植物反應(yīng)器在動物疫苗研究中的應(yīng)用

王淼 王建民 葛云俠 楊藝 史振聲

摘要：用植物生產(chǎn)像疫苗這樣高價值的藥用產(chǎn)品，這一概念已經(jīng)提出了２０年。直到現(xiàn)在為止這項技術(shù)仍不是十分成熟。最初人們都看好瞬時表達(dá)；證實了這種疫苗對人和動物是有效的；有些植物疫苗已經(jīng)進(jìn)入了人的Ⅰ期臨床試驗，還有一些正準(zhǔn)備進(jìn)行；監(jiān)管的要求比以往更加嚴(yán)格。生產(chǎn)注射用產(chǎn)品可能會比生產(chǎn)可食用疫苗容易。該技術(shù)已被證明更廉價，更易于尋找生產(chǎn)材料。由于植物疫苗對于生產(chǎn)抵御引起大流行的病毒快速應(yīng)答疫苗有無法替代的優(yōu)勢，在未來將會為人類的發(fā)展做出巨大的貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：動物疫苗；植物反應(yīng)器；轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基因表達(dá)

中圖分類號：S852.4；Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）16－3425-02

Ｐｌａｎｔ－Mａｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌｓ

ＷＡＮＧ Ｍｉａｏａ，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｍｉｎａ，ＧＥ Ｙｕｎ－ｘｉａｂ，ＹＡＮＧ Ｙiａ，ＳＨＩ Ｚｈｅｎ－ｓｈｅｎｇｃ

（ａ．Cｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Aｎｉｍａｌ Sｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Vｅｔｅｒｉｎａｒｙ Mｅｄｉｃｉｎｅ； ｂ．Sｃｈｏｏｌ ｏｆ Bｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；

ｃ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｉｇｈ－ｖａｌｕｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｓ ２０ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ ａｎｄ ｉｓ ｏｎｌｙ ｎｏｗ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｉｎｋ ｏｆ ｒｅａｌｉｓａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｒｅｌｉａｎｃｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｈａｓ ｌａｒｇｅｌｙ ｇｉｖｅｎ ｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｒｏｏｆｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｆ ｅｆfiｃａｃｙ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ； ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｎｔ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｈａｓｅ Ⅰ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｏｒｅ ａｒｅ ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ； ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｃｌｅａｒ ｔｈａｎ ｅｖｅｒ． Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｃｈｅａｐ ｅｄｉｂｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｓ ｇｉｖｅｎ ｗａｙ ｔｏ ａ ｒｅａｌｉｓａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｗｅｌｌ ｂｅ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｐｒｏｖｅｎ ｉｔｓ ｗｏｒｔｈ ａｓ ａ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｃｈｅａｐ， ｅａｓｉｌｙ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｉｔ ｎｏｗ ｎｅｅｄｓ ｔｏ fiｎｄ ｉｔｓ ｎｉｃｈｅ ｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅａｌｉｓｅｄ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ fiｅｌｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ was ｒｅｖｉｅｗｅｄ， ｓｕｃｈ ａｓ ｒａｐｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｒｒｏｒ ａｇｅｎｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｖａｃｃｉｎｅ； ｐｌａｎｔ； ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ； ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

用植物反應(yīng)器大批量生產(chǎn)廉價疫苗在這２０年里一直是科研工作者的努力方向，現(xiàn)在用來做植物疫苗的植物和系統(tǒng)有很多［１］，包括煙草、擬南芥、苜蓿、菠菜、馬鈴薯、微藻、草莓、胡蘿卜、番茄、蘆薈和單細(xì)胞藻類等。外源蛋白已經(jīng)成功地在玉米、水稻、大豆和煙草的種子，馬鈴薯、番茄和草莓的果實，煙草和玉米的懸浮細(xì)胞，發(fā)根培養(yǎng)物還有多種植物的葉綠體中表達(dá)。本文將從表達(dá)宿主的角度對植物疫苗近些年來的研究成果進(jìn)行總結(jié)，并對未來進(jìn)行展望。

１果實和根莖

在對可使用果實和根莖類植物的研究中，番茄是較為合適的選擇。Ｐａｚ等［２］在轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)了人乳頭瘤病毒嵌合蛋白１６Ｌ１（ＨＰＶ－１６Ｌ１），將ＨＰＶ－１６ Ｅ６和Ｅ７兩個蛋白進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，試驗表明，這種有預(yù)防和治療作用的重組疫苗可以從植物獲得，盡管植物表達(dá)的病毒樣顆粒可以同時刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和Ｔ細(xì)胞應(yīng)答，遺憾的是表達(dá)量特別低，只占可溶性總蛋白的０．０５％～０．１０％。Ｔｈａｎａｖａｌａ等［３］利用馬鈴薯表達(dá)ＨｂｓＡｇ，臨床試驗中對志愿者進(jìn)行常規(guī)免疫，可以產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但表達(dá)量不高。Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ等［４，５］在鯉魚飼料里加入轉(zhuǎn)基因馬鈴薯提取物，結(jié)果在腸道里檢測出了含有綠色熒光蛋白的ＬＴ－Ｂ，同時引起了特異性的全身免疫反應(yīng)。

２可食用多葉作物

現(xiàn)在，苜蓿、菠菜、羽扇豆、萵苣這一類的可食用多葉作物已經(jīng)成功地用來生產(chǎn)抗原。最值得矚目的是Ｗｅｂｓｔｅｒ等［６］的研究，他們成功地在轉(zhuǎn)基因生菜中表達(dá)了麻疹病毒血凝素（ＭＶ－Ｈ）蛋白，并激發(fā)了小鼠的免疫反應(yīng)。這是首次證明植物來源的ＭＶ－Ｈ可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體；其次，這種ＤＮＡ介導(dǎo)的麻疹免疫可能會極大地推動口服植物來源麻疹病毒疫苗的發(fā)展。

