β—淀粉樣蛋白增加Wistar大鼠癲癇發(fā)作易感性的行為學(xué)研究

趙娟　張彥妹　鄭乃智

[摘要] 目的 研究β-淀粉樣蛋白（Aβ）對癲癇（EP）發(fā)病機(jī)制的影響。 方法 按隨機(jī)數(shù)字表法將40只6～8周Wistar大鼠分為Aβ1-42+PILO組、Aβ1-42組、PBS+PILO組、PBS組，每組各10只；前兩組合稱為Aβ1-42模型組，后兩組合稱為PBS對照組。采用腦立體定位儀在Aβ1-42模型組大鼠海馬CA3區(qū)注入Aβ1-42，PBS對照組給予相同劑量的PBS。2周后觀察大鼠Morris水迷宮實驗，記錄逃避潛伏期、目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間比例和穿越平臺次數(shù)，檢測大鼠AD模型是否成功。建模成功后通過腹腔（IP）注射氯化鋰-匹羅卡品（LI-PILO）制備大鼠慢性EP模型，依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄EP發(fā)作潛伏期、發(fā)作程度和死亡率。 結(jié)果 Aβ1-42模型組和PBS對照組各有1只大鼠死亡。Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果，Aβ1-42 模型組與PBS對照組大鼠相比，逃避潛伏期顯著延長（P < 0.01），目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間比例縮短（P < 0.05），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P < 0.05），表明AD模型制備成功。制備大鼠EP模型：依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)，Aβ1-42+PILO組與PBS+PILO組相比，EP發(fā)作潛伏期顯著縮短（P < 0.01），發(fā)作程度更重（P < 0.05）；Aβ1-42+PILO組與PBS+PILO組相比死亡率顯著增加（P < 0.05）。 結(jié)論 通過海馬CA3區(qū)注射Aβ1-42，可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)與海馬有關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能受損。在Aβ存在的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)EP發(fā)作的易感性增加。

[關(guān)鍵詞] β-淀粉樣蛋白；癲癇；阿爾茨海默??；易感性

[中圖分類號] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0025-05

[Abstract] Objective To study the effects of β-amyloid protein （Aβ） on the pathogenesis of epilepsy （EP）. Methods 40 male Wistar rats were divided into Aβ1-42 + PILO group， Aβ1-42 group， PBS + PILO group and PBS group by random number table， with 10 rats in each group. The former two groups were called Aβ1-42 model group and the later PBS control group. Aβ1-42 and same volume PBS were injected into the hippocampal CA3 region of Wistar rats in Aβ1-42 model group and PBS control group by stereotaxic apparatus respectively， and the Morris water maze test was observed after 2 weeks. Escape latency， the percentage of swimming time in the target quadrant and the number of times of crossing the platform were recorded. After the AD model was successfully made， the rat model of chronic EP was established by intraperitoneal injection of LI-PILO. The latency of EP， degree of seizure and mortality of rats were recorded according to Racine grading criteria. Results One rat died in Aβ1-42 model group and the PBS control group. The results of Morris water maze test showed that compared with the PBS control group， the escape latency of the Aβ1-42 model group was longer （P < 0.01）， the proportion of swimming time in the target quadrant was shorter （P < 0.05）， and the number of crossing the platform was also significantly reduced （P < 0.05）. It indicated that the AD model was successfully prepared. Preparation of rats EP model： The latency of EP in Aβ1-42 + PILO group was significantly shorter （P < 0.01）， and the degree of seizure was more severe （P < 0.05）， compared with PBS + PILO group， according to Racine grading criteria. The mortality of rats in Aβ1-42 + PILO group was significantly increased compared with PBS + PILO group （P < 0.05）. Conclusion It can lead to the impaired hippocampus-related learning and memory function by injection of Aβ1-42 in hippocampal CA3 region of rats. The existing of Aβ increasing the susceptibility to EP in the rats， which indicates that Aβ plays a facilitation role in the occurrence of EP.endprint

