靶向趨化因子受體4（CXCR4）分子成像研究

曹學良 ，付 鵬 ，姜廷軍 ，欒 廈 ，趙長久

（1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

?影像技術學?

靶向趨化因子受體4（CXCR4）分子成像研究

曹學良1，付 鵬2，姜廷軍1，欒 廈1，趙長久1

（1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的：探討99mTc標記針對靶向趨化因子受體4（CXCR4）mRNA的小干擾RNA（Small interference RNA，siRNA）分子探針用于乳腺癌荷瘤裸鼠基因顯像的價值。方法：以雙功能螯合劑HYNIC為螯合物對以CXCR4 mRNA某段序列為靶點的siRNA及人無關基因序列為靶點的對照siRNA進行99mTc標記，對其標記率、放化純及穩(wěn)定性進行分析。30只乳腺癌荷瘤裸鼠，建立的人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠腫瘤模型，隨機分成3組（每組10只），分別進行99mTcO4-、99mTc-HYNIC-siRNA（干擾組）和99mTc-HYNIC-siRNA（對照組）腫瘤顯像。測量并計算每個時間點的（T/M）的比值。所得測量數(shù)據(jù)使用方差分析和兩樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。結果：干擾組的99mTc標記率為（61.26±2.47）%，對照組的99mTc標記率為（60.85±2.76）%。干擾組和對照組經純化后，放化純均達90%以上。干擾組和對照組分別溶于37℃的PBS和正常人新鮮血清中30 min和120 min后，性質保持穩(wěn)定。注射不同探針后 1 h，4 h及 10 h時， 干擾組 T/M 比值分別為 3.486±0.145、4.574±0.222和 6.608±0.366； 對照組分別為 1.286±0.189、1.348±0.204 和 1.354±0.238；游離99mTcO4-組分別為 1.317±0.164、1.322±0.159 和 1.401±0.145，在每個成像時間點，3 組之間出現(xiàn)的T/M比值差異有統(tǒng)計學意義。干擾組在1 h、4 h、10 h各時間點的T/M比值與對照組及游離99mTcO4-組之間相比有差異，并且差異均有統(tǒng)計學意義 （t對照=29.20、33.84、38.07， t游離=31.29、37.61、41.86，P 均＜0.01）， 而對照組各時間點的 T/M 比值與游離99mTcO4-組差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.392、0.318、0.533，P均＞0.05）。結論：以99mTc標記的siRNA探針可特異性聚集于乳腺癌荷裸鼠腫瘤模型的腫瘤組織，為特異性診斷乳腺癌提供了一種新的方法。

乳腺腫瘤；放射性核素顯像

Fire等[1]于1998年首次證實了mRNA可被同源靶雙鏈小RNA分子誘導降解，使其表達基因沉默，這種現(xiàn)象稱 RNA干擾 （RNA interference，RNAi）?，F(xiàn)在RNAi技術已成為基因水平科研和治療中重要技術之一。小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）具有強大的基因靶向能力和沉默作用,是RNAi中的關鍵因素[2-3]。但是將siRNA直接應用于體內研究時，siRNA往往會因脫靶效應或者轉運不良不能發(fā)揮基因沉默效應。放射性示蹤技術安全可靠、探測靈敏高、分辨率好,可以用于大型動物。因此構建一種基于siRNA的放射性標記方法就變得十分有意義，放射性顯像及治療結合siRNA的基因沉默效應可達到顯像、放射治療及基因干擾的三重效果。

靶向趨化因子受體4（Chemokine receptor 4，CXCR4）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，在多種腫瘤組織和正常組織中均有表達，且其在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織[4]。CXCR4與其配體CXCL12相結合后，可以激活相關下游信號通路并產生某些化學因子對腫瘤細胞的增殖、侵襲和遠處轉移等生物過程產生重要影響[5-6]。在多種人乳腺癌細胞系中CXCR4均有不同程度的表達，因此它是乳腺癌分子顯像的新靶點。本研究選取人CXCR4 mRNA的siRNA序列，探討CXCR4 siRNA分子探針用于乳腺癌荷瘤裸鼠基因顯像的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

