PRV SD株gE基因主要抗原區(qū)域原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

鄭 輝，張 青，鄒 敏，董雅琴，劉 爽，范根成，吳發(fā)興，李曉成

（1. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；2. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

PRV SD株gE基因主要抗原區(qū)域原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

鄭 輝1，張 青1，鄒 敏1，董雅琴2，劉 爽2，范根成1，吳發(fā)興2，李曉成2

（1. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；2. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

參考豬偽狂犬病病毒（PRV）SD株gE基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過PCR方法擴(kuò)增一段包含gE主要抗原表位編碼區(qū)的618 bp片段，將其用BamHⅠ和XhoL I雙酶切后，插入到原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），進(jìn)行表達(dá)、SDS-PAGE電泳、Western-blot檢測(cè)和純化；利用表達(dá)的PRV SD gE蛋白進(jìn)行g(shù)E-ELISA鑒別檢測(cè)方法研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：gE重組蛋白得到了高效表達(dá)，融合蛋白的分子量約為42 ku；表達(dá)產(chǎn)物存在于上清液中，表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的30%以上，并且能被PRV抗體所識(shí)別。將純化后的gE蛋白作為抗原，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，建立檢測(cè)PRV抗體的間接ELISA方法。結(jié)果顯示：確定的抗原最佳包被濃度為36 μg/mL，最佳包被時(shí)間為37 ℃、1 h并4 ℃過夜，待檢血清（1:50稀釋）37 ℃作用1 h，二抗（1:3 000）37 ℃作用1 h。重復(fù)性試驗(yàn)、交叉試驗(yàn)證明該方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高。用gE-ELISA和IDEXX gE-ELISA同時(shí)對(duì)采集的92份豬血清進(jìn)行平行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法的特異性為85.71%，敏感性為90.63%，二者符合率為89.13%。該方法為我國豬偽狂犬病的鑒別監(jiān)測(cè)提供了一種可供選擇的技術(shù)手段。

豬偽狂犬病病毒；gE基因；原核表達(dá)；間接ELISA；鑒別

Abstract：A pair of primers were designed according to the sequence of the isolate PRV SD. A segment containing major episode coding area of gE gene was amplified by PCR method，which was 618 bp in length. The PCR product was inserted into the expression vector pET-32a（+）after being cleaved by BamHⅠand XhoL I. And then the recombinant plasmid was formed and transformed into BL21（DE3）. A recombination protein was expressed，identified by SDS-PAGE and Western-blot，and then purified. Based on that，differentiation ELISA for PRV gE antibody was studied. The results showed that a recombination protein of 42ku was expressed efficiently in forms of soluble，with expression level over 30%of total bacteria protein. The protein could be identified by PRV specific antibody. An indirect ELISA for PRV antibodies was established with the purified recombination protein as the coating antigen and HRP-conjugated rabbit anti-porcine IgG as the secondary antibody. The optimal reaction condition was that the antigen was coated with concentration of 36 μg/ml under 37 ℃ for 1 hour and then under 4℃ overnight；the samples were 1:50 diluted and incubated under 37 ℃ for 1 hour，the secondary antibody was 1:3 000 diluted and incubated under 37 ℃for 1 hour. All tests of the method indicated that ithad a good repeatability，specificity and sensitivity. 92 porcine serums were tested by the gE-ELISA and IDEXX gEELISA，which showed the new method had a specificity of 85.71%，sensitivity of 90.63% and coincidence of 89.3%.This study provided technical support for PRV differentiation test in our country.