３種子

現(xiàn)在應(yīng)用可食用或經(jīng)簡單處理就可食用的種子研究出了大量的細(xì)菌和病毒的抗原或抗體。ＰｒｏｄｉＧｅｎｅ公司圍繞著用玉米種子生產(chǎn)多種疫苗和其他蛋白開展了很多研究，并且得到了一種可以作為傳染性胃腸炎病毒亞單位疫苗的玉米，這種玉米可以有效地激發(fā)豬的全身免疫和粘膜免疫［７］。Ｗｕ等［８］研究了能夠表達(dá)傳染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２蛋白的水稻，將種子給雞食用，可以獲得較好的免疫保護(hù)。最近一項研究，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等［９］在水稻中構(gòu)建了一個豬蛔蟲（ｓ-１６）保護(hù)性抗原與霍亂毒素（ＣＴ）Ｂ亞單位（ＣＴＢ）的融合體，給小鼠口服可以產(chǎn)生ｓ－１６特異性抗體反應(yīng)，攻毒后肺部蟲體的檢出量少于對照組。

４非食用作物

用煙草作為植物反應(yīng)器已有報道，在這里不作過多的說明。早期正是煙草的使用證明了植物疫苗的可行性。２０年前人們第一次用植物反應(yīng)器得到了疫苗相關(guān)蛋白。近幾年Ｂｉｅｍｅｌｔ等［１０］、Varsani等［11］的研究，在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯中分別得到了兩種不同的人乳頭瘤病毒。雖然表達(dá)量很低（最大３０ ｍｇ／ｋｇ），但證明植物反應(yīng)器不僅可以表達(dá)蛋白樣疫苗，病毒樣疫苗也同樣可以表達(dá)。

５葉綠體／質(zhì)的表達(dá)

盡管早期的研究工作多是在經(jīng)典植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)或核轉(zhuǎn)化方面，近些年關(guān)于利用葉綠體作為反應(yīng)器也越來越受到關(guān)注。有人擔(dān)心糖基化的過程會遇到障礙，新的研究發(fā)現(xiàn)，這個過程可以在成熟葉綠體中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中完成［１２］。不出所料，細(xì)菌源性的抗體表達(dá)可以在葉綠體中表達(dá)，他們具有相似的蛋白質(zhì)折疊機(jī)制，并且沒有下游像糖基化這樣的加工過程。Ｃｈｅｂｏｌｕ等［１３］在葉綠體中高效表達(dá)了對阿米巴原蟲ＬａｃＡ凝集素片段非常有效的免疫原性抗原（每年有１００多萬人死于阿米巴原蟲感染），皮下注射小鼠試驗產(chǎn)生了高水平的ＩｇＧ滴度。設(shè)想一下如果每株植株產(chǎn)生２４ ｍｇ ＬａｃＡ，那么每０．４０５ ｈｍ２轉(zhuǎn)基因植物可以生產(chǎn)２９００萬劑的疫苗。Ｓｃｏｔｔｉ等［１４］將ＨＩＶ 蛋白成功地在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，表達(dá)量約為３６０ ｍｇ／ｋｇ，同時將其組裝進(jìn)入能在動物細(xì)胞復(fù)制的類病毒。這樣一來，就可以在植物中大量生產(chǎn)與ＨＩＶ相關(guān)的疫苗。

６細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

有兩個例子說明細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是可行：一是目前世界上用于人體試驗的治療性蛋白是用胡蘿卜懸浮細(xì)胞或者煙草細(xì)胞生產(chǎn)的重組人葡萄糖腦苷酶。二是惟一一個授權(quán)生產(chǎn)的產(chǎn)品，新城疫純化注射疫苗，它是由美國Ｄｏｗ Ａｇｒｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司研究的煙草懸浮細(xì)胞系生產(chǎn)的。２００９年６月１６日Ｇｅｎｚｙｍｅ網(wǎng)站稱，他們用ＣＨＯ細(xì)胞生產(chǎn)出用來治療因為感染杯狀病毒（囊病毒２１１７）引起的戈謝病的干擾素。最新的報告指出：美國食品和藥品管理局已和那些在做戈謝病酶替代療法臨床試驗的公司簽署協(xié)議，允許他們的藥品在獲得正式批準(zhǔn)前使用。

７展望

雖然植物疫苗歷經(jīng)了２０年的研究，還沒有一種通過Ⅰ期臨床試驗。但是用植物反應(yīng)器生產(chǎn)動物疫苗和生物制劑具有不需要昂貴的發(fā)酵和純化系統(tǒng)、冷鏈運(yùn)輸和嚴(yán)格的無菌操作的優(yōu)勢。研究人員通過對穩(wěn)態(tài)表達(dá)系統(tǒng)的研究，利用組織特異性表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)的方法成功地獲得了大量的轉(zhuǎn)基因谷物。不過評價一個表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)劣的關(guān)鍵還是在于表達(dá)量的高低，而轉(zhuǎn)基因疫苗的表達(dá)量限制了其成為商業(yè)疫苗。葉綠體系統(tǒng)雖然能夠高效地表達(dá)各種蛋白，但因為沒有下游糖基化過程使得糖類無法表達(dá)?？偟膩碚f，盡管植物表達(dá)系統(tǒng)為生產(chǎn)疫苗抗原和生物制劑提供了新途徑，但是在表達(dá)量、純化方法、功能特異性、口服給藥以及臨床試驗方面還需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

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