CXCR4小干擾RNA：CXCR4小干擾RNA的正義鏈及反義鏈均為含有21個堿基的序列，干擾組CXCR4 正義鏈序列：5’-GGGACUAUGACUCCAUGAATT-3’， 反 義 鏈 序 列 ：5’ -UUCAUGGAGUCAUAGUCCCTT-3’，對照組 CXCR4正義鏈序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’， 在反義鏈的5’端連接一個6碳己基和氨基伯胺結構，作為與HYNIC耦聯(lián)的基團，其3’端連接2個用于提高反義結合活性的脫氧胸腺核苷酸d（TT）結構。siRNA鏈購自上海吉瑪公司，全程2’-甲氧基修飾；HYNIC購于上海吉爾生化有限公司；99mTcO4-來自于中國原子能科學研究院同位素所提供的99Mo-99mTc發(fā)生器；L15細胞培養(yǎng)基、脂質體2000、瓊脂糖購自美國Invitrogen 公司；二甲基甲酰胺（DMF）、TRICINE、氯化亞錫購自美國Sigma公司；γ放射免疫計數(shù)器，購于中國科技大學創(chuàng)新股份有限公司。

1.1.2 主要材料

乳腺癌MDA-MB-231細胞，由哈爾濱醫(yī)科大學附屬四院中心實驗室提供；SephadexTMG25凝膠層析柱及Sep-Pak C18反相層析柱購自美國Waters公司；SPECT：NM signature E.CAM Duet Camera，B，自于 Siemens公司；NU/NU 品系裸鼠（SPF 級別，雌性，6～8 周齡，體質量 18～22 g）購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司 （許可證編號：SCXK（京）2012-0001）。

1.1.3 主要儀器

MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司；半干式蛋白質電轉膜儀、水平電泳儀購自北京六一儀器廠；γ放射免疫計數(shù)器購于中國科技大學創(chuàng)新股份有限公司；紫外分光光度計購自北京鑫科奧商貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 siRNA的設計與合成

本研究中siRNA靶點設計針對CXCR4 mRNA的核苷酸。其反義鏈的5’端連接一個6碳己基和氨基伯胺結構，作為與HYNIC耦聯(lián)的基團，其3’端連接2個用于提高反義結合活性的脫氧胸腺核苷酸d（TT）結構。干擾組CXCR4反義鏈序列：5'-UUCAUGGAGUCAUAGUCCCTT-3’， 正義鏈序列：5’-GGGACUAUGACUCCAUGAATT-3’，siRNA 鏈購自上海吉瑪公司，全程2’-甲氧基修飾。合成后使用HPLC進行純化減壓離心干燥。-20℃可保存6月。

1.2.2 siRNA與HYNIC的耦聯(lián)及99mTc標記

先用乙腈10 mL及三蒸水20 mL預處理Sep-Pak C18反相層析柱。然后將HYNIC溶于純的DMF 中，濃度為 10 mg/mL，取 siRNA 5 OD（165 μg），以25 mmol/L碳酸氫鹽緩沖液（pH 8.5）溶解，終濃度為 5 μg/μL。 按照 siRNA：HYNIC=1∶20 的摩爾比例，振蕩條件下，將HYNIC溶液逐滴加入siRNA中，室溫條件60 min，用蒸餾水稀釋至1 mL，經Sep-Pak C18反相柱純化。99mTc標記用10mL 25mM碳酸氫銨溶液、10 mL含5%乙腈的25 mM碳酸氫銨溶液、10 mL 5%乙腈水溶液洗及1 mL 30%乙腈水溶液進行洗脫。收集流出液，8滴每管，80管，紫外分光光度計測定每管在260 nm處的吸光度，合并峰管，按每管10μg分裝（1OD=33μg），-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