Key words：Pseudorabies virus；gE gene；prokaryotic expression；indirect-ELISA；discrimination

豬偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（PRV）感染豬引起的一種急性傳染病，可導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙（流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱仔），公豬不育，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉并大量死亡，育肥豬則表現(xiàn)呼吸困難、生長停滯等[1]。豬是該病毒的天然宿主和貯存者[2]。目前，除美國及歐洲部分國家宣布消滅此病外，該病仍呈世界性流行，且危害嚴(yán)重[3]。2011年以來，我國許多省份的豬場(chǎng)陸續(xù)出現(xiàn)仔豬“腹瀉”并大量死亡。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、采樣檢測(cè)、病原分離鑒定等，確認(rèn)PRV是引起該波疫情的主要病原之一[4-5]。

PRV基因?yàn)殡p股線狀DNA，全長約150 kb，編碼70～100種病毒蛋白[6]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PRV至少有11種糖蛋白。gE糖蛋白是PRV的主要毒力因子之一。gE基因的缺失不但可以使PRV毒力減弱，而且還能區(qū)分疫苗株和野毒株，因此可作為PRV的主要診斷抗原[7-8]。本研究在新分離的流行毒株基礎(chǔ)上進(jìn)行了gE糖蛋白主要抗原區(qū)域的基因擴(kuò)增，采用成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了體外表達(dá)，獲得了具有中和活性的蛋白，并進(jìn)行了間接ELISA抗體檢測(cè)方法的研究，以期為該病的鑒別檢測(cè)，乃至控制凈化提供技術(shù)和物質(zhì)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病毒、細(xì)胞系。PRV SD株由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心分離、鑒定并保存；BHK-21細(xì)胞由本室提供，按常規(guī)方法培養(yǎng)，外源檢測(cè)純凈。

1.1.2參考血清及待檢血清樣品。豬口蹄疫陽性血清、豬瘟陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型陽性血清、豬細(xì)小病毒陽性血清、豬乙型腦炎陽性血清、20份PRV gE陰性血清（經(jīng)IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)）、8份PRV gE陽性血清（經(jīng)IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)）、92份PRV待檢血清樣品，均由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心提供；PRV gE陽性血清、gE陰性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4表達(dá)引物。依據(jù)PRV SD株的gE基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)表達(dá)引物。其包含gE的5個(gè)主要抗原表位編碼區(qū)，上下游引物序列為：ATGGATCCGAGGTCTGGGACCTCT（下劃線表示BamHI酶切位點(diǎn)）；ACCTCGAGCATCAGGTCGAACGTG（下劃線表示XholI酶切位點(diǎn)）。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為618 bp。

1.1.3主要試劑。PMD18-T載體、T4 DNA連接酶、EX Taq HS、2×GC Buffer I、DL2000 Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、低分子量蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoL I，均購自TaKaRa；pET-32a（+）載體、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞以及表達(dá)蛋白純化試劑盒，均購自Novagen；DNAzol Regent，購自Intrivigen 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬二抗，購自Promega 公司；DNA膠回收試劑盒，購自天根生化公司；TMB、IPTG（異丙基-β-D硫代半乳糖苷），購自Sigma；BSA、酶標(biāo)板，購自上海生工；商品化gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1PRV SD株gE主要抗原區(qū)域的擴(kuò)增

1.2.1.1病毒增殖及總DNA提取。將病毒接種于長滿BHK-21細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，待80%細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變時(shí)，回收全部培養(yǎng)物，按照 DNAzol操作說明提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2目的基因擴(kuò)增、回收、克隆及鑒定。50 μL PCR 擴(kuò)增體系，包括 2×GC Buffer 25 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各 1 μL、PRV SD模板 5 μL、EX Taq HS 1 μL，最后用滅菌水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行95 ℃變性50 s、64 ℃退火50 s、72 ℃延伸1 min的循環(huán)擴(kuò)增，共32個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物20 μL，將其經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用柱式DNA膠回收試劑盒回收目的片段；將純化的基因片段連接到PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板。挑選白斑，接種于LB液體（Amp+）培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃過夜）；取菌液，提取質(zhì)粒并鑒定，篩選陽性質(zhì)粒。

