蕈樣肉芽腫白細胞介素13及其受體表達

丁承 王平 劉嬌 黎釗 李劉雨 劉東銀 鄭俊惠 沈宏

310009杭州，安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院皮膚科（丁承、王平）；浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科（劉嬌）；杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科（黎釗、李劉雨、劉東銀、鄭俊惠、沈宏）

蕈樣肉芽腫白細胞介素13及其受體表達

丁承 王平 劉嬌 黎釗 李劉雨 劉東銀 鄭俊惠 沈宏

310009杭州，安徽醫(yī)科大學附屬杭州臨床學院皮膚科（丁承、王平）；浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州第三醫(yī)院皮膚科（劉嬌）；杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科（黎釗、李劉雨、劉東銀、鄭俊惠、沈宏）

目的探討白細胞介素13（IL?13）及其受體在蕈樣肉芽腫（MF）皮損中的表達及臨床意義。方法2010年1月至2016年3月收集杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床、病理、免疫表型和（或）T細胞受體基因重排檢測確診的MF石蠟組織標本34份，ⅠA期5例，ⅠB期9例，ⅡA期17例和ⅡB期3例。選擇正常皮膚組織10份作為對照。應用免疫組化方法分別檢測IL?13、IL?13Rα1及IL?13Rα2的表達。結果IL?13、IL?13Rα1和IL?13Rα2表達于各期MF皮損組織的異形淋巴樣細胞和親表皮性淋巴樣細胞，IL?13Rα2幾乎高表達于所有的MF皮損組織。正常皮膚組織及淋巴細胞均不表達IL?13及其受體。隨著MF病程的進展，皮損組織IL?13及其受體表達率升高。IL?13、IL?13Rα1及IL?13Rα2的表達率在Ⅰ期MF皮損（分別為10.00%±3.14%、21.43%±6.88%、31.14%±6.38%）均顯著低于Ⅱ期MF皮損（分別為27.50%±11.00%、39.45%±9.43%、44.40%±11.15%），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但在ⅠA期與ⅠB期之間以及ⅡA期與ⅡB期之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論IL?13及其受體尤其是IL?13Rα2有望成為MF早期診斷和生物學行為預判的標志物。

蕈樣真菌??；細胞轉化，腫瘤；白細胞介素13；白細胞介素13受體α1亞單位；白細胞介素13受體α2亞單位

蕈樣肉芽腫（MF）的斑片乃至斑塊狀皮損進展極其緩慢，可持續(xù)數(shù)年至數(shù)十年不等。然而，一旦出現(xiàn)進展期皮損如斑塊或腫瘤，則顯示顯著的侵襲性生物學行為，包括累及外周血、淋巴結或內(nèi)臟器官［1］。探尋一種能夠預判MF生物學行為轉化的標志物，對MF的臨床管理和治療選擇極其重要。Th2細胞因子如白細胞介素（IL）?4、IL?10等［2］，在調(diào)控腫瘤的增殖與擴散中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，同樣屬于Th2細胞因子的IL?13，作為多種人類惡性腫瘤的自分泌因子，可促進腫瘤的侵襲［3］；而IL?13受體IL?13Rα1及IL?13Rα2是一種新近發(fā)現(xiàn)的血源性受體家族成員之一，與IL?13具有高度專一的親和力，被認為是一個獨特的、有前途的腫瘤基因治療候選靶點之一［4?5］。我們檢測分析不同時期MF患者皮損中IL?13及其受體的表達，以期為MF提供一種新的生物學行為轉化與進展標記和分子治療靶點。

一、對象與方法

1.研究對象：收集杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科2010年1月至2016年3月MF患者34例，其中，男20例，女14例；發(fā)病年齡（50.94±21.47）歲；病程14個月至17（6.80± 4.14）年。所有病例均具有完整的臨床病理學資料，經(jīng)臨床、組織病理、免疫表型檢測和（或）T細胞受體基因重排分析及系統(tǒng)檢查后確診。臨床分期：斑片期14例，斑塊期17例，腫瘤期3例；TNMB分期：ⅠA期5例，ⅠB期9例，ⅡA期17例，ⅡB期3例。另收集同時期正常皮膚組織石蠟存檔標本10份，年齡（50.58±20.05）歲。收集我院乳腺癌石蠟存檔標本2份作陽性對照。本研究獲得杭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書；未滿18歲患兒征得其監(jiān)護人同意，并簽署知情同意書。

2.主要試劑：鼠抗人IL?13、IL?13Rα1、IL?13Rα2單克隆抗體（英國abcam公司），兔/鼠通用型免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），乙二胺四乙酸（Tris?EDTA）（上海將來實業(yè)股份有限公司），3%H2O2溶液（武漢博士德生物技術有限公司）。

