蝦肝腸胞蟲Taqman熒光PCR方法的建立與應用

張 娜，謝艷輝，陳進會，李家僑，斯?jié)啥?，黃 磊

（1. 湛江出入境檢驗檢疫局，廣東湛江 524000；2. 東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 441900）

蝦肝腸胞蟲Taqman熒光PCR方法的建立與應用

張 娜1，謝艷輝1，陳進會2，李家僑1，斯?jié)啥?，黃 磊1

（1. 湛江出入境檢驗檢疫局，廣東湛江 524000；2. 東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 441900）

為給蝦肝腸胞蟲（EHP）的監(jiān)測和控制工作提供特異、靈敏的快速檢測方法，針對EHP 18S相關(guān)保守序列設(shè)計1對特異性引物，優(yōu)化并建立EHP的Taqman熒光PCR檢測方法，同時驗證該方法的重復性和敏感性。結(jié)果顯示：體系擴增的最佳退火溫度為60 ℃，構(gòu)建好的質(zhì)粒標準品標準曲線斜率為-3.195，R2為0.991；擴增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與標準模板起始量（X）的關(guān)系曲線為-3.195×Log（X）+36.923，擴增效率為105.59。使用所構(gòu)建方法檢測湛江市EHP流行情況，同時對樣品進行白斑綜合癥病毒（WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、桃拉綜合征病毒（TSV）、早期死亡綜合癥（AHPND）病毒檢測。結(jié)果顯示：樣品的WSSV、IHHNV、TSV檢測均為陰性；AHPND檢出陽性率為10%，EHP為30%，其中1份樣品的EHP和AHPND檢測同為陽性。本研究建立的EHP熒光PCR方法具有特異、靈敏等優(yōu)點。該方法及其臨床應用數(shù)據(jù)可為EHP的防控提供技術(shù)參考。

蝦肝腸胞蟲；南美白對蝦；Taqman熒光PCR

Abstract：To provide specific，sensitive and rapid detection methods for the monitoring and control of Enterocytozoon hepatopenaei（EHP），Taqman fluorescent PCR method to detect EHP of Shrimp microsporidian was developed，a pair of specific primers was designed according to the conserved sequences of EHP 18S published in Genbank，its repeatability and sensitivity were detected in this study. The results showed that the optimum annealing temperature was 60 ℃，the standard cycles of amplification threshold（Ct）and the logarithmic of the initial template quantity[log（Sq）] conformed to Ct=-3.195×Log（X）+36.923，of which the coefficient of association R2was 0.991，the slope was -3.195，the amplification efficiency was 105.59. The results showed that the method had nice property and high sensitivity. By examing the growth of the 20 vannamei samples collected from Zhanjiang area with the method of this experiment，the samples were also examined for WSSV，IHHNV，TSV and AHPND，test results showed that WSSV，IHHNV and TSV had incidence of 0，AHPND had incidence of 10%，EHP had incidence of 30%，and one shrimp sample showed co-infection of AHPND and EHP. In conclusion，a highly specific，sensitive method was developed，which could be a useful tool in the prevention and control of Shrimp microsporidian E.hepatopenaei.

Key words：Enterocytozoon hepatopenaei；Shrimp microsporidian；Taqman fluorescent PCR method

隨著南美白對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，疫病成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。蝦急性肝胰腺壞死/蝦早死綜合癥（AHPND/EMS）[1]、蝦肝腸胞蟲病[2]等新發(fā)疫病的發(fā)生，更加重了養(yǎng)殖企業(yè)的風險和負擔，使得我國對蝦養(yǎng)殖成功率逐年下降，嚴重影響了對蝦進出口貿(mào)易和對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)湛江出入境檢驗檢疫局的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，近幾年湛江市對蝦出口不斷下滑，2015年出口對蝦14.95萬噸，同比減少16.28%。

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原，2009年，在泰國的斑節(jié)對蝦中首次被分離和命名[2-3]。盡管EHP不會引起對蝦很高的死亡率，也不會出現(xiàn)明顯癥狀，但可使對蝦生長緩慢，當發(fā)生混合感染時，會加重對蝦疫情，增加致死率[4]。目前，EHP的傳播越來越廣泛。有信息表明，中國、印度尼西亞、馬來西亞、越南、印度和泰國的對蝦中都有EHP流行[5]。因此，對其應引起足夠重視，并做好監(jiān)測和控制工作。

