潔凈室沉降菌監(jiān)測(cè)影響因素分析

廖波 吳永智 肖莉

[摘要] 目的 對(duì)潔凈室沉降菌監(jiān)測(cè)中可能影響微生物生長(zhǎng)的各種因素進(jìn)行試驗(yàn)分析，找出一種行之有效的操作方法。方法 按《中國(guó)藥典》2015年版四部9205要求對(duì)潔凈室沉降菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果 培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基的量、沉降碟暴露時(shí)間、沉降碟放置位置對(duì)最終監(jiān)測(cè)結(jié)果均有一定影響。結(jié)論 對(duì)潔凈室進(jìn)行沉降菌監(jiān)測(cè)時(shí)應(yīng)綜合考慮各種因素的影響，以得到最客觀的監(jiān)測(cè)結(jié)果。

[關(guān)鍵詞] 潔凈室；沉降菌；影響因素

[中圖分類號(hào)] R155.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2017）06（b）-0045-04

藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期進(jìn)行微生物檢測(cè)，內(nèi)容包括非生物活性的空氣懸浮粒子數(shù)和有生物活性微生物監(jiān)測(cè)，其中微生物監(jiān)測(cè)包括環(huán)境浮游菌和沉降菌監(jiān)測(cè)[1]。沉降菌監(jiān)測(cè)不需要特殊儀器設(shè)備，方便、簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，是實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)廠家采用得最多的方法。沉降菌監(jiān)測(cè)照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[2]。微生物檢測(cè)結(jié)果的可靠性在很大程度還依賴于操作者的技術(shù)及掌握熟練程度。因此，按系統(tǒng)控制風(fēng)險(xiǎn)的原理，在充分控制好各環(huán)節(jié)操作的前提下，培養(yǎng)基的制備就突出為影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素。目前市售的成品培養(yǎng)基基本用量在16 mL左右，培養(yǎng)時(shí)間大于3 d時(shí)普遍存在失水情況，影響檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可信度。實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基多為自配使用的原因也正在于此，但據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，因受實(shí)驗(yàn)室條件的限制，實(shí)驗(yàn)室人員在自制培養(yǎng)基時(shí)的隨意較大，體現(xiàn)在取粉量和加水量的多少、還有加熱時(shí)間和加熱溫度的不確定性、使用量的不均勻等影響因素。該文也是基于對(duì)自制培養(yǎng)基過程中風(fēng)險(xiǎn)因素的可控考慮，從配制用水所致的含水量高低、注入皿內(nèi)培養(yǎng)基的基體用量等對(duì)培養(yǎng)生檢測(cè)結(jié)果有影響的因素出發(fā)，以驗(yàn)證控制培養(yǎng)基配制條件的必要性。

1 儀器、設(shè)備與材料

1.1 儀器

全自動(dòng)數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9246MBE）；全自動(dòng)數(shù)顯生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）；全自動(dòng)數(shù)顯立式蒸汽滅菌器（YXQ.SJ41.280）；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型）；滅菌刻度吸管、試管、Q 90 mm×15 mm培養(yǎng)皿等。

1.2 設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)潔凈室，T：18～26℃，RH：45%～65%。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)20160121；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)20160208；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)20160118；沙氏葡萄糖瓊液體養(yǎng)基，批號(hào)20160302）。所有制備好的培養(yǎng)基均照《中國(guó)藥典》2015年版（四部）1421“滅菌法”[1]操作，在121℃滅菌20 min。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）（10104）]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）（63501）]、白色念珠菌[CMCC（F）（98001）]、黑曲霉菌[CMCC（F）（98003）]（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所）。所有實(shí)驗(yàn)用菌種均為第三代。

2 方法

2.1 菌液制備

取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL分別加至9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應(yīng)濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL的菌懸液備用。

取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 mL ，加入9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至相應(yīng)濃度且含菌數(shù)小于100 cfu/mL 的菌懸液備用。

取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物，加2 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，取1 mL 加至9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋成相應(yīng)濃度且含孢子數(shù)小于100 cfu/mL 的孢子懸液備用。菌液計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

