姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路的影響

仇志富 吳曉光 顏 勇 李蒙蒙 張麗華

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，河北 承德 067000)

姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路的影響

仇志富 吳曉光 顏 勇 李蒙蒙 張麗華1

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，河北 承德 067000)

目的探究姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組，每組大鼠18 只。其中模型組、低、高劑量姜黃素慢性腦缺血大鼠模型的制備采用將大鼠兩側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的方法進(jìn)行，假手術(shù)組和模型組分別灌胃給予生理鹽水。免疫組化法檢測PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，干濕重法檢測腦組織水含量，甲酰胺法檢測血腦屏障通透性。結(jié)果同模型組比較，姜黃素組PI3K、AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，腦組織含水量、Bax蛋白表達(dá)及伊文思藍(lán)含量顯著降低(P<0.05)，高劑量姜黃素組效果優(yōu)于低劑量姜黃素組。結(jié)論姜黃素對缺血性腦損傷的保護(hù)作用可能是其在降低血腦屏障通透性之后，激活了PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，通過調(diào)節(jié)二者比值實(shí)現(xiàn)，姜黃素的腦保護(hù)效果與劑量相關(guān)。

姜黃素；PI3K/AKT信號通路；Bcl-2；Bax

腦缺血再灌注損傷中最常出現(xiàn)的是細(xì)胞凋亡。在眾多細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最為重要的，其發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制可通過調(diào)控凋亡蛋白和基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)〔1〕。神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但是它作為大分子，通過血腦屏障很難。姜黃素是一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗細(xì)胞凋亡等藥理作用，可以阻止神經(jīng)元損傷，對神經(jīng)變性病變具有保護(hù)作用；可以改善外周神經(jīng)病、腦損傷等多種疾病癥狀〔2〕。但姜黃素對PI3K/AKT信號通路的影響卻鮮有報(bào)道。本研究觀察姜黃素對腦缺血模型大鼠腦組織中的PI3K、AKT、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)等凋亡密切相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 成年雄性清潔級SD大鼠72只，體質(zhì)量(250±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。姜黃素，購自上海鼎瑞貿(mào)易有限公司。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒，購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax多抗，購自上海延生實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物分組和處理 大鼠稱重編號后用隨機(jī)數(shù)字表法分組：假手術(shù)組、模型組、低、劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組，各18只。35 mg/kg水合氯醛麻醉后，參照文獻(xiàn)〔3〕方法造模，模型組、低、高劑量姜黃素組、腦缺血大鼠模型的制備采用將大鼠兩側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的方法進(jìn)行，假手術(shù)組僅僅裸露頸總動(dòng)脈、神經(jīng)。用二甲基亞砜(DMSO)將姜黃素純品配制成終濃度為50 mg/L的母液，過濾除菌后于-20℃避光存儲，每次用前將培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。在造模后第28天起，低、高劑量姜黃素組予200、300 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，連續(xù)干預(yù)35 d；假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水。

1.3PI3K、AKT蛋白表達(dá)檢測 在最后給藥的12 h之后，按隨機(jī)方法在每組中選出6只大鼠，以乙醚麻醉斷頭處理，選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，10%CH3CHO置于4℃冰箱固定48 h，石蠟包埋，冠狀切片5 μm厚，常規(guī)脫蠟、酒精浸水，以檸檬酸鹽緩沖液微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，水洗后分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多抗，于4℃下靜置12 h，孵育液30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色之后蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陽性細(xì)胞吸光度的檢測：MiVnt圖形采集分析系統(tǒng)、取平均值、利用PBS作陰性對照。

1.4凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax的檢測 按照SABC步驟染片，將48 h的腦組織切片脫蠟至水，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行，高倍鏡下觀察胞質(zhì)著色呈棕黃色的為陽性細(xì)胞。

1.5腦組織含水量檢測 各組隨機(jī)取6只大鼠斷頭、取腦，去除嗅球部分，稱濕重后于90℃干燥箱干燥24 h，再稱重，計(jì)算腦組織含水量。

1.6血腦屏障通透性檢測 每組遺留的6只大鼠，2%伊文思藍(lán)于大鼠的尾部靜脈注射，3 h后以水合氯醛麻醉，0.2 L生理鹽水于大鼠左心室注射來沖洗血管內(nèi)血液，取腦稱量，腦組織放于甲酰胺內(nèi)，于60℃下水浴24 h，勻漿后離心(1 000 r/min，6 min)，635 nm波長處檢測上清液的OD值，以此計(jì)算伊文思藍(lán)含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組PI3K蛋白、AKT蛋白陽性表達(dá)比較 PI3K蛋白、AKT蛋白陽性表達(dá)為棕黃色模型組較假手術(shù)組PI3K、AKT明顯升高(P<0.05) ；與模型組比較，低、高劑量姜黃素組PI3K、AKT蛋白均明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)、含水量及伊文思藍(lán)含量、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2各組腦組織含水量比較 模型組較假手術(shù)組腦組織水含量明顯增加(19.93±4.69)%(P<0.05)；低、高劑量姜黃素組較模型組腦組織水含量分別下降了(13.99±1.98)%和(12.99±1.97)%(P<0.05)，見表1。