[Key words] Beta amyloid protein； Epilepsy； Alzheimer disease； Susceptibility

癲癇（EP）是神經(jīng)科常見疾病，長期EP發(fā)作導(dǎo)致近40%的患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且EP患者意外死亡的風(fēng)險比普通人群高2～3倍[1-2]。近40年來老年患者占EP患者比例越來越高，繼卒中后癲癇（PSE）發(fā)病率升高之外，EP和阿爾茨海默?。ˋD）之間的共病現(xiàn)象也得到越來越多的重視[3]。EP和AD之間相關(guān)性研究成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域討論的熱點問題。本研究目的主要是通過動物實驗，在行為學(xué)方面，研究β-淀粉樣蛋白（Aβ）導(dǎo)致EP發(fā)作易感性增加及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組

選擇SPF級雄性Wistar大鼠40只（動物合格證號：SCXK（魯）20140007），周齡為6～8周，體重為200～220 g，每籠3～4只；室溫保持（24±2）℃，室內(nèi)濕度維持55%左右，12 h晝/夜循環(huán)燈光環(huán)境中，可自行獲取固體食物和水，觀察無自主EP發(fā)作入選。采用隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為4組，分別為Aβ1-42+PILO組、Aβ1-42組、PBS+PILO組、PBS組，每組各10只大鼠，前2組合稱為Aβ1-42模型組，后2組合稱為PBS對照組。所有操作程序均符合青島大學(xué)動物倫理委員會規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 β-淀粉樣蛋白，批號：SCP0038，匹羅卡品，批號：1538902，氯化鋰，批號：746460，均購自美國Sigma公司。

1.2.2主要儀器 動物腦立體定位儀，型號：902-A，購自美國KOPF公司；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，型號：SMART3.0，購自西班牙Panlab。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠AD模型的制備 參照文獻(xiàn)[4]方法，Aβ1-42模型組給予10%的水合氯醛400 mg/kg IP注射進(jìn)行麻醉。將微量注射器固定在定位儀上，硬膜下進(jìn)針深度3.0 mm，吸入5 μL聚集態(tài)的Aβ1-42，微量器以1 μL/min速度垂直慢慢推入雙側(cè)海馬CA3區(qū)，藥物完全進(jìn)入后，為使溶液足以完全進(jìn)入，留針5 min后，緩慢拔出以免藥物溢出。PBS對照組大鼠按上述方法給予相同劑量的PBS。

上述實驗結(jié)束14 d后，用Morris水迷宮（MWM）實驗檢測AD模型是否成功。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]方法，本實驗設(shè)定跟蹤時間為2 min，當(dāng)?shù)竭_(dá)設(shè)定時間或者大鼠已經(jīng)成功到達(dá)平臺停止跟蹤記錄。水迷宮實驗持續(xù)7 d。前6 d，是大鼠的定位航行實驗，每天上午和下午各訓(xùn)練2次，共4次，每次訓(xùn)練在對角象限內(nèi)面向水池壁放入水中，大鼠若在2 min內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)平臺，就將其帶領(lǐng)到平臺上保持15 s，并終止此次訓(xùn)練。若2 min的任意時間，大鼠能找到平臺，使其停留在上面15 s，后終止此次訓(xùn)練。測定大鼠到達(dá)平臺的時間，記作逃避潛伏期，此項檢測動物學(xué)習(xí)能力；實驗進(jìn)行第7天，移出池內(nèi)平臺，讓大鼠面向池壁選擇在第Ⅱ象限內(nèi)入水，保證其自由游泳時長持續(xù)2 min。記錄每只大鼠在2 min內(nèi)穿過原平臺位置（即第Ⅲ象限中央）的次數(shù)和在原平臺位置滯留時間與總游泳時長比例，用于動物記憶能力評估。