1.2.2PRV SD株gE主要抗原區(qū)域的表達(dá)及純化

1.2.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建。按常規(guī)方法取PMD18-T質(zhì)粒與pET-32a（+）用BamHⅠ和XhoL I雙酶切陽性質(zhì)粒，回收618 bp的目的片段，將其與經(jīng)BamHⅠ和XhoL I雙酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB（Amp+）平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定后，篩選出含目的片段的重組質(zhì)粒并命名為pET-gE，并交上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.2.2誘導(dǎo)表達(dá)。將pET-gE、pET-32a菌液分別以1:1 000的體積比接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6；用0.025 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別于1 h、2 h、3 h、4 h和5 h取樣，離心收集菌體，重懸于1/10體積的1×binding buffer，冰?。挥贸暡ㄌ幚碇寥芤撼吻?，1 0000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.2.3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳及Western blotting分析。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后收集上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌體、空載體；經(jīng)PBS洗滌后，加入2×SDS裂解緩沖液，煮沸5 min；按常規(guī)方法用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印NC膜，然后進(jìn)行Western-blot免疫印跡檢測(cè)。將一半NC膜用于麗春紅染色，另一半NC膜經(jīng)TBST洗脫后轉(zhuǎn)移至BSA中封閉。洗膜后加入1:50稀釋的PRV陽性血清，室溫下振蕩1.5～2 h；洗滌后加入1:20 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG，室溫振蕩1.5～2 h后，置于DAB底物顯色液中顯色，待條帶清晰后迅速用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。

1.2.2.4表達(dá)蛋白的純化。取陽性菌株按1.2.2.3中的方法進(jìn)行4 h誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，重懸于1/10體積的1×binding buffer，冰浴；用超聲波處理至溶液澄清，用1×binding buffer洗2次，將其溶于含6 mol/L尿素的1×binding buffer中，4 ℃攪拌過夜，16 000 r/min離心30 min；取上清液，經(jīng)0.45 μmol濾膜過濾后，上His親和層析柱純化。收集純化后的蛋白取適量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，對(duì)其余表達(dá)產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5表達(dá)蛋白含量測(cè)定。將純化抗原1:1稀釋后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在280 nm和260 nm下的光吸收值，計(jì)算抗原蛋白含量。

1.2.3間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1gE蛋白抗原最佳包被濃度和抗體最佳稀釋度的確定。采用方陣試驗(yàn)，取96孔ELISA板，將純化的gE重組蛋白用本公司自制的包被液自上而下依次做1:10、1:20、1:40、1:80、1:100、1:200稀釋，每孔100 μL，4℃過夜后，取出用PBST洗滌3次，每次5 min。在每孔用1% BSA 200 μL，4 ℃封閉過夜，洗滌。將陰、陽性血清按1:10、1:50、1:100、1:200稀釋從左向右加入（陰陽性血清按同樣的稀釋倍數(shù)稀釋且間隔加入），每孔100 μL，37 ℃放置15 min，取出后洗滌。接著每孔加入100 μL稀釋至工作液濃度的兔抗豬酶標(biāo)二抗，37 ℃作用10 min，隨后洗滌；繼而每孔加入100 μL TMB，37 ℃顯5 min，最后加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值；根據(jù)OD值確定抗原和血清的最佳稀釋濃度。

1.2.3.2gE-ELISA反應(yīng)程序的優(yōu)化。按照1.2.3.1中確定的抗原包被濃度和血清稀釋度，分別改變抗原包被時(shí)間、封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間以及底物顯色時(shí)間，選擇最佳反應(yīng)條件。

1.2.3.3gE-ELISA方法陰陽性臨界值的確定。按照以上ELISA方法，用純化抗原進(jìn)行包被，封閉后分別加入20份經(jīng)IDEXX gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陰性的豬血清（加入血清前應(yīng)先用大腸桿菌培養(yǎng)上清吸附血清中抗大腸桿菌抗體，下同）。對(duì)每份血清設(shè)兩次重復(fù)，計(jì)算其OD平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。陰陽性臨界值＝陰性樣本OD平均值＋3×標(biāo)準(zhǔn)方差。

