藏藥余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工胃腸液中的穩(wěn)定性研究＊

吳玲芳，葉婷，梁林金，梁文儀，陳文靜，李 師，崔亞萍，亓 旗，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

藏藥余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工胃腸液中的穩(wěn)定性研究＊

吳玲芳，葉婷，梁林金，梁文儀，陳文靜，李 師，崔亞萍，亓 旗，張?zhí)m珍＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：研究余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工模擬胃、腸液中的穩(wěn)定性，為余甘子體內(nèi)代謝研究提供依據(jù)。方法：采用人工模擬胃液、腸液，體外溫孵，HPLC-UV法測(cè)定余甘子鞣質(zhì)部位中主要藥效成分的含量變化情況；分別考察余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工胃腸液中的穩(wěn)定性。結(jié)果：余甘子鞣質(zhì)部位中主要藥效成分沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸在人工胃液中比較穩(wěn)定，含量變化不明顯，降解剩余量在100%左右波動(dòng)，半衰期大于90 h；在人工腸液中不穩(wěn)定，含量先增加后減少，降解剩余量在100-300%之間波動(dòng)，半衰期大于10 h。結(jié)論：余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工胃液中比較穩(wěn)定，各成分含量變化不明顯；余甘子鞣質(zhì)部位主要藥效成分在人工腸液中不穩(wěn)定，主要成分含量先增加后減少，推測(cè)大分子可水解鞣質(zhì)可以轉(zhuǎn)化成小分子成分，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)所有成分均在降解。

余甘子 鞣質(zhì)部位 人工胃 腸液 穩(wěn)定性

余甘子PhyllanthusemblicaL.為大戟科Euphorbiaceae葉下珠屬植物余甘子的干燥成熟果實(shí)為藏族習(xí)用藥材[1]。余甘子鮮果酸甜酥脆而微澀，回味甘甜，故名余甘?！短票静荨贩Q之為庵摩勒，《本草綱目》稱之為庵摩落迦果。余甘子味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效。在傳統(tǒng)藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等。研究藥理學(xué)研究表明，余甘子具有抗炎，抗氧化，抗衰老，保肝等作用[2]。藏藥多富含鞣質(zhì)，組成“大三果”的余甘子、訶子、毛訶子均以鞣質(zhì)為主要成分。余甘子中富含鞣質(zhì)類、酚酸類、黃酮類和生物堿類等成分，其中鞣質(zhì)類和酚酸類成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[3-8]。本課題組前期研究并報(bào)道了余甘子鞣質(zhì)部位的提取純化工藝、總鞣質(zhì)含量測(cè)定、主要單體成分含量測(cè)定以及余甘子藥材及指紋圖譜評(píng)價(jià)研究[9-14]，對(duì)余甘子鞣質(zhì)部位體外部分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

中藥最常見的給藥方式是口服，余甘子多以散劑服用，而中藥及其復(fù)方要發(fā)揮臨床療效，必須經(jīng)人體吸收入血，到達(dá)靶器官，發(fā)生一系列的體內(nèi)代謝過程，最后經(jīng)糞便或者尿液排出體外，即藥物的ADME過程?？诜幬锏谝徊绞沁M(jìn)入胃腸，即藥物發(fā)生體內(nèi)代謝的第一個(gè)過程。從胃腸道吸收層面，研究中藥指標(biāo)成分吸收動(dòng)力學(xué)特征，有利于進(jìn)一步闡明其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)基礎(chǔ)[15]。目前未見文獻(xiàn)報(bào)道余甘子藥效成分在人工胃、腸共孵液中的穩(wěn)定性研究，故本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)影響口服藥物吸收的胃腸道環(huán)境下藥物主要藥效成分的穩(wěn)定性開展研究，為后期開展其吸收動(dòng)力學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Waters 1525型；DAD檢測(cè)器；分析軟件：Empower；手動(dòng)進(jìn)樣器；十萬分之一電子分析天平：（Sartorious，BT 25S，北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE昆山超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；具塞玻璃管（北京匯?？苾x有限責(zé)任公司）；渦旋混合器（北京北德科學(xué)器材有限公司）；微孔濾膜（津騰）；1 mL注射器（國(guó)藥集團(tuán)）；移液槍（eppendorf Research plus）；槍頭（北京匯?？苾x有限公司）。

1.2 材料

余甘子藥材購(gòu)自北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地為尼泊爾）、經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系閻玉凝教授鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥果實(shí)。沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸對(duì)照品，均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，純度為98%，符合含量測(cè)定的要求。

1.3 試劑

甲醇（Fisher，色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）；其他試劑均為分析純

2 方法

2.1 高效液相色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相為A（甲醇）：（B）0.2%冰醋酸水；流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