將10μg siRNA-HYNIC溶于50μL濃度25mmol/L的碳酸氫鹽緩沖液，加入 100 μL Tricine（7 mg/mL）、10 μL SnCl2（1 mg/mL）和99mTcO4-（185 MBq）混勻。室溫條件60 min。以生理鹽水作為洗脫液，用Sephadex G25凝膠層析柱純化，收集滴出液，每管6滴，共80管，測量各管的放射性計數(shù)及各管在260nm處吸光度。干擾組CXCR4 siRNA與對照組siRNA均按照上述方法進行HYNIC耦聯(lián)和99mTc標記。各取5 OD （165 μg）未耦聯(lián)HYNIC的干擾組CXCR4 siRNA與對照組siRNA，與上述步驟相同，分別進行99mTc標記，使用Sephadex G25層析柱純化分析。

1.2.3 標記物特性分析

放射性化合物的標記率：干擾組CXCR4 siRNA和對照組CXCR4 siRNA標記后，生理鹽水洗脫，G25凝膠層析柱純化，收集液體約60管，計算兩種化合物的標記率。標記率=第一個峰的放射性計數(shù)/（60管的總放射性計數(shù)+凝膠層析柱的放射性計數(shù)）。

標記后化合物的穩(wěn)定性：1.0 μg/mL99mTc標記的CXCR4 siRNA分別溶解于正常人血清和PBS中，經過30 min、120 min后Sep-Pak C18小柱純化，收集流出管，γ計數(shù)儀檢測放射性計數(shù)，描繪相應曲線圖，觀察放射峰出現(xiàn)的位置有無改變。

放射性化學純度分析：分別標記10 μg干擾CXCR4 siRNA與對照CXCR4 siRNA，應用紙層析的方法進行放射性化學純度分析。固定相為新華一號試紙，雙擴展劑則選擇丙酮和生理鹽水，測定方法采用分段測量法。

1.2.4 脂質體包裹99mTc標記的CXCR4 siRNA

取99mTc-HYNIC-siRNA 10 μg 溶于 250 μL 無血清的L15培養(yǎng)基，室內常溫靜置5 min。5 μL lipofectamin 2000加入無血清 L15培養(yǎng)液250 μL。將兩部分液體混合并輕輕混勻，室內常溫靜置20min。對照組按上述同樣方法進行脂質體包裹。

1.2.5 乳腺癌裸鼠模型的建立

處于對數(shù)生長期的人乳腺癌MDA-MB-231細胞按細胞傳代的方法制成單細胞懸液，應用細胞計數(shù)板計數(shù)，計算四角大方格內總細胞數(shù)。細胞/mL=（4大格細胞總數(shù)/4）×104。以無血清L15培養(yǎng)液將細胞濃度調節(jié)為106～107/mL用于實驗。于裸鼠右下肢外側皮下接種腫瘤細胞懸液0.2 mL，接種后小鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境，觀察腫瘤的生長情況，待瘤體直徑長至約1～2 cm時，用于實驗。

1.2.6 顯像研究

將30只成瘤乳腺癌裸鼠隨機 （簡單隨機抽樣）分成3組，每組10只裸鼠，分別經尾靜脈注射脂質體包裹的游離99mTcO4-、干擾組99mTc-HYNIC-siRNA和對照組99mTc-HYNIC-siRNA（劑量均為7.4 MBq）。小鼠以質量分數(shù)5%的水合氯醛麻醉后固定，采用低能準直器，能峰值140 keV，256×256矩陣，20%窗寬，于注射不同顯像劑1 h、4 h及10 h分別采集裸鼠靜態(tài)顯像圖像。以ROI技術測量各時間點的腫瘤及對側肌肉放射性計數(shù)，并計算其比值（T/M）。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)以經±s表示，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 99mTc標記產物的標記率及其特性