1.3.2大鼠EP模型的制備 構(gòu)建AD模型成功后，Aβ1-42+PILO組與PBS+PILO組，通過IP注射LI-PILO制備慢性EP動物模型，參考文獻(xiàn)[6]方法，注射PILO后觀察大鼠的行為學(xué)改變，依據(jù)Racine（1972）分級標(biāo)準(zhǔn)[7]將大鼠驚厥發(fā)作分為0～Ⅴ級，發(fā)作程度0級，評分記6分，發(fā)作程度Ⅰ級，評分記5分，以此類推，發(fā)作程度Ⅴ級，評分記1分。若在30 min內(nèi)大鼠不能到達(dá)Ⅳ級及以上發(fā)作，再次注射PILO 10mg/kg，以后每15分鐘給藥1次，可連續(xù)追加5次，直到大鼠出現(xiàn)Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）。SE維持90 min后，給予IP注射地西泮10 mg/kg控制EP發(fā)作，降低死亡率。若給予地西泮后，30 min內(nèi)SE未能終止發(fā)作，可再次給予地西泮10 mg/kg IP注射，直到SE發(fā)作停止，最多3次。記錄大鼠EP發(fā)作達(dá)到Ⅳ級及以上的潛伏期（Ⅱ級以上發(fā)作為準(zhǔn)），發(fā)作程度和死亡率。模型制備成功后，采用自動視頻檢測系統(tǒng)觀察大鼠的行為變化并記錄有無慢性反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（SRS）[8]，觀察時間為8∶00～20∶00。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠AD模型結(jié)果

注射Aβ1-42后，當(dāng)天Aβ1-42+PILO組大鼠死亡1只；注射PBS后，第2天PBS+PILO組大鼠死亡1只。推測死亡原因系大鼠個體差異導(dǎo)致對藥物及手術(shù)不耐受。2周后進(jìn)行MWM實驗，Aβ1-42模型組與PBS對照組相比，逃避潛伏期顯著延長（P < 0.01），表明Aβ1-42模型組大鼠學(xué)習(xí)能力下降；目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間減少（P < 0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著減少（P < 0.05），提示Aβ1-42組大鼠記憶能力下降，說明AD模型制備成功。見表1。

2.2 大鼠EP模型結(jié)果

大鼠在IP注射PILO 5min后表現(xiàn)出外周膽堿能癥狀，同時或先后出現(xiàn)EP發(fā)作癥狀。見圖1。

2.3 兩組大鼠EP發(fā)作潛伏期比較

與PBS+PILO組相比，Aβ1～42+PILO組達(dá)到Ⅳ級及以上發(fā)作所需時間顯著縮短（P < 0.01）。見圖2。

2.4 兩組大鼠EP發(fā)作程度比較

實驗中，在15 min內(nèi)，Aβ1-42+PILO組有6只大鼠達(dá)到Ⅴ級發(fā)作，而PBS+PILO組僅有1只大鼠達(dá)到Ⅴ級發(fā)作。兩組大鼠EP發(fā)作程度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。endprint

2.5 兩組大鼠存活情況比較

實驗中，Aβ1-42+PILO組的大鼠有5只在實驗尚未結(jié)束時死亡，存活4只；PBS+PILO組沒有出現(xiàn)死亡的大鼠，存活9只；經(jīng)Fisher確切概率法分析，Aβ1-42+PIL0組大鼠死亡率較高（P < 0.05）。

3 討論

3.1 實驗動物模型選擇

AD最典型的的病理改變之一，是Aβ的沉積和自聚在細(xì)胞外形成SP，Aβ的過量產(chǎn)生和毒性作用是AD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[9]。本研究通過海馬CA3區(qū)注射Aβ制備AD模型，用行為學(xué)觀察指標(biāo)MWM記錄大鼠注射Aβ1-42 2周后學(xué)習(xí)和記憶能力相關(guān)數(shù)據(jù)，分析兩組數(shù)據(jù)，得出Aβ1-42組較PBS組逃避潛伏期顯著延長（P < 0.01），目標(biāo)象限內(nèi)游泳時間減少（P < 0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著減少（P < 0.05），以上實驗結(jié)果復(fù)制AD發(fā)病的相關(guān)機(jī)制及臨床表現(xiàn)，使實驗獲得理想的AD動物模型[10-11]。在癲癇發(fā)病機(jī)制研究中，本研究采用LiCl-PILO誘發(fā)大鼠慢性EP發(fā)作的模型是一種SE模型，通過興奮腦內(nèi)M膽堿能受體激活谷氨酸興奮性通路，引起海馬內(nèi)興奮性和抑制性功能失衡，出現(xiàn)SE。這種聯(lián)合用藥模型，通過大劑量LiCl（127 mg/kg，ip）大大減少PILO的用量，減輕PILO外周膽堿能作用，使EP模型的成功率增高，死亡率降低。本實驗大鼠在注射LiCl-PILO后，逐漸表現(xiàn)出以上發(fā)作過程，復(fù)制人類SE相似的臨床特征，獲得EP發(fā)病機(jī)制研究較理想的模型[12]。