2.2 方法驗(yàn)證

培養(yǎng)基適用性檢查：每次均以兩個(gè)平皿在操作臺(tái)暴露4 h作為陰性對(duì)照。比值計(jì)算公式：

2.2.1培養(yǎng)基失重情況考察（單位：g） ①取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）先在30～35℃常規(guī)預(yù)培養(yǎng)48 h后在潔凈室動(dòng)態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。結(jié)果見表2。

②取制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟（培養(yǎng)基量30 mL）以雙層透明無(wú)菌袋包裝燙封后先在30～35℃預(yù)培養(yǎng)48 h后，在潔凈室動(dòng)態(tài)環(huán)境下暴露4 h，再依法培養(yǎng)。結(jié)果見表3。

2.2.2培養(yǎng)基量對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟45個(gè)（培養(yǎng)基加入量分別為：20、30、40 mL各15個(gè)），以雙層透明無(wú)菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無(wú)菌生長(zhǎng)。在潔凈室操作臺(tái)均勻放置，動(dòng)態(tài)暴露4 h后，取不同培養(yǎng)基量的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值計(jì)算比值。結(jié)果見表4。

2.2.3暴露時(shí)間對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟60個(gè)（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無(wú)菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無(wú)菌生長(zhǎng)。分成4組，每組15個(gè)，在潔凈室操作臺(tái)均勻放置，動(dòng)態(tài)暴露時(shí)間分布為1、2、3、4 h，取不同暴露時(shí)間的沉降碟分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值計(jì)算比值。結(jié)果見表5。

2.2.4培養(yǎng)方式對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 ①培養(yǎng)方式1：常規(guī)培養(yǎng)。依法制備胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沉降碟15個(gè)（培養(yǎng)基加入量30 mL）以雙層透明無(wú)菌袋包裝燙封后在30～35℃培養(yǎng)48 h，無(wú)菌生長(zhǎng)。在潔凈室操作臺(tái)均勻放置，動(dòng)態(tài)暴露4 h后，分為5組分別接種。接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液的，于30～35℃培養(yǎng)2 d；接種白色念珠菌、黑曲霉菌菌液的，于20～25℃培養(yǎng)5 d。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值計(jì)算比值。結(jié)果見表6。

②培養(yǎng)方式2：密封培養(yǎng)。如①操作，以雙層透明無(wú)菌袋包裝燙封后續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果見表6。

③培養(yǎng)方式3：加濕培養(yǎng)。如①操作，續(xù)培養(yǎng)期間于培養(yǎng)箱拖水盤中加入適量水或在培養(yǎng)箱中放入裝水的燒杯，每天檢查水量并及時(shí)補(bǔ)充，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，取平均值計(jì)算比值。結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基失重情況考察

因?yàn)椴捎玫某两档皇墙K端滅菌，制備好后要100%進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。常規(guī)預(yù)培養(yǎng)后依法操作，培養(yǎng)基總失重平均占比情況（失重率%）結(jié)果如表7。

說(shuō)明采用密封預(yù)培養(yǎng)能明顯減少預(yù)培養(yǎng)過程中的水分損失，同時(shí)在沉降菌監(jiān)測(cè)中沉降碟不應(yīng)放置于通風(fēng)口附近。因?yàn)椴煌瑵崈羰一蛏a(chǎn)車間環(huán)境條件不一樣，受溫度濕度及層流的風(fēng)速的影響，培養(yǎng)基失重?cái)?shù)據(jù)會(huì)有一定波動(dòng)。

3.2 培養(yǎng)基量干擾培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)基為20、30、40 mL驗(yàn)證測(cè)得比值均在0.5～2范圍內(nèi)。但培養(yǎng)基量以30～40 mL為宜；20 mL量較少，水份損失后對(duì)微生物生長(zhǎng)有一定影響，例如銅綠假單胞菌，比值僅為0.59；實(shí)際操作時(shí)不可能采用量器加培養(yǎng)基，加量不會(huì)很精準(zhǔn)，多于40 mL已接近培養(yǎng)皿上沿，操作不當(dāng)可能導(dǎo)致培養(yǎng)基溢出，同時(shí)黑曲霉培養(yǎng)5 d后已生成較為豐富的菌絲，如接觸皿蓋，造成計(jì)數(shù)困難，且孢子一旦逸出則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。