1.2.3.4gE-ELISA的交叉試驗(yàn)。用建立的gE間接ELISA分別檢測(cè)豬口蹄疫陽性血清、豬瘟陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型陽性血清、豬細(xì)小病毒陽性血清、豬乙型腦炎陽性血清，以驗(yàn)證其特異性。

1.2.3.5gE-ELISA重復(fù)性試驗(yàn)。選取8份不同OD值的PRV gE陽性血清樣品，用建立的gEELISA進(jìn)行5次批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，再分別用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板來驗(yàn)證批間重復(fù)性。

1.2.4gE-ELISA的應(yīng)用及與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒的比較。將92份臨床豬血清樣品，分別用建立的gE-ELISA和IDEXX公司的同類試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)，計(jì)算該間接ELISA與國外同類試劑盒的敏感性、特異性及二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 目的基因片段的擴(kuò)增與克隆

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見到大小約618 bp的片段。其與預(yù)期目的基因片段的大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒PET-gE的鑒定

回收目的片段，將其與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌增殖后提取重組質(zhì)粒；經(jīng)BamHⅠ、XhoL I雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的pET-32a表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化、增殖，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒PET-gE構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)PET-gE在32 ℃、0.025 mmol/L、IPTG條件下分別進(jìn)行1、2、3、4、5、6 h的誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，上清中均有42 ku左右的目的蛋白表達(dá)（圖3）。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 檢測(cè)

2.4 Western-blott分析結(jié)果

用PRV gE陽性血清對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行Western-blot 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在42 ku處出現(xiàn)1條清晰的特異性反應(yīng)條帶。該結(jié)果表明重組蛋白可以被PRV gE陽性血清識(shí)別（具有免疫學(xué)活性）（圖4）。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物純化及SDS-PAGE電泳結(jié)果分析

采用His親和層析柱對(duì)表達(dá)重組蛋白進(jìn)行純化。在SDS-PAGE電泳結(jié)果中可以清晰地看出：在分子質(zhì)量約42 ku處有明顯的目的蛋白條帶；表達(dá)產(chǎn)物主要以水溶形式表達(dá)；經(jīng)過洗脫收集的蛋白純度較高（圖5）。

圖4 表達(dá)重組蛋白的麗春紅染色和Western -bloting 檢測(cè)

圖5 表達(dá)產(chǎn)物純化SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果

2.6 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

2.6.1蛋白濃度測(cè)定結(jié)果。用分光光度計(jì)測(cè)定，并根據(jù)公式計(jì)算表達(dá)蛋白的濃度。蛋白質(zhì)濃度=（1.45/A280-0.75/A260）×2=1.44 mg/mL。

2.6.2抗原與血清最佳稀釋度的確定。由方正試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)血清和抗原的稀釋倍數(shù)較低時(shí)，他們的OD450值都維持在較高水平，隨著稀釋度加大，開始產(chǎn)生明顯的梯度變化。根據(jù)陽性血清、陰性值等方面的因素，初步認(rèn)為抗原1:40倍稀釋，血清1:50倍稀釋比較合適，在此基礎(chǔ)上測(cè)定抗原最佳包被濃度為36 μg/mL（表1）。

表1 抗原和血清最佳稀釋度的方正試驗(yàn)結(jié)果

2.6.3判定標(biāo)準(zhǔn)的確定。取20份經(jīng)IDEXX gEELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陰性的血清，按1:50稀釋后進(jìn)行間接ELISA，測(cè)定OD450值（表2）。以20份血清平均OD450值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陰陽性的判定臨界值。經(jīng)測(cè)定，20份gE抗體陰性血清的OD450平均值為0.244，標(biāo)準(zhǔn)差為0.036，則判定標(biāo)準(zhǔn)為0.244+3×0.036=0.352≈0.35。即當(dāng)樣品的OD450值≥0.35時(shí)，判為陽性，OD450值＜0.35時(shí)，判為陰性。

