開心解郁丸對抑郁大鼠神經(jīng)元可塑性調控基因表達的影響＊

潘菊華，王彥云，李多嬌，陳宇霞，陳 朝，張 穎，黃世敬

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

開心解郁丸對抑郁大鼠神經(jīng)元可塑性調控基因表達的影響＊

潘菊華，王彥云，李多嬌，陳宇霞，陳 朝，張 穎，黃世敬＊＊

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

目的：研究開心解郁丸治療抑郁癥的療效及機理。方法：采用慢性不可預見性溫和應激疊加孤養(yǎng)大鼠抑郁模型研究開心解郁丸對糖水偏嗜、水迷宮等抑郁樣行為及神經(jīng)元可塑性相關基因糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB）、5-羥色胺受體2C（HTR2C）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的調控作用。結果：大鼠抑郁模型中，開心解郁丸可顯著增加糖水消耗百分比，一定程度上增加水迷宮逃避潛伏期，明顯降低神經(jīng)元可塑性相關基因GSK-3β和HTR2C mRNA、明顯升高CREB和VEGF mRNA。結論：開心解郁丸對抑郁大鼠有一定的抗抑郁作用，可能與調節(jié)神經(jīng)元可塑性相關基因GSK-3β、CREB、HTR2C和VEGF有關。

開心解郁丸 抑郁 大鼠 神經(jīng)元可塑性

抑郁癥為常見的情感精神障礙性疾病，發(fā)病率為3%-11%，致殘率高，易復發(fā)，自殺率達15%，是全球疾病負擔最重的三大疾病之一。目前抗抑郁藥存在延遲起效、緩解率低、耐受性差、易出現(xiàn)毒副反應等問題。根據(jù)多年治療抑郁癥的經(jīng)驗，本課題組提出“虛氣留滯”病機理論，即元氣虧虛，氣血相失，氣血津液運行失常，從而導致氣滯、血瘀、痰凝、絡阻等，并提出益氣開郁的治法[1]。運用開心散合四逆散加減形成的中藥制劑開心解郁丸（人參、柴胡、巴戟天、茯苓、赤芍等）具有培元通滯、益氣開郁之功效，能有效改善患者的精神認知和軀體癥狀[2]，研究其療效機理有較大的社會意義。

抑郁癥為多因素共同致病，一般認為與神經(jīng)遞質改變、血管發(fā)生、神經(jīng)元可塑性及神經(jīng)再生障礙有關。神經(jīng)元可塑性包括突觸強度改變(遞質受體水平的增強、抑制)、突觸連接數(shù)量改變、神經(jīng)元構建變化。抑郁癥的發(fā)生可能是由于神經(jīng)元做出適當調節(jié)的能力和/或構建損害[3,4]。其機制主要涉及5-羥色胺（5-HT）及其受體、核轉錄因子環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB）等信號分子及其調控?？挂钟羲幬锟梢宰饔糜谏窠?jīng)元可塑性的主要調節(jié)因子，進而引起神經(jīng)元可塑性提高，產(chǎn)生抗抑郁作用。前期研究表明，開心解郁丸可調控單胺遞質及其受體[5]，本研究進一步觀察開心解郁丸對神經(jīng)元可塑性相關調節(jié)因子的影響，以探討其抗抑郁療效機理。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

開心解郁丸藥粉，（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院大興制劑室，批號：20140418）。經(jīng)測定，該藥粉含橙皮苷1.524%，柚皮苷、芍藥苷、耐斯糖、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、新橙皮苷含量在0.1-0.4%，甘草苷、甘草酸銨、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D含量小于0.1%[6]。陽性對照藥鹽酸氟西汀（禮來蘇州制藥有限公司，批號：4139A）。

表1 引物序列

蔗糖、氯仿、異丙醇、無水乙醇（北京化學試劑公司提供）均為分析純，Trizol試劑，（Life technologies公司，批號：）；FastQuant RT Kit逆轉錄試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號：）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國應用生物公司，批號：）；7900HT型熒光定量PCR儀，美國應用生物公司；高速冷凍離心機，HITACHI公司。

1.2 動物模型

SD大鼠48只，雄性，SPF級，體質量（220±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供（許可證編號：SYXK（京）2012-0001）。采用慢性不可預見性溫和應激（CUMS）疊加孤養(yǎng)的方法建立抑郁癥模型。CUMS方法改進包括夾尾1 min；禁水24 h；禁食24 h；4℃冰水游泳5 min；45℃環(huán)境5 min；明暗顛倒24 h；電擊足底5 min；異物放置24 h；潮濕墊料24 h；鼠籠傾斜24 h；水平振蕩5 min等刺激。這些刺激每天隨機采取一種，使動物不能預料刺激發(fā)生，共42 d。除正常組外，CUMS的同時單籠隔離飼養(yǎng)。