2.3各組血腦屏障通透性比較 模型組較假手術(shù)組伊文思藍(lán)顯著增加(596.39±129.79)%(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量姜黃素組伊文思藍(lán)各自降低了(42.97±7.92)%和(39.85±7.93)%(P<0.05)，見表1。

2.4Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化 在梗死灶周圍皮質(zhì)或紋狀體內(nèi)可見Bcl-2陽性細(xì)胞，假手術(shù)組只可呈現(xiàn)Bcl-2、Bax少量反應(yīng)。缺血周邊區(qū)，模型組及姜黃素組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)皆較假手術(shù)組升高(P<0.05)。姜黃素組Bcl-2表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，Bax表達(dá)明顯少于模型組(P<0.05)，見表1。

3 討 論

有效地抑制或減少細(xì)胞凋亡是實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用的重要手段。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞生存的信號通路之一，其在細(xì)胞增殖、分化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面起重要作用〔4〕。腦缺血后，機(jī)體本身可以釋放出一些能夠?qū)⒕哂欣野彼峒っ富钚允荏w激活的物質(zhì)，如神經(jīng)細(xì)胞生長因子、整合素等，受體經(jīng)過其磷酸化以后會特異性地結(jié)合PI3K的調(diào)節(jié)亞基，從而將PI3K激活；同時(shí)兼?zhèn)渲惣っ富钚耘c蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，生成第二信使。PI3K結(jié)合其下游的效應(yīng)分子AKT的PH結(jié)構(gòu)域，AKT從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，構(gòu)象改變，Thr308位點(diǎn)及Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，由抑制狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。AKT活性的最終實(shí)現(xiàn)需要依賴Ser473的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成為p-AKT。p-AKT通過直接將其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者間接改變、編碼凋亡相關(guān)蛋白的基因表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用〔5，6〕?？傊?，PI3K/AKT信號通路激活后，能夠作用于Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB等下游凋亡靶蛋白，通過激活或抑制表達(dá)來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)與呂俊杰等〔7〕結(jié)論一致，提示缺血再灌注損傷中，姜黃素發(fā)揮的保護(hù)效果必然與PI3K/AKT信號通路的激活密不可分。

血腦屏障通透性破壞引發(fā)的腦水腫對于神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡發(fā)揮著促進(jìn)作用，使細(xì)胞功能障礙和壞死現(xiàn)象加重，因此兩者經(jīng)常被選為衡量缺血性腦病治療效果的指標(biāo)〔8〕。Bcl-2/Bax值直接影響細(xì)胞凋亡狀態(tài)，Bcl-2/Bax值越大，則對凋亡抑制作用越明顯，反之，則促進(jìn)凋亡。二者發(fā)揮作用的方式都是經(jīng)過上游生物學(xué)信號激活之后，通過對相關(guān)下游基因的激活來完成的，其中PI3K/AKT信號通路便可激活二者，調(diào)節(jié)兩者之間的比值變化〔9，10〕。本實(shí)驗(yàn)中姜黃素給藥后，兩者比值發(fā)生顯著變化，提示由PI3K/Akt信號通路激活所引發(fā)Bcl-2/Bax值變化。本文結(jié)果顯示姜黃素能夠降低BBB通透性，激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過介導(dǎo)Bcl-2、Bax發(fā)生相應(yīng)變化，即調(diào)節(jié)二者比值實(shí)現(xiàn)減輕腦水腫、抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。然而PI3K/AKT信號通路激活后可以介導(dǎo)多種凋亡因子，本文僅研究了凋亡因子Bcl-2、Bax，姜黃素激活PI3K/AKT信號通路后是否也能介導(dǎo)其他凋亡因子發(fā)生改變尚不明確；姜黃素的療效與其給藥劑量密切相關(guān)，何種劑量能夠發(fā)揮其最佳療效尚需研究；同時(shí)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路眾多，其是否能夠激活其他重要的通路仍然不得而知。

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〔2016-06-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R285

A

1005-9202(2017)19-4756-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.028

1 華北石油總醫(yī)院普外科

吳曉光(1975-)，男，碩士，主要從事腦缺血損傷機(jī)制及藥物干預(yù)研究。

仇志富(1988-)，男，碩士在讀，主要從事腦病損傷機(jī)制及藥物干預(yù)研究。