3.3 通風(fēng)口附近不宜放置沉降碟

培養(yǎng)時(shí)間在1～4 h之間各菌驗(yàn)證測(cè)得比值均在0.5～2之間，且同一種菌4個(gè)時(shí)間段的比值無(wú)顯著性差異。說(shuō)明采用密封預(yù)培養(yǎng)、高澆注培養(yǎng)基及避免在通風(fēng)口附近放置沉降碟后，單向氣流暴露4 h的水分損失不足以影響微生物的生長(zhǎng)。

3.4 合理選擇需氧或厭氧培養(yǎng)條件

對(duì)于許多需氧微生物而言，氧氣是其呼吸作用的最終電子受體，對(duì)其生長(zhǎng)至關(guān)重要[3]。在方式2的培養(yǎng)中，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉都是需氧菌，尤其是枯草芽孢桿菌在其生長(zhǎng)過程中能迅速消耗環(huán)境中的游離氧，形成厭氧環(huán)境，使復(fù)蘇遲緩的個(gè)體無(wú)法生長(zhǎng)，故驗(yàn)證測(cè)得比值均低于0.5。只有金黃色葡萄球菌是需氧或兼性厭氧菌，在缺氧的環(huán)境中仍能維持驗(yàn)證測(cè)得比值在0.5～2范圍內(nèi)。

3.5 培養(yǎng)基含水量直接影響檢出效率

水是所有生命形式都無(wú)法或缺的。水的可利用度是由材料或液體中的水活度來(lái)反映的（水活度為在同等溫度和壓力下，某種材料上方空間內(nèi)的水蒸氣與純水上方空間內(nèi)的水蒸氣的壓力之比）。革蘭氏陰性菌不能在水活度低于0.97的環(huán)境中生長(zhǎng)，而革蘭氏陽(yáng)性菌則可以在水活度0.8～0.98的環(huán)境中生長(zhǎng)。在方式3的培養(yǎng)中，因?yàn)樘岣吡伺囵B(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度（從34%提高到66%），有效地降低了培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中的水分損失，從而提高了培養(yǎng)環(huán)境中的水活度，有利于微生物的生長(zhǎng)，所有對(duì)照菌的驗(yàn)證測(cè)得菌數(shù)均有明顯的提高，比值均提高到0.8以上。建議有條件的實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)對(duì)象系對(duì)水含量敏感的菌類時(shí)，盡量在可調(diào)節(jié)和濕度的專業(yè)培養(yǎng)設(shè)備中完成培養(yǎng)，提高檢出效率。

3.6 兼顧沉降碟采樣時(shí)間與工作效能的平衡

考慮到單向氣流暴露4 h，培養(yǎng)基水分損失后是否會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，藥典和GMP提出“單個(gè)沉降碟的暴露時(shí)間可以少于4 h，同一位置可使用多個(gè)沉降碟連續(xù)進(jìn)行檢測(cè)并累計(jì)計(jì)數(shù)”的方法，這一方法不適應(yīng)于生產(chǎn)企業(yè)，非無(wú)菌產(chǎn)品和無(wú)菌產(chǎn)品的生產(chǎn)車間需控制面積大，采用累積計(jì)數(shù)法，沉降碟成倍增加，極大增加了工作量。

綜上所述，密封預(yù)培養(yǎng)、高澆注培養(yǎng)基、遠(yuǎn)離通風(fēng)口放置、加濕續(xù)培養(yǎng)的聯(lián)合運(yùn)用，既能滿足《中國(guó)藥典》2015年版和《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測(cè)試方法》對(duì)潔凈室沉降菌監(jiān)測(cè)的要求，又能使監(jiān)測(cè)結(jié)果科學(xué)、客觀、可靠。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] GB/T 16294-2010.醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測(cè)試方法[S].北京：中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，2010.

[3] [英]S.P.德尼爾，等.藥物微生物學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：40，46.

（收稿日期：2017-03-13）