1.3 分組及給藥

實驗前大鼠每籠3-5只正常飼養(yǎng)，適應環(huán)境后進行糖水試驗，根據(jù)糖水消耗百分比隨機分為正常組、模型組、開心解郁丸組、鹽酸氟西汀組，每組12只。治療組在抑郁造模的同時開始灌胃給藥。開心解郁丸給藥劑量0.9 g·kg-1·d-1，采用無菌水將9 g藥粉配成100 mL混懸液。鹽酸氟西汀給藥劑量2.0 g·kg-1·d-1，1片（20 mg）用無菌水配成100 mL混懸液。兩者灌胃體積均為1 mL·100 g-1體質量，連續(xù)灌胃42 d。

2 實驗方法

2.1 糖水偏嗜實驗

造模42 d后所有大鼠單籠飼養(yǎng)，配制1%蔗糖溶液，第1天放置2瓶糖水，第2天放置糖水和純水各1瓶，第3天禁水24 h，第4天給放置糖水和純水各1瓶并稱重，120 min后，取2瓶水再次稱重。記錄每只大鼠的糖水消耗量、純水消耗量，計算糖水消耗百分率=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）*100%[7]。

2.2 Morris水迷宮

采用Morris水迷宮法進行大鼠認知功能的測定,方法參見文獻[8],記錄大鼠逃避潛伏期。

2.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR）驗證差異表達mRNA

每組隨機取10只大鼠左側額葉皮質，采用RTPCR方法測定糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、5-羥色胺2C受體（HTR2C）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及內(nèi)參照GAPDH等mRNA。引物序列見表1，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。提取總RNA，RNA反轉錄后，熒光定量PCR檢測，反應條件：95℃ 5 min；95℃30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 35 sec，40 cycles；72℃ 8 min。

2.4 統(tǒng)計學方法

所測數(shù)據(jù)均以均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Games-Howell法進行分析。以P＜0.05為有顯著性差異的標準。

3 結果

3.1 糖水偏嗜實驗

與正常組比較，模型組大鼠糖水消耗百分比明顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，開心解郁丸組和鹽酸氟西汀組能顯著增加抑郁大鼠糖水消耗百分比（P＜0.05），見表2。

3.2 Morris水迷宮試驗

與正常組比較，模型組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，開心解郁丸組和鹽酸氟西汀組有Morris水迷宮逃避潛伏期的趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

3.3 RT-PCR驗證差異表達mRNA

與正常組比較，模型組大鼠額葉皮層中CREB mRNA表達降低（P＜0.05）；GSK-3β和HTR2C mRNA表達升高，VEGF mRNA表達降低，但無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，開心解郁丸和鹽酸氟西汀都有降低額葉皮層中GSK-3β和HTR2C mRNA表達的作用（P＜0.05），開心解郁丸可以升高CREB和VEGF mRNA表達的作用（P＜0.01，P＜0.05），見表4。

4 討論

本研究中陽性藥鹽酸氟西汀為選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRIs），選擇性抑制神經(jīng)元突觸前膜對5-HT的再攝取，使突觸間隙5-HT含量升高，但對多巴胺（DA）受體、M膽堿受體及H1組胺受體無影響。開心解郁丸調節(jié)單胺遞質的作用較鹽酸氟西汀更廣泛，可不同程度地增加腦內(nèi)5-HT、去甲腎上腺素（NA）、DA的水平[7]，與細胞膜上的單胺遞質受體結合來激活cAMP-CREB通路。5-HT2C受體（HTR2C）是其中的一種單胺遞質受體，HTR2C阻斷可能是SSRIs類治療抑郁癥的重要原因之一。

CREB是一種重要的核轉錄因子，它在神經(jīng)元功能和結構可塑性的調節(jié)中起重要的作用，是多條與抑郁癥相關的信號通路調節(jié)的交匯點，是抗抑郁藥物治療的重要靶點之一。GSK-3β具有調節(jié)CREB信號的作用，抑制GSK-3β會引起磷酸化CREB的顯著升高[9]。GSK-3β具有調節(jié)神經(jīng)生長與神經(jīng)可塑性的作用，應激刺激可增加小鼠海馬齒狀回GSK-3β的表達[10]。

