高效液相色譜法同時測定白虎加桂枝湯中5個有效指標(biāo)性成分的含量

彭 平，王夢婕，李曉盈，段湘寧，李毅騰，杜 菁

（北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司 北京 100079）

高效液相色譜法同時測定白虎加桂枝湯中5個有效指標(biāo)性成分的含量

彭 平，王夢婕，李曉盈，段湘寧，李毅騰，杜 菁＊

（北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司 北京 100079）

目的：建立白虎加桂枝湯中芒果苷、新芒果苷、甘草酸、甘草苷、肉桂酸5個有效指標(biāo)性成分的含量測定方法，為白虎加桂枝湯的顆粒研發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：采用HPLC-PDA雙波長同時測定，Waters xBridge BEH C18（4.6 mm×250 μm，5 μm）色譜柱，流動相乙腈-0.01%甲酸水，梯度洗脫，流速1 mL·min-1，柱溫24℃，檢測波長255 nm、280 nm。結(jié)果：內(nèi)芒果苷、新芒果苷、甘草酸、甘草苷、肉桂酸線性范圍分別為66-1 976 μg（r=0.999 3），70-3 487 μg（r=0.999 7），30-913 μg（r=0.999 5），35-1 734 μg（r=0.999 5），0.6-187 μg（r=0.999 8），加樣回收率平均范圍95.29%-100.17%。結(jié)論：建立了白虎加桂枝湯中5個有效指標(biāo)性成分的含量測定方法，該方法簡捷、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可為白虎加桂枝湯及其復(fù)方顆粒研制的質(zhì)量控制提供評價方法。

白虎湯 芒果苷 甘草苷 肉桂酸

白虎加桂枝湯，方出《金匱要略·瘧病脈證治》篇[1]。該方為白虎湯加桂枝組成，方藥由知母、炙甘草、石膏、粳米、桂枝五味組成，主治“溫瘧”之癥，具有清熱生津，兼解表邪的功效[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，白虎湯中石膏與其他藥味的協(xié)同作用是白虎湯具有顯著退熱作用的關(guān)鍵[4-6]。知母中的芒果苷、新芒果苷，炙甘草中的甘草苷、甘草酸，以及桂枝中的肉桂酸，是白虎加桂枝湯發(fā)揮藥效作用的主要活性成分[7-11]。因此，測定這5個有效指標(biāo)性成分的含量對于白虎加桂枝湯的質(zhì)量控制具有重要的意義。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報道使用乙腈-磷酸二氫鉀鹽溶液為流動相，同時測定白虎湯中4個指標(biāo)成分的方法[12]，尚未見白虎加桂枝湯的分析方法報道。

近年來，隨著中藥研究的不斷發(fā)展，對中藥經(jīng)典配方顆粒的研制及其如何進(jìn)行有效質(zhì)量控制成為中藥配方顆粒研制的核心問題[13-15]。為了探究白虎加桂枝湯復(fù)方顆粒的研制及其有效質(zhì)量控制相關(guān)問題，為中藥經(jīng)方顆粒的研制提供科學(xué)依據(jù)，筆者進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。本研究建立了HPLC-PDA測定白虎加桂枝湯復(fù)方中5個有效指標(biāo)性成分（新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸、肉桂酸）的含量測定方法，為白虎加桂枝湯復(fù)方顆粒的研制及其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 飲片

生石膏（批號：160968）、知母（批號：161038）、炙甘草（批號：1609120）、桂枝（批號：160944）均購自河北博圣藥業(yè)有限公司，經(jīng)復(fù)檢，符合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定。粳米使用普通食用大米。

1.2 樣品制備

根據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)院臨床湯劑的煎煮方法，以處方量，稱取石膏50 g，知母18 g，甘草6 g，粳米6 g，桂枝9 g，使用廣興電砂鍋（型號03B/4L），加入600 mL水，設(shè)定煎煮45 min，采用紗布過濾，濾液60℃減壓回收溶劑，60℃真空干燥，即得白虎加桂枝湯提取物。

1.3 儀器

2695高效液相色譜儀包括四元泵，2996 DAD檢測器，柱溫箱，自動進(jìn)樣器，Empower工作站（美國Waters公司）；純水儀（型號：Milli-Q Academic A10廠家：美國MILLIPORE）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波器（昆山超聲儀器有限公司）；MettlerML204型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利集團）；XP205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利集團）；0.45 μm微孔濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

圖1 255 nm波長下對照品混合溶液色譜圖

圖2 280 nm波長下對照品混合溶液色譜圖

圖3 255 nm波長下白虎加桂枝湯提取物樣品溶液色譜圖

圖4 280 nm波長下白虎加桂枝湯提取物樣品溶液色譜圖

1.4 對照品

新芒果苷對照品（含量98%，上海源葉生物有限公司，批號：B21397）。肉桂酸（含量100%，批號110786-200503）；芒果苷（含量98.4%，批號111607-201503）；甘草苷（含量93.7%，批號111610-201106）；甘草酸銨（含量93.1%，中國食品藥品檢定研究院批號110731-201418）。