產物的標記率：標記率=第一個峰的放射性計數(shù)/（60管的總放射性計數(shù)+凝膠層析柱的放射性計數(shù)）。未耦聯(lián)HYNIC的干擾組siRNA和對照組siRNA 的99mTc標記率分別為（4.91±2.58）%和（4.82±3.09）%，耦聯(lián)HYNIC后干擾組99mTc-HYNIC-CXCR4 siRNA 的標記率為（61.26±2.47）%（n=5），對照組99mTc-HYNIC-CXCR4 siRNA的標記率為（60.85±2.76）%（n=5）。結果表明 HYNIC能夠顯著提高siRNA的放射性標記率。干擾組99mTc-HYNIC-siRNA和對照組99mTc-HYNIC-siRNA放化純皆達90%以上。

標記后化合物的穩(wěn)定性：標記的CXCR4 siRNA在正常人血清和PBS中經過30 min、120 min后，通過C18小柱進行純化，據(jù)觀察放射性曲線圖，并未見放射峰位置的變化（圖1）。這一結果證實，標記產物穩(wěn)定性好。

2.2 乳腺癌裸鼠模型的建立

接種乳腺癌細胞的裸鼠在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)3～4周，待瘤體增大直徑達1～2 cm時，處死取腫瘤組織行HE染色。光學顯微鏡下可見大小不一、異型性明顯的腫瘤細胞，病理性核分裂象明顯。

2.3 荷瘤裸鼠模型的顯像結果

經尾靜脈注射脂質體包裹的游離99mTcO4-、干擾組99mTc-HYNIC-siRNA和對照組99mTc-HYNIC-siRNA（劑量均為7.4 MBq）的荷乳腺癌裸鼠，以質量分數(shù)5%水合氯醛麻醉，于注射顯像劑后1 h、4 h及10 h分別采集背側靜態(tài)圖像。以ROI技術測量各時間點的腫瘤與對側肌肉放射性計數(shù)并計算其比值。注射干擾組99mTc-HYNIC-siRNA的裸鼠，1 h后，可見腫瘤部位有放射性聚集，4 h及10 h腫瘤顯像更清晰，T/M比值逐漸增加，分別為 3.486±0.145、4.574±0.222 和 6.608±0.366； 而對照組99mTc-HYNIC-siRNA及99mTcO4-組在注射后1 h、4 h及10 h時腫瘤部位皆顯像不清；對照組99mTc-HYNIC-siRNA，1 h、4 h、10 h T/M 比值分別為 1.286±0.189、1.348±0.204 和 1.354±0.238；99mTcO4-組 1 h、4 h、10 h T/M比值分別為 1.317±0.164、1.322±0.159 和 1.401±0.145，在每個成像時間點，3組T/M比值差異有統(tǒng)計學意義 （F1=570.2，F(xiàn)4=903.1，F(xiàn)10=1294，P 均＜0.01）。在各顯像時間點干擾組的T/M比值均明顯高于游離99mTcO4-和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t對照=29.20、33.84、38.07，t游離=31.29、37.61、41.86，P 均 ＜0.01）；而對照組99mTc-HYNIC-siRNA的T/M比值與游離99mTcO4-組間的差異無統(tǒng)計學意義 （t=0.392、0.318、0.533，均 P＞0.05）。荷瘤鼠顯像圖見圖 2。3 組數(shù)據(jù)間對比顯像折線圖見圖3。

圖1 99mTc-CXCR4-siRNA分別在血清和PBS中孵育前后經C18反相層析柱分析的放射性分布曲線圖。圖1a為孵育前，圖1b為在血清中孵育120 min，圖1c為在PBS中孵育120 min。Figure 1.Radioactivity distribution curve of99mTc-CXCR4-siRNA analyzed by C18 reverse-phase column before and after incubation in serum and PBS,respectively.Figure 1a:before incubation,Figure 1b:120 min in serum,Figure 1c:120 min in PBS.