2.2 沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸供試品溶液配制

余甘子鞣質(zhì)部位的制備：取一定量余甘子藥材，粉碎，過篩，一定量乙醇提取，過大孔樹脂純化，回收至小體積，減壓干燥。

沒食子酸：精密稱取沒食子酸對(duì)照品2.34 mg，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，放置，作為沒食子酸儲(chǔ)備液，濃度為0.093 6 mg·mL-1。

柯里拉京：精密稱取柯里拉京對(duì)照品5.50 mg，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，放置，作為柯里拉京儲(chǔ)備液，濃度為0.55 mg·mL-1。

鞣花酸：精密稱取鞣花酸對(duì)照品4.50 mg，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶解并稀釋至刻度線，搖勻作為鞣花酸儲(chǔ)備液，濃度為0.18 mg·mL-1。

2.3 人工胃腸液的配制：

人工胃液：精密吸取稀鹽酸16.4 mL，置于1 000 mL量瓶，加蒸餾水約800 mL，胃蛋白酶約10 g，搖勻后加蒸餾水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得，PH約為1.5。

表1 流動(dòng)相梯度

人工腸液：稱取氯化鈉7.8 g，氯化鉀0.35 g、氯化鈣0.37 g、碳酸氫鈉1.37 g，磷酸二氫鈉0.32 g、氯化鎂0.02 g、葡萄糖1.4 g，置于1 000 mL量瓶，加蒸餾水定容至1 000 mL，搖勻即得，PH約為6.8。

2.4 余甘子鞣質(zhì)部位中主要藥效成分在人工胃液中穩(wěn)定性考察：

精密稱取實(shí)驗(yàn)室前期制備的余甘子鞣質(zhì)部位5.05mg，轉(zhuǎn)移至10mL棕色容量瓶中，用2.3項(xiàng)下制備的人工胃液溶解至刻度，得到溶液濃度濃度為0.505 mg·mL-1。將上述溶液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，平行5管，（37±1）℃避光孵育，于0、2、4、6、8、10、12 h，取樣0.5 mL ，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)高效液相色譜儀分析。

2.3 余甘子鞣質(zhì)部位中主要藥效成分在人工腸液中穩(wěn)定性考察：

精密稱取實(shí)驗(yàn)室前期制備的余甘子鞣質(zhì)部位5.00 mg，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，用2.3項(xiàng)下制備的人工腸液溶解并定容至刻度，得到溶液濃度為0.500 mg·mL-1。將上述溶液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，平行5管，（37±1）℃避光孵育，于0、2、4、6、8、10、12 h，分別取樣0.5 mL，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)液相色譜分析。

3 結(jié)果和分析

3.1 線性范圍的考察

精密吸取沒食子酸儲(chǔ)備液50、150、300、600、900、1 200、1 600、2 000 μL于2 mL容量瓶中，加50%的甲醇水溶液稀釋至刻度線，既得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品溶液。0.45 μm濾膜過濾，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2*106X-48 504，r=0.999 9，線性范圍為0.046 8～1.872 μg。

圖1 余甘子鞣質(zhì)部位中主要成分在人工胃(A)、腸(B)液中剩余含量曲線

精密吸取柯里拉京儲(chǔ)備液50、150、300、600、900、1 200 μL于2 mL容量瓶中，加50%的甲醇水溶液稀釋至刻度，既得柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品溶液。0.45 μm濾膜過濾，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到：柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=85 883X-13 156，r=0.999 9，線性范圍為0.275～11.00 μg。

精密吸取鞣花酸儲(chǔ)備液 20、50、150、300、600、1 200、1 600、2 000 μL于2 mL容量瓶，加50%的甲醇水溶液稀釋至刻度，既得鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品溶液。0.45 μm濾膜過濾，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到：鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1E+06X-552.2，r=0.999 9，線性范圍為0.036～3.68 μg。

3.2 精密度考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下方法，取沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸對(duì)照品高、中、低濃度樣品各3份，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸峰面積，其中高濃度三者的RSD值分別為1.30%、0.90%、1.12%，中濃度三者的RSD值分別為1.60%、0.71%、1.42%，低濃度三者的RSD值分別為1.80%、1.01%、0.99%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性考察

取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下方法，分別于制備后0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.85%、0.57%、1.98%，表明對(duì)照品溶液在24 h基本穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性考察

精密稱取同一批余甘子鞣質(zhì)部位粉末，按照2.2項(xiàng)下制備成6份供試品溶液進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算出沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸含量的RSD值分別為1.58%、2.53%、2.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 回收率

取已知含量的余甘子鞣質(zhì)部位樣品9份，每份約5 mg，精密稱定，分別加入一定體積的沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸對(duì)照品溶液，加50%甲醇分別定容至10 mL，25 mL，50 mL容量瓶，得到高、中、低濃度余甘子鞣質(zhì)部位樣品各3份，按照2.1項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算高、中、低濃度下三者平均回收率分別為：高濃度100.20%，100.60%，101.20%，RSD值分別為，2.58%、1.53%、1.20%，中濃度100.40%，101.40%，101.10%，RSD值分別為，1.20%、1.33%、1.24%，低濃101.03%，101.90%，101.48%，RSD值分別為，1.90%、1.42%、1.67%。