1.5 對照品溶液的制備

分別用50%甲醇配制供定量使用的對照品溶液，新芒果苷348.7 μg·mL-1，芒果苷329.4 μg·mL-1，甘草酸152.1μg·mL-1，甘草苷173.4μg·mL-1，肉桂酸31.2μg·mL-1。

1.6 供試品溶液的制備

精密稱取白虎桂枝湯提取物干膏細(xì)粉0.35 g，置于具塞三角瓶中，精密加入25 mL50%甲醇，稱定重量，超聲（功率250 W，50 kHz）使溶解，放冷，用提取溶劑補重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱采用沃特世xBridgeBEHC18Column（4.6mm×250 μm，5 μm），柱溫24℃。流動相為A乙腈-B0.01%甲酸水，梯度洗脫（0-15 min，5%A；15-17 min，5-10%A；17-22 min，10-17%A；22-24 min，17-19%A；24-33 min，19-20%A；33-45 min，20%-35%A；45-55 min，35%-42%A；55-58 min，42%-42%A；55-58 min，42%-42%A；58-65 min，42%-5%A），流速1 mL·min-1。新芒果苷、芒果苷、甘草酸在255 nm波長下進(jìn)行檢測，甘草苷、肉桂酸在280 nm波長下進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量10 μL，采集時間70 min，理論塔板數(shù)按芒果苷計算不低于5 000。色譜圖見圖1-4。

2.2 線性關(guān)系考察

將5個對照品母液分別用50%甲醇稀釋為7個梯度，其中肉桂酸質(zhì)量濃度依次為18.7、9.4、6.2、3.1、0.12、0.06 μg·mL-1，甘草苷質(zhì)量濃度依次為173.4、52.0、34.7、17.3、6.9、3.5 μg·mL-1，甘草酸質(zhì)量濃度為91.3、45.7、30.4、15.2、6.1、3.0 μg·mL-1，芒果苷質(zhì)量濃度為197.6、98.8、65.9、32.9、13.2、6.6 μg·mL-1，新芒果苷質(zhì)量濃度為348.7、104.6、69.7、34.9、13.9、7.0 μg·mL-1。每個梯度質(zhì)量濃度進(jìn)樣10 μL，平行進(jìn)樣兩針，計算平均峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，對照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立色譜峰面積對進(jìn)樣量的回歸方程（表1），結(jié)果表明，各成分在檢測的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度考察

取同一樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量均為10 μL，記錄峰面積值，計算RSD值，結(jié)果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷峰面積的RSD分別為0.73、2.46、0.49、1.50、0.36%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

取樣品6份，分別按樣品處理方法制備樣品溶液，并進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算各指標(biāo)性成分含量。結(jié)果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷平均含量分別為0.81、1.07、6.39、0.13、9.38 mg·g-1；RSD分別為1.33、1.65、0.53、0.86、0.57%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察

取同一樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量均為10 μL。結(jié)果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷峰面積的RSD分別為0.86、2.26、0.58、1.63、0.45%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率考察

取已知指標(biāo)性成分含量的本復(fù)方提取物干膏粉末6份，每份175 mg，每份分別加入濃度為348.7 μg·mL-1的新芒果苷溶液2 mL，濃度為329.4 μg·mL-1的芒果苷3 mL，濃度為0.152 1 μg·mL-1的甘草酸1.2 mL，濃度為173.4 μg·mL-1的甘草苷0.9 mL，濃度為31.2 μg·mL-1的肉桂酸0.9 mL，再加入50%甲醇20 mL，共計28 mL溶劑，稱定重量，超聲(250 w，50 kHz)使溶解，放冷，用50%甲醇溶液補足重量，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣10 μL測定。根據(jù)測得的各成分的量，計算各成分的加樣回收率和RSD，結(jié)果見表2～6。

2.7 樣品測定

分別取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸銨、肉桂酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含芒果苷90 μg·mL-1、新芒果苷100 μg·mL-1、甘草苷35 μg·mL-1、甘草酸30 μg·mL-1、肉桂酸6 μg·mL-1的混合溶液。

取對照品混合溶液和樣品溶液，按照已建立的分析方法測定，采用外標(biāo)一點法測定樣品中甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷的含量，結(jié)果見表7。