本研究設(shè)計建立了EHP Taqman探針熒光PCR檢測方法，同時用該方法對湛江市EHP流行情況進行了調(diào)查；通過臨床應用證明，該方法具備較好的特異性、靈敏性，可為EHP的快速檢測和監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗材料。采自湛江市的南美白對蝦樣品，經(jīng)PCR檢測并測序后確認為EHP感染，由本實驗室保存；ABI 核酸提取試劑盒、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、膠回收試劑盒、PMD18-T克隆載體、質(zhì)?；厥赵噭┖校徸源筮B寶生物（TaKaRa）工程有限公司；PCR管、吸嘴等，均為Axygen產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)細胞，由本實驗室保存。

1.1.2主要儀器設(shè)備。熒光定量PCR儀（美國ABI stepone plus）；PCR擴增儀（美國ABI 公司）；凝膠成像儀（德國Biometra公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf centrifuge 5417R）；電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1引物合成。選取EHP 18S序列中保守片段（GenBank：KX932044）， 應 用 Primer 5.0和Primer Express 2.0軟件分別設(shè)計引物和探針。引物 序 列 為 F：5′-tggtataggtgggcaaagaatga-3′；R：5′-aaggacgaaggctagagtatcgaa-3′；探針序列為 F：5′-FAM-caacggaggcgaaagcgatgctct-BHQ1。 引 物 和探針均由大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司合成，預計引物擴增片斷為111 bp。

1.2.2引物普通PCR擴增。用ABI核酸提取試劑盒提取的肝胰腺陽性組織DNA為模板，用設(shè)計引物進行PCR擴增。擴增體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，提抽物5 μL，加水補至25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃ 5 min；35次循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min；4 ℃ 保溫。

1.2.3模板標準品的制備及條件優(yōu)化。將10 μL PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳，切下目的條帶，按照膠回收試劑盒說明書進行回收；將回收的擴增片斷與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化受體菌E.coli DH5a，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h；隨機挑取白色單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8 h；用質(zhì)粒提取試劑盒提取有重組目的片斷的質(zhì)粒；對質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定陽性后，將目的條帶送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序；對測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件分析后，與擴增基因的片斷序列進行核苷酸序列同源性分析。用核酸分析儀測定提取的重組質(zhì)粒DNA濃度。經(jīng)測定，質(zhì)粒濃度為 123 μg/mL，質(zhì)粒拷貝數(shù)為 4×1010copies/μL。將提取好的重組質(zhì)粒作為本實驗定量標準品原液，-80 ℃保存。實時熒光定量PCR反應擴增體系參照Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑說明書進行，反應體系為25 μL（表1）。反應條件：95 ℃ 30 s；然后進行44次循環(huán)（95 ℃ 5 s，退火溫度 30 s）。退火溫度分別設(shè)定為56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃。

1.2.4標準曲線繪制。將構(gòu)建好的質(zhì)粒標準品進行梯度稀釋，得到 4×101～4×108copies/μL 共 8 個梯度濃度；利用上述優(yōu)化的PCR反應條件，建立質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)與Ct值對應的標準曲線，判斷標準曲線擴增質(zhì)量。

表1 反應體系構(gòu)建 （單位：μL）

1.2.5穩(wěn)定性試驗。用陰性樣品12份，37 ℃反應30 min，模擬常溫下體系的穩(wěn)定性，檢測體系是否出現(xiàn)非特異性擴增。采用已知陽性樣品4份和陰性樣品10份，每周試驗1次，檢測其的穩(wěn)定性。