3.2 Aβ增加AD患者癲癇發(fā)作機(jī)制

與實驗預(yù)期的結(jié)果一致，在Aβ1-42+PILO組大鼠EP發(fā)作潛伏期顯著縮短，發(fā)作程度重，說明Aβ的存在導(dǎo)致大鼠EP發(fā)作的易感性增加。這些發(fā)現(xiàn)支持癲癇發(fā)病機(jī)制的“二次打擊”學(xué)說，即二次腦損傷導(dǎo)致嚙齒類AD動物模型EP的發(fā)生[13]。在這些大鼠中，Aβ的增加作為第一次打擊，發(fā)生在EP發(fā)作過程中的腦損傷初期，Aβ的沉積使得神經(jīng)元過度興奮，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)易受EP樣活動的影響[14]。Aβ有助于過度活動的持續(xù)存在[15-16]。在Aβ1-42+PILO組中，EP發(fā)作相關(guān)的死亡增加值得關(guān)注。當(dāng)前證據(jù)表明，AD患者可能會增加EP發(fā)作的死亡。盡管目前還不清楚AD是否可以增加癲癇非預(yù)期性死亡的危險性[16]。但如果該研究被證實，在未來的探索中，這可能代表一種新的EP非預(yù)期性死亡發(fā)病機(jī)制。

3.3 Aβ和異常興奮的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

Palop等[17-18]通過hAAP轉(zhuǎn)基因AD動物模型實驗證實，海馬是Aβ起始位置。海馬神經(jīng)元早期的“點燃”歸因于可溶性Aβ的沉積。既往許多實驗研究均發(fā)現(xiàn)，在AD的多種小鼠模型中通過EEG檢測出海馬和皮層頻繁發(fā)放EP樣尖波和/或棘波節(jié)律，尤其是在Aβ沉積的部位。這些模型不僅在EEG上表現(xiàn)出亞臨床EP樣活動，在AD早期病程中也可表現(xiàn)出EP發(fā)作[19]。由此可見，EP和AD早期發(fā)病機(jī)制具有相關(guān)性。腦部神經(jīng)元的過度興奮是發(fā)生在AD早期的重要病理機(jī)制，并且在AD患者引起異常興奮的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。因此，認(rèn)知功能障礙可能和腦部異常興奮的神經(jīng)元有著密切聯(lián)系。隨后研究結(jié)果表明，在AD疾病早期且發(fā)病年齡較小者即可表現(xiàn)出EP發(fā)作，與上述研究吻合。Palop等[18]隨后實驗結(jié)果表明，Aβ沉積導(dǎo)致海馬神經(jīng)元興奮性異常升高，代償性地造成該區(qū)域抑制性神經(jīng)元興奮，引起整個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電活動不平衡，上述代償機(jī)制造成海馬區(qū)域內(nèi)有關(guān)學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)元及神經(jīng)突觸功能受到抑制，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。以上研究表明，Aβ的過量沉積可能會導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)，引起神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮異常增高。

EP和AD的相關(guān)性已有越來越多的基礎(chǔ)實驗及臨床研究證實，從發(fā)病機(jī)制到臨床表現(xiàn)的多種共病現(xiàn)象，尤其是病理學(xué)機(jī)制也受到極大關(guān)注，也是未來的研究方向[20]。

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（收稿日期：2017-06-25 本文編輯：李岳澤）endprint