表1 5種有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

表2 甘草苷的加樣回收率實驗（n=6）

表3 甘草酸的加樣回收率實驗（n=6）

表4 芒果苷的加樣回收率實驗（n=6）

表5 肉桂酸的加樣回收率實驗（n=6）

表6 新芒果苷的加樣回收率實驗（n=6）

表7 三批白虎加桂枝湯提取物測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 樣品處理方法的建立

樣品處理方法對比了回流和超聲兩種處理方法，得出兩種處理方式無明顯差異，優(yōu)選超聲處理；考察了甲醇、50%甲醇、水三個不同溶劑對樣品中5個指標(biāo)性成分的溶解度，以相同樣品濃度下5個指標(biāo)性成分峰面積最大為依據(jù)，選擇溶劑為50%甲醇溶劑；考察50%甲醇溶劑倍量25、50、100倍對樣品的溶解度，以指標(biāo)性成分測定含量值最大為依據(jù)，選擇100倍的溶劑倍量。

3.2 色譜條件選擇

已有文獻(xiàn)報道使用乙腈-磷酸二氫鉀鹽溶液梯度洗脫，在256 nm波長下測定白虎湯中4個指標(biāo)性成分[6]。本實驗考察使用了較為方便的乙腈-甲酸-水為流動相，通過優(yōu)化洗脫梯度，使得測定的5個指標(biāo)性成分色譜峰均達(dá)到較好的分離度。

3.3 檢測波長選擇

根據(jù)5個指標(biāo)性成分的最大吸收波長（芒果苷255 nm、新芒果苷255 nm、甘草酸255 nm、肉桂酸280 nm、甘草苷280 nm），選用雙波長同時測定，選定255 nm、280 nm為檢測波長，提高了分析方法的靈敏性和準(zhǔn)確性。

本文建立了HPLC同時測定白虎加桂枝湯中5個有效指標(biāo)性成分芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸、肉桂酸的含量測定方法，已成功用于白虎加桂枝湯復(fù)方顆粒的研制，該方法簡捷、穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

1 胡爽楊.《金匱要略》白虎加桂枝湯治療小兒咳嗽的臨床應(yīng)用心得.環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(S1)：58-58.

2 范衡.白虎加桂枝湯臨床新用體會.實用中醫(yī)藥雜志,2013,29(11)：948-949.

3 丁仲華.白虎加桂枝湯加減治療熱痹的體會.中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(8)：1489-1490.

4 趙嬌.白虎湯中石膏清熱作用的成分研究.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012.

4 夏怡,李祥,陳建偉,等.石膏及白虎湯清熱瀉火功效的實驗研究.現(xiàn)代中藥研究與實踐,2009,23(2)：48-51.

5 王婭,馮芳,孫麗麗.白虎湯配伍譜效關(guān)系研究.藥學(xué)與臨床研究,2010,18(3)：226-230.

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11 李春來,李偉東,吳育,等.HPLC同時測定白虎湯中4種有效成分的含量.中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(12)：78-80.

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13 崔景朝,趙自明.中藥配方顆粒研究進(jìn)展(Ⅱ)——中藥單煎與合煎對比研究概況.中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(4)：240-245.

14 李松林,宋景政,徐宏喜.中藥配方顆粒研究淺析.中草藥,2009,40(S1)：1-7.

Simultaneous Determination of Five Components in Baihu and Guizhi Decoction by HPLC

Peng Ping,Wang Mengjie,Li Xiaoying,Duan Xiangning,Li Yiteng,Du Jing
(Beijing Zhongyan Tongrentang Medicine Research Company,Beijing 100079,China)

This study was aimed to develop an HPLC method for simultaneous determination of five active components inBaihuandGuizhidecoction.Simultaneous determination of mangiferin,neomangiferin,glycyrrhizic acid,liquiritin,and cinnamic acid in Baihu and Guizhi decoction were conducted by HPLC-PDA under multiple UV wavelengths.An Waters xBridge BEH C18Column(4.6 mm × 250 μm,5 μm)was used.The mobile phase was acetonitrile-0.01%formic acid solution.The flow rate was 1 mL·min-1.The column temperature was kept at 24°C.The detection wavelength was set at 255 nm and 280 nm.The results showed that the linear range of mangiferin,neomangiferin,glycyrrhizic acid,liquiritin,and cinnamic acid was 66-1 976 μg(r=0.999 3),70-3487 μg(r=0.999 7),30-913 μg(r=0.999 5),35-1 734 μg(r=0.999 5),0.6-187 μg(r=0.999 8)in 70 min,respectively.The average recovery was between 95.29%and 100.17%.It was concluded that the method was convenient,stable,reliable and accurate for simultaneous determination of the five components inBaihuandGuizhidecoction.It provided an evaluation method for the quality control ofBaihuandGuizhidecoction and the research o its granules.

Baihudecoction,mangiferin,liquiritin,cinnamic acid

10.11842/wst.2017.08.024

R284.1

A

2017-05-31

修回日期：2017-06-06

＊ 通訊作者：杜菁，工程師，主要研究方向：中藥新藥工藝及質(zhì)量控制。

（責(zé)任編輯：張娜娜，責(zé)任譯審：王 晶）