超聲波輔助提取靈芝三萜工藝研究

康同輝　張一凡　解婉瑩　王涵　席春俠　舒彥宇　袁媛

摘要：采用超聲波輔助提取靈芝三萜，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以靈芝三萜得率為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化靈芝三萜提取工藝條件。結(jié)果表明，在乙醇濃度85%、超聲時間15 min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25的條件下，靈芝三萜得率最高、為2.19%。

關(guān)鍵詞：靈芝；三萜；超聲波；提??；優(yōu)化；正交試驗(yàn)

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1161（2017）06-0041-03

靈芝又稱靈芝草、仙草、瑞草，在藥物領(lǐng)域中已有2000多a的使用歷史，是我國最著名的高等藥用真菌。靈芝具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗肝損傷、改善記憶、降脂、抗輻射、降血糖、抗血栓、抗疲勞等藥理作用。靈芝不僅具有廣泛的藥用價值，因其無毒、無害、無副作用，在食品領(lǐng)域也早有應(yīng)用，是一種極佳的藥食兩用物質(zhì)。靈芝中的多糖、三萜、生物堿、核苷等有效成分是靈芝發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但靈芝三萜的含量相對較低，對照品也很難獲得，且在提取過程中不穩(wěn)定。因此，需要尋求一種切實(shí)可行的方法來提高靈芝三萜得率。本研究采用超聲波法對靈芝三萜提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為靈芝三萜的工業(yè)化生產(chǎn)及其產(chǎn)品的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：吉林敖東世航產(chǎn)業(yè)股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：沈陽市國藥試劑有限公司；無水乙醇、冰乙酸、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

WFZUV-2000型紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；AXTD5A型臺式低速離心機(jī)：鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TB-114型電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝三萜提取工藝流程 取適量靈芝烘干→粉碎→準(zhǔn)確稱取適量靈芝粉末→加入乙醇→超聲輔助浸提→真空抽濾→濾液濃縮→干燥，即得靈芝三萜。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取5.0 μg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇，定容，即得母液。精確吸取母液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分別置于試管中，以試劑為空白參比，沸水浴揮發(fā)去除溶劑，揮發(fā)完全后加入0.4 mL 5%香草醛—冰乙酸和1.6 mL高氯酸，搖勻后將試管置于70 °C水浴鍋中加熱處理15 min，取出后用冰水快速冷卻至室溫，再加入8 mL乙酸乙酯，混勻，在560 nm處測定吸光度值。以齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到：y=8.323 5 x-0.047 8，R2=0.999 7，線性關(guān)系良好。

1.3.3 靈芝三萜測定 精密稱取靈芝三萜粉末1 g，加入乙醇，采用超聲波提取，抽濾，準(zhǔn)確吸取無水乙醇和三萜濾液各1 mL于試管中，按1.3.2中方法測定560 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測液中的三萜含量Y，利用下式計算三萜得率。

三萜得率（%）={（Y/1 000）/[（m/50） ×V]} ×100

式中：m為樣品質(zhì)量，mg；V為吸取濾液的體積，mL；Y為靈芝三萜含量，μg。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 在其他條件相同的情況下，分別考察乙醇濃度（55%，65%，75%，85%，95%），料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶45），超聲溫度（40，50，60，70，80 °C），超聲時間（5，15，25，35，45 min），超聲功率（50，140，160，180，200 W）對靈芝三萜得率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以靈芝三萜得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響 不同乙醇濃度下靈芝三萜得率如圖1所示。

由圖1可以看出：靈芝三萜得率隨乙醇濃度升高而提高。當(dāng)乙醇濃度為55%時，靈芝三萜得率僅為0.29%；當(dāng)乙醇濃度為95%時，靈芝三萜得率最高，為1.69%；而乙醇濃度在85%～95%之間時，靈芝三萜得率非常相近。

2.1.2 料液比對靈芝三萜得率的影響 不同料液比下靈芝三萜得率如圖2所示。

由圖2可以看出：在料液比為1∶30時，靈芝三萜得率最高，為1.71%；當(dāng)料液比小于1∶30時，溶劑量過少，樣液過于粘稠，不利于超聲波空化作用的產(chǎn)生，也不利于超聲波在溶劑中的傳播擴(kuò)散，所以提取率相對較低；隨著料液比的增大，靈芝三萜得率提高，但是當(dāng)料液比超過1∶30時，可能因溶劑量過大反而影響了超聲波對靈芝細(xì)胞的破碎，進(jìn)而影響了機(jī)械學(xué)和熱力學(xué)作用，導(dǎo)致靈芝三萜得率降低。

2.1.3 超聲溫度對靈芝三萜得率的影響 不同超聲溫度下靈芝三萜得率如圖3所示。

由圖3可以看出：當(dāng)超聲溫度在40～50 ℃之間時，靈芝三萜得率隨溫度升高而提高；而溫度在50～70 ℃之間時，靈芝三萜得率增幅較??；當(dāng)溫度為70 ℃時，靈芝三萜得率最高，為2.09%。說明隨著超聲溫度的升高，分子運(yùn)動愈發(fā)劇烈，加快了靈芝三萜的擴(kuò)散和溶劑向靈芝內(nèi)部的滲透，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)三萜的浸出。

2.1.4 超聲時間對靈芝三萜得率的影響 不同超聲時間下靈芝三萜得率如圖4所示。

由圖4可以看出：當(dāng)超聲時間為25 min時，靈芝三萜得率最高，為1.95%；當(dāng)超聲時間少于25 min時，靈芝三萜得率隨超聲時間延長而增大；但當(dāng)超聲時間超過25 min后，靈芝三萜得率反而降低，其原因可能是長時間的超聲處理破壞了靈芝三萜的結(jié)構(gòu)。endprint

2.1.5 超聲功率對靈芝三萜得率的影響 不同超聲功率下靈芝三萜得率如圖5所示。

由圖5可以看出：當(dāng)超聲處理功率為150 W時，靈芝三萜得率最高，為1.81%；功率過小，超聲波振動幅度過小，靈芝細(xì)胞壁破碎不完全，三萜溶出不徹底；功率過大，則造成溶液分子運(yùn)動加劇，反而使得率略降低。說明過高或過低的超聲波功率均不利于靈芝三萜的提取。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）為自變量，以靈芝三萜得率為評價指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，各因素對靈芝三萜提取得率影響的主次順序?yàn)镃>A>B>D，即超聲溫度>乙醇濃度>超聲時間>料液比，其中超聲溫度的影響最大，料液比的影響最小。由正交試驗(yàn)得到最佳工藝組合為A3B1C3D1。

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對工藝組合A3B1C3D1和A3B1C3D2進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果為工藝組合A3B1C3D1的得率（2.19%）高于A3B1C3D2的得率（2.13%），表明正交試驗(yàn)方法優(yōu)化得到的靈芝三萜提取工藝條件可靠，最佳工藝條件為乙醇濃度85%、超聲時間15min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25。

3 結(jié)論

本研究以靈芝為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計，確定超聲波輔助乙醇浸提靈芝三萜的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對三萜提取影響程度大小順序?yàn)槌暅囟?乙醇濃度>超聲時間>料液比，最佳工藝條件為乙醇濃度85%、超聲時間15min、超聲溫度80 ℃、料液比1∶25，此時靈芝三萜得率為2.19%。該方法具有工藝簡單、提取率高、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可為靈芝三萜產(chǎn)品的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

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