1.2.6特異性試驗。以AHPND、IHHNV、WSSV、EHP的DNA為模板，分別用建立的熒光PCR方法進行檢測，對每個模板同時設(shè)2個平行樣。

1.2.7重復性試驗。由2名檢驗員進行加樣，使用1個陽性質(zhì)粒以及14個樣本進行重復試驗，比較兩次結(jié)果，判斷方法重復性的好壞。

1.2.8敏感性試驗。對已知EHP陽性核酸（測定核酸濃度為6.5×108copies/μg）進行稀釋，共得到6.5×106～6.5×101copies/μg 6個梯度；分別用梯度濃度核酸為模板，進行熒光PCR擴增。用稀釋好的模板、Somjintana[6]設(shè)計的方法進行常規(guī)PCR擴增。引物F：5′-ccggagagggagcctgaga-3′；引物R：5′-gacgggcggtgtgtacaa a-3′。反應程序為：94 ℃ 4 min，然后進行40次循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。

1.2.9臨床實際應用。從湛江市隨機抽取10家對蝦養(yǎng)殖場的20份對蝦樣品，用建立的EHP熒光方法進行檢測，同時對樣品進行WSSV、IHHNV、TSV、AHPND 4種病原檢測，用PCR方法對EHP進行確認（方法見1.2.8）。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制及條件優(yōu)化

對含目標基因的重組質(zhì)粒進行熒光PCR擴增，對比擴增效率、擴增曲線、溶解曲線等指標。當體系為 25 μL 時，確定 10 μmol/L 的引物 F/R 各為 1.0 μL；5 μmol/L 探針 0.5 μL 為最佳引物濃度；擴增退火溫度為60 ℃最佳。將構(gòu)建好的質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，用 4×101～4×108copies/μL共8個梯度濃度得到標準曲線斜率為-3.681，R2為0.998 8，擴增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與標準模板起始量（X）關(guān)系曲線為-3.681×Log（X）+44.114，擴增效率為105.59，證明所構(gòu)建的熒光PCR反應體系對標準品的擴增質(zhì)量較好。陽性質(zhì)粒相應濃度測試擴增曲線顯示，模板濃度梯度明顯，曲線增量正常，擴增Ct值合理，與標準曲線結(jié)果相對應。擴增只出現(xiàn)1個波峰說明擴增產(chǎn)物是均一的，無非特異性擴增（圖1）。

圖1 EHP熒光PCR陽性標準品擴增、標準曲線、溶解曲線試驗

2.2 穩(wěn)定性試驗

在溫育過程中，如果引物探針與體系不穩(wěn)定，就容易出現(xiàn)非特異性擴增，導致結(jié)果出現(xiàn)假陽性。用陰性樣品12份，37 ℃反應30 min，模擬常溫反應，結(jié)果顯示無非特異性擴增結(jié)果，無假陽性。用已知陽性樣品4份和陰性樣品10份，每周試驗1次，結(jié)果顯示陽性擴增曲線模板濃度梯度明顯，曲線增量正常，每次擴增的Ct值相同（圖2）。

圖2 EHP熒光PCR方法的非特異性擴增和穩(wěn)定性試驗

2.3 特異性試驗

以建立的方法分別以AHPND、IHHNV、WSSV、EHP的DNA為模板進行檢測，各設(shè)2個平行樣。結(jié)果顯示，只有EHP具有強烈的熒光信號，其他檢測樣品均為陰性，沒有熒光吸收信號（圖3）。

圖3 EHP熒光PCR方法特異性試驗

2.4 重復性試驗

2名檢驗員同時加樣進行重復試驗，結(jié)果顯示1個陽性質(zhì)粒和4個陽性樣品都有明顯擴增，陰性樣品無擴增，平行實驗的結(jié)果與樣本一致（圖4）。

圖4 EHP熒光PCR方法的重復性試驗

2.4 敏感性試驗

用已知濃度核酸為模板進行10倍梯度稀釋，共得到 6.5×106～6.5×101copies/μg 6 個梯度，結(jié)果顯示在模板濃度為6.5×102copies/μL時，仍有熒光信號（圖5）。普通PCR擴增條帶為942 bp，在模板濃度為6.5×102copies/μL時，擴增條帶用肉眼，難以看到。結(jié)果說明所建立熒光PCR方法的檢測靈敏度較普通PCR方法至少高出1個數(shù)量級（圖6）。