表2 20份陰性血清的OD450值

2.6.4gE-ELISA檢測(cè)程序。優(yōu)化過反應(yīng)條件后建立的gE間接ELISA檢測(cè)程序如下：以包被緩沖液（pH7.0）稀釋抗原至36 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃過夜，PBST洗板3次，每次5 min。每孔加入200 μL封閉液，4 ℃過夜，洗板。稀釋液將待檢血清按1:50稀釋后100 μL/孔，37 ℃作用15 min；每孔加入100 μL的兔抗豬酶標(biāo)二抗，37 ℃作用10 min，洗板；每孔加入自配TMB 100 μL進(jìn)行顯色（避光），5 min后用終止液終止反應(yīng)，并立即在酶標(biāo)儀上讀出OD450值。ELISA 陰陽性臨界值=陰性血清OD450平均值+3SD=0.35。所以樣本OD450值≥0.35時(shí)，判定為陽性；OD450值＜0.35時(shí)，判定為陰性。

2.6.5交叉試驗(yàn)。應(yīng)用gE-ELISA方法，按照2.6.4中的操作步驟，對(duì)豬口蹄疫、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎陽性血清用gE-ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，這些參考陽性血清的OD450值都小于0.35，均為gE抗體陰性。結(jié)果說明本研究所建立ELISA方法具有良好的特異性。

2.6.6重復(fù)性試驗(yàn)。選取8份不同的PRV gE陽性血清樣品，用建立的gE間接ELISA進(jìn)行5次批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果顯示不同血清樣品的變異系數(shù)不超過10%（表3）。將同樣的8份血清分別用3個(gè)批次的gE蛋白包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果一致。該結(jié)果表明本方法具有較好的重復(fù)性。

表3 gE-ELISA的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

2.6.7gE間接ELISA的與IDEXX gE-ELISA試劑盒的平行檢測(cè)結(jié)果。將92份血清樣品分別用建立的gE間接ELISA與IDEXX gE-ELISA試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：IDEXX gE-ELISA試劑盒檢測(cè)出gE抗體陽性血清樣品64份，本研究建立的gE-ELISA檢出陽性62份；IDEXX gE-ELISA 試劑盒檢測(cè)28份陰性樣品，本方法均檢出30份陰性（表4）。平行檢測(cè)的92份血清樣品中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的有82份。與IDEXX gE-ELISA產(chǎn)品相比，gE間接ELISA的敏感性和特異性分別為90.63%和85.71%，二者符合率為89.13%。

表4 gE-ELISA與IDEXX gE ELISA的結(jié)果比較

3 討論

2011年以來，一種能導(dǎo)致新生仔豬腹瀉，伴有神經(jīng)癥狀的新型PRV病毒在我國多數(shù)養(yǎng)豬地區(qū)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[9]。為此，各級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、科研院校的獸醫(yī)科技工作者開展了流行病學(xué)調(diào)查、診斷技術(shù)、病原學(xué)、血清學(xué)、免疫學(xué)以及防控技術(shù)等方面的研究工作。本研究的出發(fā)點(diǎn)是，為基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室、養(yǎng)殖企業(yè)提供一種針對(duì)當(dāng)前流行毒株、能否有效區(qū)分PRV gE基因缺失疫苗免疫豬與野毒感染豬的快速血清學(xué)鑒別檢測(cè)ELISA試劑盒。