3.6 余甘子鞣質(zhì)部位在人工胃腸液中穩(wěn)定性

余甘子鞣質(zhì)部位在人工胃、腸液平均剩余含量（%）隨時(shí)間（h）變化曲線如圖1所示，結(jié)果顯示，余甘子鞣質(zhì)部位中沒食子酸（GA）、柯里拉京（Corilagin）、鞣花酸（EA）在人工胃液中比較穩(wěn)定，剩余量在100%左右波動(dòng)，變化不明顯。經(jīng)強(qiáng)制一級(jí)速率降解方程模擬，其半衰期均大于90 h，故未給出相應(yīng)的降解參數(shù)；而余甘子鞣質(zhì)部位中沒食子酸（GA）、柯里拉京（Corilagin）、鞣花酸（EA）在人工腸液里含量均先增加后減少，推測(cè)由其他成分分解而來，剩余量在100-300%之間波動(dòng)，經(jīng)強(qiáng)制一級(jí)速率降解方程模擬，其半衰期均大于10 h，故在此也未給出相應(yīng)的的降解參數(shù)。

4 總結(jié)與討論

可水解鞣質(zhì)是由酚酸與多元醇通過苷鍵和酯鍵形成的化合物，其組成的基本單位是沒食子酸，具有酯鍵或甙鍵，易被酸、堿、酶催化水解。水解后的產(chǎn)物又分為沒食子酸和鞣花酸。余甘子富含鞣質(zhì)，且主要為可水解鞣質(zhì)，并具有多種藥理活性。在傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論中余甘子均為口服給藥，胃腸道吸收是研究藥物代謝的第一個(gè)環(huán)節(jié)，其在胃腸道中存在形式研究將為體內(nèi)ADME奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)余甘子鞣質(zhì)部位在人工胃液中比較穩(wěn)定，由于鞣質(zhì)部位中各成分均為酸性成分，故其在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定，存在可逆的酸水解，故各成分的含量在100%左右波動(dòng)。余甘子鞣質(zhì)部位在人工腸液中不太穩(wěn)定，大分子的可水解鞣質(zhì)可以水解產(chǎn)生沒食子酸、鞣花酸以及柯里拉京，故三者含量均呈現(xiàn)先增加的趨勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，所有成分在堿性環(huán)境中均會(huì)逐漸減少，故呈現(xiàn)后減少的趨勢(shì)。于是我們推測(cè)，在人工胃液中，余甘子鞣質(zhì)部位并未發(fā)生顯著地酸水解，各成分幾乎處于動(dòng)態(tài)平衡中；而在人工腸液中，余甘子鞣質(zhì)部位在人工腸液里面不穩(wěn)定。

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Research on Stability of Tannin Part in Phyllanthus Emblica L.inArtificial GastricAnd Intestinal Juice

Wu Lingfang,Ye Ting,Liang Linjin,Liang Wenyi,Chen Wenjing,Li Shi,Cui Yaping,Qi Qi,Zhang Lanzhen
(School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

This article was aimed to study the stability of tannin parts inPhyllanthus emblicaL.in artificial gastric and intestinal juice,in order to provide a foundation for in vivo studies ofPhyllanthus emblicaL.HPLC-UV was used to determine the contents of main ingredients.The results showed that stability of main ingredients of tannin parts inPhyllanthus emblicaL.,including gallic acid(GA),corilagin and ellagic acid(EA),in the artificial gastric juice.The content change was not obvious.The residual content was within 100%.The half-life was above 90 h.They were unstable in the artificial intestinal juice.The content was first increased and then decreased.The residual content was 100-300%.The half-life was above 10 h.It was concluded that the tannin parts inPhyllanthus emblicaL.was stable in artificial gastric juice.And content changes of main components were not obvious.The tannin parts inPhyllanthus emblicaL.were unstable in artificial intestinal juice.The main ingredients were first increased and then decreased.It was speculated that macromolecule can hydrolyze tannin part into small molecules.However,as time increases,all components may be decomposed.

Phyllanthus emblica L.,tannin part,artificial gastric and intestinal juice,stability

10.11842/wst.2017.08.023

R33

A

2017-03-21

修回日期：2017-07-11

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274187）：基于藏藥余甘子酚酸類成分體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的的抗癌藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制，負(fù)責(zé)人：張?zhí)m珍。

＊＊ 通訊作者：張?zhí)m珍，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)和質(zhì)量控制研究。

（責(zé)任編輯：張娜娜，責(zé)任譯審：王 晶）