圖5 EHP熒光PCR方法的敏感性試驗

圖6 普通PCR方法敏感性試驗

2.5 臨床應用

從湛江市10家對蝦養(yǎng)殖場隨機抽取20份對蝦樣品，用本實驗建立的方法進行EHP檢測，同時進行WSSV、IHHNV、TSV、AHPND 4種病原檢測。檢測結(jié)果顯示：WSSV、IHHNV、TSV檢出率均為0；AHPND陽性樣品2份，檢出率為10%；EHP陽性樣品6份，檢出率為30%。有1份樣品的EHP和AHPND檢測結(jié)果均為陽性，說明養(yǎng)殖場中的對蝦存在EHP和AHPND的混合感染。EHP熒光PCR方法同普通PCR方法的檢測結(jié)果一致（圖7、圖8、圖9）。

圖7 樣品WSSV、IHHNV、TSV、AHPND熒光PCR方法檢測

圖8 樣品EHP熒光PCR方法檢測

圖9 樣品的普通PCR方法檢測結(jié)果（與熒光PCR方法檢測結(jié)果一致）

3 討論

微孢子蟲廣泛寄生于無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)，早期多寄生于野生對蝦，如褐美對蝦、白濱對蝦等。常見的對蝦微孢子蟲病原有3種，分別為八孢蟲、匹里蟲、微粒子蟲[7]。EHP是2009 年在泰國的斑節(jié)對蝦中首次被分離和命名[2]，只寄生于對蝦肝胰腺組織。EHP 導致受感染對蝦生長阻滯，個體大小差異明顯，且會導致細菌繼發(fā)感染[3]。在發(fā)現(xiàn)EHP之前，微孢子蟲主要寄生在對蝦肌肉和結(jié)締組織中[8]，引起的疾病命名為“棉花蝦病”[9]、“牛奶蝦病”[10]或“白背病”[11]。

目前，相關(guān)EHP檢測方法的研究包括SYBR Green實時熒光PCR方法、LAMP檢測方法、普通PCR方法以及巢式PCR方法等[12-16]。本研究針對EHP 18S相關(guān)保守序列，利用基因克隆方法構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建標準品，同時檢測所建立方法的穩(wěn)定性、重復性和敏感性。結(jié)果顯示，不同檢驗員進行的樣品重復性檢測結(jié)果一致，方法重復性較好。敏感性結(jié)果顯示，所建方法在模板濃度為6.5×102copies/μL DNA時，仍有較強熒光信號，較普通PCR方法檢測靈敏度至少高出1個數(shù)量級。

從湛江市10家養(yǎng)殖場隨機抽取20份15～20日齡的南美白對蝦樣品，用本研究建立的EHP熒光PCR方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)有6份陽性。這些樣品的WSSV、IHHNV、TSV檢測結(jié)果均為陰性；2個樣品的AHPND為陽性，其中1份樣品的EHP和AHPND均為陽性，說明存在2種疫病的混合感染。

2009年，我國首次暴發(fā)早期死亡綜合癥/急性肝胰腺壞死?。ˋHPND/EMS）[17]。該病首先從泰國快速蔓延到亞洲許多國家，并席卷了全球，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大影響[18]，已經(jīng)成為當前南美白對蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大障礙。AHPDA/EMS引起的高致死率吸引了人們更多的注意力，卻使人們忽視了EHP的影響。從湛江市的EHP流行情況來看，隨機抽取的蝦樣品EHP陽性率已達30%，但其臨床癥狀不明顯，沒有引起蝦農(nóng)的注意。EHP是通過親蝦垂直傳播，還是通過購買的蝦苗水平傳播，還有待研究。對對蝦所有生長周期進行EHP監(jiān)測，分析EHP來源和流行特點，將是下一步的工作重點。

[1] NACA-FAO. Quarterly Aquatic Animal Disease Report（Asia and Pacific Region）[R]. Bangkok：NACA，2011.

[2] CHAYABURAKUL K，NASH G，PRATANPIPAT P，et al.Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimp Penaeus monodon cultivated in Thailand[J]. Dis. Aquat. Org.2004，60（2）：89-96.

[3] TOURTIP S，WONGTRIPOP S，STENTIFORD G D，et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp.nov.（Microsporida：Enterocytozoonidae），a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon（Decapoda：Penaeidae）：Fine structure and phylogenetic relationships[J]. J Invert Pathol，2009，102（1）：21-29.

