析其保守域模型發(fā)現(xiàn)，橡膠樹6個PP2C基因有相對較高的保守性。將橡膠樹6個PP2C基因在線BLAST分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹PP2C基因與蓖麻、麻風(fēng)樹同源性較高。將橡膠樹6個PP2C基因聚類分析，形成3個分支，在分析保守元件時發(fā)現(xiàn)橡膠樹這各個分支下的基因具有相同的蛋白基序結(jié)構(gòu)和位置，而不同分支的PP2C基因保守元件差異顯著。說明PP2C基因家族種類繁多，結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)較特殊，橡膠樹中PP2C基因具有多樣性。使用本地PowerBlast對橡膠樹、水稻和擬南芥進(jìn)行PP2C基因同源性分析，找出水稻和擬南芥中與橡膠樹同源性最高的PP2C基因，與橡膠樹6個PP2C基因進(jìn)一步構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)擬南芥和水稻中PP2C基因的分類，將橡膠樹6個PP2C基因分為4個亞族：A、D、F1和F2亞族。以上結(jié)果為進(jìn)一步驗證PP2C基因家族功能提供依據(jù)。

干旱脅迫影響植物表型，改變植物生理[27]，是限制作物產(chǎn)量的最普遍環(huán)境因素[28～29]。橡膠樹的生長情況及膠乳產(chǎn)量也受干旱因素制約[30]，解決干旱脅迫對橡膠樹的危害對橡膠產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。植物對干旱脅迫的響應(yīng)受不同分子及信號通路調(diào)控[31]，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究抗干旱等逆境相關(guān)基因的分子表達(dá)調(diào)控機(jī)制已成為培育橡膠樹抗干旱品種的基礎(chǔ)手段。PP2C是植物中最大的蛋白磷酸酶家族，作為重要的信號分子調(diào)控植物逆境信號途徑[32～33]。在擬南芥和煙草等植物中研究發(fā)現(xiàn)，PP2C酶催化可逆磷酸化作用,反作用于特定蛋白激酶，從而調(diào)節(jié)ABA信號通路[34～35]，充當(dāng)負(fù)調(diào)控因子加速植物發(fā)育和增強植物對脅迫的耐受性[36]。大量研究發(fā)現(xiàn)，PP2C基因調(diào)控干旱脅迫。二穗短柄草PP2C基因家族成員中絕大多數(shù)受干旱處理上調(diào)[16]；干旱脅迫條件下，玉米ZmPP2Ca基因在耐旱自交系中下調(diào)表達(dá),在不耐旱自交系中上調(diào)表達(dá)[37]。非洲冰草的PP2C基因家族中Mpc5和Mpc8由干旱條件誘導(dǎo)，但其他Mpcs受干旱脅迫下調(diào)[38]；山楊樹A亞族四個PtPP2Cs均響應(yīng)干旱、寒冷和高鹽脅迫，在干旱處理下的表達(dá)量最高[19]。為探究PP2C基因在橡膠樹抗旱機(jī)制中的作用與機(jī)理，本研究利用qRT-PCR技術(shù)分析了橡膠樹PP2C基因在干旱處理下的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干旱處理橡膠樹芽接苗后，橡膠樹芽接苗在處理前期(1～3 d)無明顯變化，此階段巴西橡膠樹中6個PP2C基因的表達(dá)量不變；干旱處理第6 d時橡膠樹芽接苗表現(xiàn)出受害癥狀，葉片變黃，同時巴西橡膠樹中6個PP2C基因均上調(diào)表達(dá)；干旱處理第9 d時，橡膠芽接苗葉片完全枯萎，此間，A亞族HbPP2C7基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，其余5個PP2C基因下調(diào)表達(dá)。同家族不同基因可能存在不同的應(yīng)答機(jī)制，所以基因差異表達(dá)結(jié)果不盡相同。推測橡膠樹PP2C基因響應(yīng)干旱脅迫，A亞族HbPP2C7基因更具研究價值，而PP2C基因?qū)ο鹉z樹逆境分子調(diào)控機(jī)制及與其他基因間的協(xié)同作用仍有待深入探究。

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The National Natural Science Fund(31660187,31660204);The earmarker fund for China Agriculture Research System(CARS-34-BC1);Innovative research project of Hainan graduate students(Hys2016-25)

introduction：ZHANG Dong(1992—),female,master,molecular botany research.

date:2017-04-20

BioinformaticsandDroughtToleranceofPP2CGeneFamilyMembersinHeveabrasiliensisMuell.Arg.

ZHANG Dong1LI Xiao-Na2XIAO Hou-Zhen3LU Yan-Xi1ZHANG Yu1*WANG Meng1

(1.Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource,Institute of Tropical Agriculture and Forestry,Hainan University,Haikou 570228；2.Institute of Scientific and Technical Information Catas,Haikou 570228；3.College of Materials and Chemical Engineering,Hainan Univeersity,Haikou 570228)

PP2Csare a group of monomeric serine/threonine protein phosphatases, which play an important role in ABA signaling pathway in higher plants. In order to elucidate the structure and function ofPP2Cgene in rubber tree,we used a bioinformatics approach to get sixPP2Cgenes members from rubber tree transcription database, sixHbPP2Csall contain PP2C conserved domains.By sequence alignment and phylogenetic analysis,sixHbPP2Cswere divided into four subfamilies: subfamily A, D, F1 and F2. Different expression analysis of sixPP2Cfamily genes under drought stress by qRT-PCR showed that they all response to drought stress in varying degrees.Our study provides a theoretical basis for exploring the mechanism ofPP2Cgenes in drought resistance of rubber tree.

HeveabrasiliensisMuell.Arg.;PP2Cgenes;bioinformatics;expression analysis;drought

國家自然科學(xué)基金(31660187，31660204)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助(CARS-34-BC1)；海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2016-25)

張冬(1992—)，女，碩士研究生，主要從事分子植物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:yuzhang_rain@hainu.edu.cn

2017-04-20

* Corresponding author：E-mail:yuzhang_rain@hainu.edu.cn

S794.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.013