3.免疫組化EnVision法檢測IL?13、IL?13Rα1和IL?13Rα2的表達：將切片常規(guī)脫蠟、水化，置pH 9.0 EDTA緩沖液中水??；3%過氧化氫溶液室溫孵育；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入IL?13（1∶200）、IL?13Rα1（1∶200）、IL?13Rα2（1∶1200）單抗37℃孵育；滴加二抗37℃孵育；DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。乳腺癌組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，HE染色作組織學對照。鏡下以胞核和（或）胞質(zhì)見棕黃色或棕褐色反應物為陽性，每張切片隨機選5個高倍（400倍）視野，計數(shù)陽性細胞及淋巴細胞。陽性率=（某區(qū)域內(nèi)陽性細胞總數(shù)/該區(qū)域內(nèi)淋巴細胞總數(shù)）×100%。

二、結果

1.IL?13、IL?13Rα1和IL?13Rα2在MF皮損中的表達：正常皮膚組織及淋巴細胞均不表達IL?13及其受體。乳腺癌組織中IL?13和IL?13Rα2表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)，而IL?13Rα1表達于腫瘤細胞的細胞膜。而各期MF皮損組織均有表達，特別是惡性淋巴細胞（胞核大而深染或胞質(zhì)豐富淋巴樣細胞）和親表皮性淋巴樣細胞，IL?13Rα2幾乎高表達于所有的MF皮損組織。IL?13和IL?13Rα2表達于細胞質(zhì)，IL?13Rα1表達于細胞膜。見圖1～3。

2.不同期MF皮損中IL?13、IL?13Rα1和IL?13Rα2表達陽性率比較：IL?13、IL?13Rα1、IL?13Rα2在ⅠA期與ⅠB期MF皮損組間陽性率差異均無統(tǒng)計學意義（Z值分別為0.805、0.738、0.067，均P＞0.05），ⅡA期與ⅡB期間差異亦無統(tǒng)計學意義（Z值分別為1.485、0.636、0.848，均P＞0.05），但Ⅰ期MF皮損低于Ⅱ期MF皮損（Z值分別為4.374、4.351、3.337，均P＜0.01）。見表1。

三、討論

MF是最常見的皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL），盡管早期MF呈惰性病程，但對于其臨床管理仍很困難，主要體現(xiàn)在對MF的早期確診和生物學行為的預判［6］。目前，組織病理是確診MF的主要手段，但MF早期常常缺乏病理學特征（如異形淋巴細胞和向表皮性），免疫組化和T細胞受體基因重排分析可作為MF的輔助診斷手段，但免疫組化的診斷依據(jù)僅僅是某些成熟T細胞標記物如CD7的丟失，后者常常會出現(xiàn)假陽性結果［7］。另外，MF生物學行為的預判對預后和采取適應性治療極其重要，因為MF一旦由惰性進展為侵襲性生物學行為，常常已是晚期且預后不良［1，8］。因此，探尋一種對MF早期確診和生物學行為預判的標志物具有重要臨床價值。

IL?13作為Th2細胞因子廣泛參與纖維化、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。IL?13在多種腫瘤如霍奇金淋巴瘤、乳腺癌等中不僅可以直接促進腫瘤細胞增殖，還參與下調(diào)免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視，促進腫瘤的增殖擴散［3?5，10］。有學者發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的CTCL細胞株和Sézary綜合征（SS）腫瘤細胞體外培養(yǎng)均可分泌IL?13［2，11］。Geskin等［12］證實，IL?13及其受體在各期MF患者皮損高表達于惡性淋巴細胞。

IL?13受體主要由IL?13Rα1、IL?13Rα2、IL?4R和IL?2Rγ組成，發(fā)揮主要作用的為IL?13Rα1和IL?13Rα2。IL?13Rα2缺乏與JAK激酶結合，啟動信號傳遞所必須的box1、box2功能域，但可以更高效地與IL?13結合，阻斷IL?13信號通過IL?13Rα1進行傳導［13］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中，IL?13Rα1和IL?13Rα2表達水平增高，尤其IL?13Rα2在腫瘤組織中高表達，但其在腫瘤中的作用機制尚不明確［3?5，14］。IL?13Rα2介導的假單胞菌融合蛋白（IL?13PE38QQR）經(jīng)體外細胞和動物實驗證明對惡性腫瘤細胞有特異性的殺傷作用，已進入惡性腦膠質(zhì)瘤的Ⅱ期臨床階段，并取得滿意的療效［15?16］。

圖1～3 蕈樣肉芽腫（MF）皮損中白細胞介素（IL）?13（圖1）、IL?13 Rα1（圖2）、IL?13 Rα2（圖3）的表達（免疫組化×200） 正常皮膚組織中部分血管內(nèi)皮細胞表達IL?13（圖1A），未見IL?13 Rα1（圖2A）和IL?13Rα2（圖3A）的表達；MF皮損中部分親表皮性異形淋巴細胞表達IL?13（圖1B～1D），部分親表皮性異形淋巴細胞胞膜表達IL?13 Rα1（圖2B～2D），部分親表皮性異形淋巴細胞表達IL?13 Rα2（圖3B～3D）

