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      發(fā)酵法生產(chǎn)十二碳二元酸的高效菌株復(fù)合篩選的研究

      2017-10-20 11:53:29姚嘉旻盧利玲
      絲路視野 2017年21期
      關(guān)鍵詞:突變率產(chǎn)酸發(fā)酵罐

      姚嘉旻 盧利玲

      【摘要】選取現(xiàn)有保藏菌株作為實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株,利用兩步濃縮法篩選α,ω?氧化性強(qiáng)、β?氧化性弱的酵母菌優(yōu)勢(shì)菌株。經(jīng)發(fā)酵罐驗(yàn)證,發(fā)酵155h產(chǎn)酸約180克/升,達(dá)到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)菌株的目的,增加二元酸項(xiàng)目的競(jìng)爭(zhēng)力及應(yīng)變能力。

      【關(guān)鍵詞】十二碳二元酸;復(fù)合誘變;顯色篩選

      本課題針對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸工藝的研究進(jìn)展及其現(xiàn)狀,通過系列誘變篩選來(lái)挑選出烷烴轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸性能更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株,為發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸高效菌株的篩選提供依據(jù)。

      一、材料與方法

      (一)材料

      1.出發(fā)菌種:經(jīng)初步產(chǎn)酸評(píng)價(jià)后,初步確定6株保藏菌株作為誘變育種出發(fā)菌株。

      2.試劑

      糖蜜,尿素,酵母膏,均為工業(yè)級(jí)。

      3.培養(yǎng)基

      (1)篩選培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基成分。(2)基礎(chǔ)上有所改變,如下:蔗糖碳源培養(yǎng)基、烷烴碳源培養(yǎng)基;顯色培養(yǎng)基。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:成分與種子培養(yǎng)基一致,烷烴量根據(jù)實(shí)際要求足量添加。

      (二)方法

      1.分析方法

      (1)產(chǎn)酸量。搖瓶發(fā)酵、破乳抽提,用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液標(biāo)定二元酸產(chǎn)酸含量。(2)二元酸成分同。(3)提純長(zhǎng)鏈二元酸產(chǎn)品,干燥后經(jīng)氣相色譜分析測(cè)定二元酸成分。

      2.初篩程序

      出發(fā)菌株→篩選培養(yǎng)基(初篩A)→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基(初篩B)→初篩菌株→初篩產(chǎn)酸驗(yàn)證。

      3.復(fù)篩程序

      初篩菌株→物理化學(xué)誘變→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基(復(fù)篩A)→秋水仙堿產(chǎn)酸培養(yǎng)基→鉻酸鉀產(chǎn)酸培養(yǎng)基(復(fù)篩濃縮B)→復(fù)篩優(yōu)勢(shì)菌株。

      二、結(jié)果與討論

      (一)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      1.紫外誘變

      圖1分析,熱帶假絲酵母菌的紫外誘變致死率與照射時(shí)間呈正相關(guān)性;同時(shí),紫外誘變的正突變率隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)而后降低的變化趨勢(shì),選擇紫外誘變照射時(shí)間為150秒較適宜,其對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為88%、40%.

      2.超聲波誘變

      誘變時(shí)長(zhǎng)為12min時(shí),對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為94%、45%,而誘變時(shí)長(zhǎng)為15min時(shí),對(duì)應(yīng)致死率及正突變率分別為99%、48%,選擇誘變時(shí)間為12min更為適宜。再經(jīng)兩步濃縮法獲得誘變正突變菌株56株。

      (三)產(chǎn)酸驗(yàn)證

      1.搖瓶產(chǎn)酸驗(yàn)證

      出發(fā)菌株QJ-EY09初始產(chǎn)酸水平僅為75g/L,經(jīng)復(fù)合誘變篩選流程,突變菌株最高產(chǎn)酸水平約185g/L,產(chǎn)酸水平是出發(fā)菌株的2.4倍。

      2.發(fā)酵罐產(chǎn)酸驗(yàn)證

      選擇搖瓶產(chǎn)酸對(duì)應(yīng)烷烴轉(zhuǎn)化率較高的誘變菌株,經(jīng)發(fā)酵罐放大驗(yàn)證:發(fā)酵周期為140h時(shí),發(fā)酵產(chǎn)酸水平為185g/L,達(dá)到既定篩選優(yōu)勢(shì)菌株效果。

      三、討論

      選取生產(chǎn)保藏菌株QJ-EY09作為誘變育種出發(fā)菌株,合理制定紫外-超聲波誘變方法,復(fù)篩出正突變菌株;利用兩步濃縮法及顯色平板篩分,獲得α,ω-氧化增強(qiáng)、β-氧化減弱的誘變突變株56株;經(jīng)發(fā)酵罐驗(yàn)證,發(fā)酵140h產(chǎn)酸185克/升,達(dá)到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢(shì)菌株的目的。

      參考文獻(xiàn)

      [1]焦鵬,華玉濤,李書良.熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化烷烴過程中P450酶活的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2001,41(01):117~120.

      [2]歐陽(yáng)晶,榮東,郝秀珍.熱帶假絲酵母?;o酶A氧化酶的純化及性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)報(bào),2002,42(06):713~719.

      [3]趙興青.發(fā)酵法生產(chǎn)十三碳二元酸的試驗(yàn)研究[D].沈陽(yáng):東北大學(xué),2003.

      [4]劉樹臣,李淑蘭,金平.十二碳二元酸發(fā)酵研究[J].微生物學(xué)報(bào),2002,42(06):748~780.

      作者簡(jiǎn)介:姚嘉旻(1981—),男,江蘇淮安人,研究方向:石油產(chǎn)品相關(guān)的發(fā)酵工程及分離工程。

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