3 討論

趨化因子受體4（Chemokine receptor 4，CXCR4）起初因其在胚胎器官的發(fā)生、免疫功能和T淋巴細胞遷移等方面的重要作用而為人所熟知[7]。CXCR4是一種細胞膜受體，可結合G蛋白并具有趨化性[8]，它在白細胞和某些上皮細胞表面正常表達，而在多種腫瘤細胞表面則過度表達，如神經母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤、腎癌等[9]，且其表達水平的高低與腫瘤細胞的增殖、血管生成和遠處轉移密切相關。許多研究表明，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤等進展到遠處轉移的過程里CXCR4有著至關重要的影響[10]。

圖2 荷乳腺癌裸鼠經尾靜脈注射游離99mTcO4-及脂質體包裹的99mTc-HYNIC-siRNA顯像圖。尾靜脈注射后1 h，4 h及10 h，A，B，C分別為游離99mTcO4-組，對照組99mTc-HYNIC-siRNA及干擾組99mTc-HYNIC-siRNA，箭頭示腫瘤部位Figure 2. Imaging of99mTcO4-and liposomally encapsulated 99mTc-HYNIC-siRNA in nude mice bearing breast cancer via the tail vein.99mTcO4-,99mTc-HYNIC-siRNA and99mTc-HYNIC-siRNA(control group),respectively,at 1 h,4 h and 10 h after tail vein injection.Arrows show tumor location.

圖3 荷乳腺癌裸鼠經尾靜脈注射游離99mTcO4-及脂質體包裹的99mTc-HYNIC-siRNA顯像，3組數(shù)據(jù)間對比顯像折線圖。干擾組（紅色）、對照組（紫色）、游離 99mTcO4-組（藍色）。Figure 3. Imaging of99mTcO4-and liposomally encapsulated 99mTc-HYNIC-siRNA in nude mice bearing breast cancer via the tail vein.line chart of three groups of data.Interference group(red),control group(purple),free99mTcO4-group(blue).

腫瘤的基因表達成像是使用放射性核素標記分子探針，在mRNA或蛋白質的水平上，在活體內無創(chuàng)性地探測特定腫瘤基因產物表達情況的一種顯像方法。siRNA顯像就是以放射性核素標記的siRNA作為示蹤劑進行核素顯像，以堿基互補配對原則為基礎，使siRNA與目的基因特異性地結合，在整體水平上實現(xiàn)針對病變組織特定基因表達的動態(tài)監(jiān)測，從而達到在基因水平早期、定性診斷疾病的目的[11-12]。因此本實驗選取CXCR4作為靶基因來研究人乳腺癌基因顯像。本實驗選取與其相一致的針對CXCR4 CXCR4-370的siRNA，正義鏈序列為5’GGGACUAUGACUCCAUGAATT3’，反義鏈序列為5’UUCAUGGAGUCAUAGUCCCTT3’。本實驗中在反義鏈的5’端連接一個6碳己基和氨基伯胺結構，作為與HYNIC耦聯(lián)的基團，其3’端連接2個用于提高反義結合活性的脫氧胸腺核苷酸d（TT）結構。全程 2’-甲氧基修飾[13-14]。

在活體組織復雜的生理環(huán)境下，合成的siRNA探針是否能夠在腫瘤組織中特異性聚集關系到顯像的成敗[15]。本實驗結果顯示，標記的CXCR4 siRNA在正常人血清和PBS中經過120 min后，經過純化后未見放射峰位置的變化，說明標記產物穩(wěn)定性好，未降解分離。

荷乳腺癌裸鼠SPECT顯像結果顯示：脂質體包裹的干擾組探針在腫瘤病灶內能夠特異聚集并且隨時間的延長逐漸清晰，T/M比值隨之增加，而對照探針組在腫瘤病灶內放射性分布稀疏，游離99mTcO4-組，從圖像中可見核素在裸鼠甲狀腺組織中大量濃聚，而腫瘤部位放射性分布稀疏，與干擾探針組相對比，進一步說明腫瘤部位的核素聚集為干擾探針的特異性引起，而非核素的非特異性聚集所致。實驗結果,脂質體包裹的干擾組探針裸鼠顯像無甲狀腺顯影，更說明合成的分子探針純度高，特異性好。