研究證實(shí)，PRV gE蛋白的主要抗原表位主要集中在52～238位氨基酸[10]。應(yīng)用DNAstar軟件包中的Protean子軟件，對(duì)PRV SD株的gE基因主要抗原區(qū)域進(jìn)行分析。為了保持其抗原性，減少非特異性，本研究選取編碼PRV SD株gE蛋白主要抗原表位的618 bp基因片段進(jìn)行克隆，與pET32 a+表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其在大腸桿菌BL21中得到高效表達(dá)。經(jīng)Western-blot印記分析、間接ELISA檢測(cè)，證實(shí)該表達(dá)產(chǎn)物能與PRV gE陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，可作為PRV gE抗體的檢測(cè)抗原。樊淑華[11]、吳博[12]的研究結(jié)果表明，截短的PRV gE基因在大腸埃希氏菌中成功表達(dá)后，其蛋白主要以包涵體形式存在。眾所周知，對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性、純化的操作步驟多、耗時(shí)，回收蛋白損失較多、成本高，難以保持其生物學(xué)活性。本研究采用32 ℃低溫培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)了gE基因在0.025 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的可溶、高效表達(dá)，為gE蛋白純化提供了方便。

由于SPF豬的PRV陽性抗體難以獲得，本試驗(yàn)運(yùn)用IDEXX gE-ELISA試劑盒檢測(cè)陽性血清作為陽性血清，經(jīng)IDEXX檢測(cè)陰性血清作為陰性血清，建立間接ELISA方法。臨床上ELISA非特異反應(yīng)的強(qiáng)弱是建立ELISA診斷方法成功與否的關(guān)鍵。由于采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，其宿主菌為大腸桿菌，這勢(shì)必會(huì)提高陰性值，不利于臨界值的確立。本研究運(yùn)用中和方法，在加一抗前用大腸桿菌對(duì)待檢血清進(jìn)行中和，明顯降低了ELISA的陰性值，為間接ELISA方法的建立提供了保證。在試驗(yàn)中，gE重組蛋白與其它豬源病毒抗體無交叉反應(yīng)，說明其具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)。同IDEXX gE-ELISA診斷試劑進(jìn)行比較，IDEXX gE-ELISA試劑盒檢測(cè)出gE抗體陽性血清樣品64份，本研究所建立gE-ELISA檢測(cè)出陽性62份。IDEXX gE-ELISA 試劑盒檢出28份陰性樣品，本方法檢出30份陰性。平行檢測(cè)的92份血清樣品中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的有82份。與IDEXX gE-ELISA產(chǎn)品相比，gE間接ELISA的敏感性和特異性分別為90.63%和85.71%，二者的符合率為89.13%。

隨著我國生豬養(yǎng)殖業(yè)模式的不斷發(fā)展變化，大型養(yǎng)豬場(chǎng)尤其是大型種豬場(chǎng)，應(yīng)樹立防重于治的防疫理念，需要經(jīng)常對(duì)嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益的重點(diǎn)疫病進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如PR，必須堅(jiān)決剔除gE抗體陽性豬，以確保豬群健康。本研究建立的gE-ELISA檢測(cè)方法為各養(yǎng)殖企業(yè)提供了一個(gè)可以區(qū)分PRV自然感染和PRV gE基因缺失疫苗免疫的特異性檢測(cè)方法，能夠滿足日常監(jiān)測(cè)之需。雖然市場(chǎng)上有IDEXX等企業(yè)生產(chǎn)的同類試劑盒，但價(jià)格昂貴、購買周期長。本研究力求運(yùn)用所在企業(yè)成熟的下游技術(shù)，開發(fā)出自主ELISA試劑盒，以滿足市場(chǎng)需要。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Prokaryotic Expression on Major Epitope Domain of gE for PRV SD and Establishment of Indirect ELISA for PRV gE Antibody

Zheng Hui1，Zhang Qing1，Zou Min1，Dong Yaqin2，Liu Shaung2，F(xiàn)an Gencheng1，Wu Faxing2，Li Xiaocheng2
（1. Qingdao Yebio BioEngineering Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266114；2. China Animal Health and Epizootiology Centre，Qingdao，Shandong 266032）

S851.3

A

1005-944X（2017）10-0083-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.023

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1200500）

并列第一作者：鄭 輝、張 青、鄒 敏

吳發(fā)興、李曉成