CREB通過磷酸化激活調節(jié)下游基因轉錄進而發(fā)揮生物學效應。其中，CREB與VEGF受體的啟動子區(qū)域結合[11]，從而發(fā)揮調節(jié)神經(jīng)元可塑性的作用。VEGF能夠特異作用于內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖分化，促進血管的生長，有助于神經(jīng)元軸突的生長和存活，刺激膠質細胞增殖，對神經(jīng)和血管具有營養(yǎng)和保護雙重作用的VEGF受到了進一步的關注。VEGF已被認為是血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)相伴發(fā)生的一個重要的共有因子[12]。

表2 糖水偏嗜實驗中糖水消耗百分比（x±s，n=12）

表3 Morris水迷宮逃避潛伏期（x±s，n=12）

表4 RT-PCR驗證差異表達mRNA（x±s，n=10）

前期研究表明，開心解郁方能明顯提高抑郁大鼠腦皮質中5-HT、NE、DA和高香草酸（DA代謝產(chǎn)物）含量，上調海馬中5-HT1A受體mRNA和大腦皮層中5-HT2A受體mRNA水平，同時下調海馬中5-HT2A受體mRNA和大腦皮層中5-HT1A受體mRNA水平[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，開心解郁丸可明顯降低GSK-3β和HTR2C mRNA、升高CREB和VEGF mRNA水平。綜上，開心解郁丸調節(jié)5-羥色胺（5-HT）及其受體，抑制GSK-3β和激活CREB，進一步調節(jié)VEGF從而發(fā)揮調節(jié)神經(jīng)元可塑性的作用。

開心解郁丸的原處方（開心解郁方）在臨床研究中具有改善心情抑郁、興趣缺乏、乏力、心煩不安、失眠、心悸氣短、胸悶、善太息、自汗等癥狀，能增強顳下回、楔前葉等腦區(qū)神經(jīng)元自發(fā)活動，其中顳下回與人的記憶、面部表情相關[13]。該處方中人參、柴胡、遠志、石菖蒲、巴戟天等中藥均有改善學習記憶的功能。本課題組未公開的研究資料顯示，開心解郁丸能顯著增加CUMS所致抑郁小鼠跳臺潛伏期。但本研究中，采用Morris水迷宮分析開心解郁丸對學習記憶的影響，顯示該藥沒有明顯改善學習記憶的功能。該藥在學習記 憶方面不一致的結果，有待于進一步評估和確認。

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Effects of Kai-Xin Jie-Yu Pill on Neural Plasticity in Rats with Depression

Pan Juhua,Wang Yanyun,Li Duojiao,Chen Yuxia,Chen Zhao,Zhang Ying,Huang Shijing
(Guang′anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

This article was aimed to investigate the function and mechanism ofKai-Xin Jie-Yu(KXJY)pill on depression.The depression model rats were established by chronic unpredictable mild stress and separation.The sucrose preference test and Morris water maze(MWM)were performed.The regulation effects of neural plasticity-related genes including glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β),cAMP-response element binding protein(CREB),5-hydroxytryptamine 2C receptors(HTR2C),and vascular endothelial growth factor(VEGF)were determined.The results showed that among depression model rats,KXJY pill significantly increased the sucrose preference and the escape latency of MWM in a certain extent.The neural plasticity-related genes including GSK-3βand HTR2C mRNA were decreased significantly,whereas CREB and VEGF mRNA were increased significantly with the treatment of KXJY pill.It was concluded that KXJY pill had the function of reducing depression-like behavior,which might be mediated by the regulation of GSK-3β,CREB,HTR2C and VEGF.

Kai-Xin Jie-Yu pill,depression,rat,neural plasticity

10.11842/wst.2017.08.016

R965

A

2017-07-19

修回日期：2017-08-18

＊ 國家自然科學基金項目（81573790）：基于lncRNA-miRNA網(wǎng)絡對神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)調控探討益氣開郁中藥抗抑郁機制，負責人：黃世敬；北京市科技計劃“十病十藥”研發(fā)專項（Z161100001816013）：開心解郁顆粒治療血管性抑郁癥的成藥性研究，負責人：黃世敬；國家自然科學基金項目（81603443）：開心解郁丸通過長鏈非編碼RNA調控JAK-STAT通路治療血管性抑郁的研究，負責人：潘菊華。

＊＊ 通訊作者：黃世敬，研究員，主要研究方向：中醫(yī)腦病。

（責任編輯：陳 寧，責任譯審：王 晶）