綜上所述，使用HYNIC作為螯合劑標記后的探針不僅在體外能保持穩(wěn)定，而且脂質體包裹的分子探針能夠在荷乳腺癌裸鼠的腫瘤區(qū)特異性濃聚，該探針有望成為一種乳腺癌診斷敏感的示蹤劑用于乳腺癌患者的無創(chuàng)性早期診斷。

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The molecular imaging research of chemokine receptor 4(CXCR4)

CAO Xue-liang1,FU Peng2,JIANG Ting-jun1,LUAN Sha1,ZHAO Chang-jiu1
(1.The Fourth Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China;2.The First Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

Objective:To investigate the possibility of using small interference RNA(siRNA)targeting human chemokine receptor 4(CXCR4)radiolabeled with99mTc for diagnosing human breast cancer.Methods:Small interference RNA targeted to CXCR4 mRNA and negative control siRNA were synthesized and radiolabeled by99mTc with the bifunctional chelator HYNIC.The labeling efficiency,radiochemical purity and stability were investigated.Animal models of nude mice bearing human breast cancer MDA-MB-231 were established,divided them into three groups,10 mice in each group.99mTcO4-,99mTc-HYNIC-siRNA(interference group),99mTc-HYNIC-siRNA(negative control group)were separately injected through tail vein to the three groups.After99mTcO4-,99mTc-HYNIC-siRNA(interference group),99mTc-HYNIC-siRNA(negative control group)were introduced into these animal models,tumor images were acquired with SPECT,the ratio of T/M was calculated.The data were analyzed by two-sample t test and analysis of variance.Results:The labeling efficiency of siRNA(interference group)and siRNA(negative control group)were(61.26±2.47)%and(60.85±2.76)%respectively.The radiochemical purities were both above 90%.Incubated in fresh human serum and PBS for 30 min and 120 min at 37℃,respectively,probes’ properties remained stable in 2 hours.At 1,4 and 10 h after injection of different probes,the T/M ratios of99mTc-HYNIC-siRNA(interference group)were 3.486±0.145,4.574±0.222 and 6.608±0.366,and that of99mTc-HYNIC-siRNA(negative control group)were 1.286±0.189,1.348±0.204 and 1.354±0.238,with99mTcO4-group 1.317±0.164,1.322±0.159 and 1.401±0.145 respectively,and there were statistically significant differences in different groups at every time spots.The ratios of T/M in99mTcO4-group and99mTc-HYNIC-siRNA(negative control group)were significantly lower than those in99mTc-HYNIC-siRNA(interference group)at 1,4,10 h respec-tively(tcontrol=29.20,33.84 and 38.07,99mTcO4-=31.29,37.61 and 41.86,all P＜0.01),and the T/M ratios at 1 h,4 h,10 h of99mTc-HYNIC-siRNA(negative control group)and99mTcO4-groups were not significantly different(t=0.392,0.318 and 0.533,all P＞0.05).Conclusions:The99mTc-HYNIC-siRNA(interference group)could specificity accumulated in breast cancer tissue.The imaging with99mTc-HYNIC-siRNA may be a promising method for diagnosis of breast cancer.

Breast neoplasms;Radionuclide imaging

R737.9；R817.4

A

1008－1062（2017）05－0363－05

2016-07-28；

2016-08-24

曹學良（1988-），男，河北唐山人，醫(yī)師。 E-mail：caoxueliang0451@163.com

趙長久，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院核醫(yī)學科，150001。E-mail：13904606820@163.com

黑龍江省自然科學基金（面上項目）（H2015066）。