表1 各期蕈樣肉芽腫皮損中白細胞介素（IL）?13、IL?13Rα1、IL?13Rα2陽性細胞表達率比較（%，±s）

表1 各期蕈樣肉芽腫皮損中白細胞介素（IL）?13、IL?13Rα1、IL?13Rα2陽性細胞表達率比較（%，±s）

注：a：為ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期4期之間比較的結果

分期Ⅰ期ⅠA期ⅠB期Ⅱ期ⅡA期ⅡB期Z值a P值a例數(shù)14 IL?13 10.00±3.14 9.20±2.86 10.44±3.36 27.50±11.00 25.58±10.23 36.67±12.58 22.18＜0.01 5 9 2 0 17 3 IL?13Rα1 21.43±6.88 20.00±7.38 22.22±6.90 39.45±9.43 39.82±7.38 37.33±20.03 18.96＜0.01 IL?13Rα2 31.14±6.38 30.60±3.65 31.44±7.70 44.40±11.15 43.24±10.32 51.00±15.87 13.60＜0.01

我們研究表明，相對于正常皮膚組織，各期MF患者皮損中IL?13及其受體的表達量均增高，尤其IL?13Rα2幾乎高表達于所有的MF皮損組織，這與Geskin等［12］的研究結果相似。且隨著病情的進展，IL?13及其受體表達水平顯著升高。Ⅰ期（斑片期）和Ⅱ期（斑塊期/腫瘤期）MF患者皮損中IL?13及其受體的表達差異有統(tǒng)計學意義，而ⅠA期和ⅠB期之間、ⅡA期和ⅡB期MF皮損之間IL?13及其受體的表達差異無統(tǒng)計學意義。提示IL?13作為MF腫瘤細胞的自分泌因子以及腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可能不僅參與MF的發(fā)生，也參與推進MF生物學行為轉化，即由相對惰性的Ⅰ期（斑片期）進入侵襲期Ⅱ期（斑塊期/腫瘤期），但具體機制有待進一步研究。

IL?13及其受體介導的信號通路有望為MF發(fā)病機制的研究提供新的思路。IL?13Rα2在人類其他多種惡性腫瘤中作為分子靶向治療的靶點已經(jīng)有了一定突破，而且我們證實IL?13Rα2在MF皮損中高水平特異性表達，有望為MF生物學行為轉化與進展提供一種新的標記和候選的分子治療靶點。

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Expression of interleukin?13 and its receptors in mycosis fungoides

Ding Cheng,Wang Ping,Liu Jiao,Li Zhao,Li Liuyu,Liu Dongyin,Zheng Junhui,Shen Hong
Department of Dermatology,Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University,Hangzhou 310009,China（Ding C,Wang P）;Department of Dermatology,Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310009,China（Liu J）;Department of Dermatology,Hangzhou Third

Wang Ping,Email:dermwang@aliyun.com

ObjectiveTo measure the expression of interleukin?13（IL?13）and its receptors in mycosis fungoides（MF）lesions,and to investigate their clinical significance.MethodsA total of 34 paraffin?embedded specimens of MF,which was confirmed by clinical and histopathological features, immunophenotyping and/or T?cell receptor gene rearrangements,were collected from Hangzhou Third People′s Hospital between January 2010 and March 2016.According to the tumor?node?metastasis（TNM）staging system,5 patients were at stageⅠA,9 at stageⅠB,17 at stageⅡA,and 3 at stageⅡB.Ten normal skin tissue specimens served as controls.Immunohistochemical study was conducted to measure the expression of IL?13,IL?13Rα1 and IL?13Rα2.ResultsIL?13,IL?13Rα1 and IL?13Rα2 were all expressed in atypical lymphoid cells and epidermotropic lymphoid cells in MF lesions at various stages.IL?13Rα2 was highly expressed in all the MF lesions.None of IL?13 and its receptors were expressed in normal skin tissues and lymphocytes.The expression rates of IL?13 and its receptors in MF lesions increased along with the progression of MF.Additionally,the expression rates of IL?13（10.00% ±3.14%）,IL?13Rα1（21.43%±6.88%）and IL?13Rα2（31.14%±6.38%）significantly decreased in MF lesions at stageⅠcompared with those at stageⅡ（27.50%±11.00%,39.45%±9.43%,44.40%±11.15%,respectively,allP＜0.05）,but no significant differences were observed between stageⅠA andⅠB,or between stageⅡA andⅡB（P＞0.05）.ConclusionIL?13 and its receptors,especially IL?13Rα2,may be expected to serve as biomarkers for early diagnosis of MF and prediction of its biological behaviors.

Mycosis fungoides;Cell transformation,neoplastic;Interleukin?13;Interleukin?13 receptor alpha1 subunit;Interleukin?13 receptor alpha2 subunit

王平，Email：dermwang@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.013

浙江省公益技術研究社會發(fā)展項目（2016C33206）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYB200）

People′s Hospital,Hangzhou 310009,China（Li Z,Li LY,Liu DY,Zheng JH,Shen H）

Fund programs:Zhejiang Provincial Public Welfare Technology Research and Social Development Project（2016C33206）;Medical and Health Technology Development Program in Zhejiang Province（2014KYB200）

2016?06?02）

（本文編輯：尚淑賢）