[4] AMORNRAT T，JIRAPORN S，SAISUNEE C，et al.The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces synodrome in whiteleg shrimp Penaeus（Litopenaeus）vannamei[J]. BMC veterinary research，2013，9（1）：139.

[5] FLEGEL T W. Historic emergence，impact and current status of shrimp pathogens in Asia[J]. Journal of invertebrate pathology，2012，110（2）：166-173.

[6] SOMJINTANA T，SOMJAI W，GRANT D S，et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov.（Microsporida：Enterocytozoonidae），a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon（Decapoda：Penaeidae）：Fine structure and phylogenetic relationships[J]. Journal of invertebrate pathology，2009，102（1）：21-29.

[7] LIGHTNER D V. A review of the diseases of cultured penaeid shrimps and prawns with emphasis on recent discoveries and developments[M]. Tigbauan：Aquaculture Department，Southeast Asian Fisheries Development Center，1985：79-103.

[8] KAMAISHI T，HASHIMOTO T，NAKAMURA Y，et al.Complete nucleotide sequences of the genes encoding translation elongation factors 1 and 2 from a microsporidian parasite，Glugea plecoglossi：implications for the deepest branching of eukaryotes[J]. Journal of biochemistry，1996，120（6）：1095-1103.

[9] WEISS L M，VOSSBRINCK C R. Microsporidiosis：molecular and diagnostic aspects[J]. Advances in parasitology，1998，40（1）：351-395.

[10] RAMASAMY P，JAYAKUMAR R，BRENNAN G P.Muscle degeneration associated with cotton shrimp disease of Penaeus indicus[J]. Journal of fish diseases，2000，23（1）：77-81.

[11] PRASERTSRI S，LIMSUWAN C，CHUCHIRD N.The effects of microsporidian（Thelohania）infection on the growth and histopathological changes in pond-reared Pacific white shrimp（Litopenaeus vannamei）[J]. Kasetsart journalnatural science，2009，43（4）：680-688.

[12] BURGHER-MACLELLAN K L，WILLIAMS G R，SHUTLER D，et al. Optimization of duplex real-time PCR with melting curve analysis for detecting the microsporidian Parasites Nosemaapis and Nosema ceranae in Apis mellifera[J].Can Entomol，2010，142（3）：271-283.

[13] DURAND S V，LIGHTNER D V. Quantitative real time PCR for the measurement of white spot syndrome virus in shrimp[J]. J Fish Dis，2002，25（7）：381-389.

[14] LOM J，DYKOA I. Ultrastructure of Nucleospora secunda n.sp.（Microsporidia），parasite of enterocytes of Nothobranchius rubripinnis[J]. Eur J Protistol，2002，38（1）：19-27.

[15] PHELPS N B，GOODWIN A E. Validation of a quantitative PCR diagnostic method for detection of the microsporidian Ovipleistophora ovariae in the cyprinid fish Notemigonus crysoleucas[J]. Dis Aquat Organ，2007，76（3）：215-221.

[16] SUEBSING R，PROMBUN P，SRISALA J，et al. Loopmediated isothermal amplification combined with colorimetric nanogold for tetection of the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei in penaeid shrimp[J]. J Appl Microbiol，2013，114（5）：1254-1263.

[17] LIGHTNER D V，REDMAN R M，PANTOJA C R，et al.Early mortality syndrome affects shrimp in Asia[J]. Global aquaculture advocate，2012，15：40.

[18] TRAN L，NUNAN L M，RENMAN R M，et al.Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp[J]. Dis Aquat Organ，2013，105（1）：45-55.

（責任編輯：朱迪國）

Establishment and Application of Taqman Fluorescent PCR Method for Detection of Enterocytozoon hepatopenaei

Zhang Na1，Xie Yanhui1，Chen Jinhui2，Li Jiaqiao1，Si Ze′en1，Huang Lei1
（1. Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000；2. Dongguan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongguan，Guangdong 441900）

S945.4

A

1005-944X（2017）10-0098-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.026

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2015GDK04、2016GDK51、2017GDK04）