不同人乳腺癌細胞系中程序性死亡-配體1的表達*

汪新茹，李朵璐，楊 盟，姜東寶，張雅迪，闞全程#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科 鄭州 450052

不同人乳腺癌細胞系中程序性死亡-配體1的表達*

汪新茹1)，李朵璐1)，楊 盟1)，姜東寶2)，張雅迪1)，闞全程1)#

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科 鄭州 450052

程序性死亡-配體1；乳腺癌

目的：探討程序性死亡-配體1(PD-L1)在不同人乳腺癌細胞系中的表達情況。方法采用Western blot法和實時熒光定量PCR法檢測PD-L1蛋白及mRNA在人乳腺細胞株HBL-100及4種乳腺癌細胞株MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、MDA-MB-468中的表達情況。結果與人乳腺細胞HBL-100相比，PD-L1在MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-7/ADR中均呈較高水平的表達(P<0.05)，在MDA-MB-231中表達水平最高(P<0.001)。結論PD-L1主要表達于人乳腺癌細胞中。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前,乳腺癌已經成為我國女性發(fā)病位居首位的惡性腫瘤[2]。國外研究[3]表明程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)在正常乳腺組織中幾乎不表達，主要表達于乳腺癌組織中。大多數文獻報道中使用免疫組化方法研究乳腺癌組織中PD-L1的表達情況，對乳腺癌細胞中PD-L1表達的研究甚少。該研究采用Western blot技術和實時熒光定量PCR技術觀察不同人乳腺癌細胞中PD-L1的表達情況，以進一步研究PD-L1在乳腺癌中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器DMEM高糖雙抗培養(yǎng)基、RPMI 1640雙抗培養(yǎng)基購自索萊寶公司，胎牛血清(FBS)購自美國Clark公司，胰蛋白酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術有限公司。Tripure Reagent、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自美國Roche公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，引物合成交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。兔抗人PD-L1多克隆抗體及兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，IRDye 800CW山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗購自美國LI-COR公司，BCA蛋白定量試劑盒、WB一抗及二抗稀釋液購自武漢博士德生物工程有限公司，NuPAGE?MOPS SDS Running Buffer(20×)、NuPAGE?Transfer Buffer(20×)、WesternBreeze?Blocker/Diluent(Part A and B)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；BioTraceTMNT Pure Nitrocellulose Blotting Membrane(NC膜)購自美國Pall Life Sciences公司。超凈工作臺購自珠海市再鑫儀器有限公司，StepOnePlusTMReal-Time PCR System購自美國Applied BiosystemsTM，CO2培養(yǎng)箱、電泳儀XCell SureLock?Mini-Cell CE mark、微量分光光度計NanoDrop 2000、高速冷凍離心機Heraeus Fresco 17購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。

1.2細胞培養(yǎng)人乳腺細胞株HBL-100及乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468由鄭州大學第一附屬醫(yī)院臨床藥學(免疫)重點實驗室提供；乳腺癌細胞株MCF-7/ADR購自賽百慷(上海)生物技術有限公司。HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468在含體積分數10% FBS、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM高糖雙抗培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。MCF-7/ADR在含體積分數20% FBS、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640雙抗培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當大部分細胞貼壁后更換含1 μmol/L阿霉素的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，取對數生長期的MCF-7/ADR用于后續(xù)實驗。

1.3各細胞PD-L1mRNA的實時熒光定量PCR檢測提取各細胞樣品RNA，檢測濃度與純度后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA通過反轉錄得到cDNA。在StepOnePlusTMReal-Time PCR System上進行PCR反應。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

反應體系:10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX), 10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，1 μL cDNA，滅菌用ddH2O 7.4 μL。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析PD-L1 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.4各細胞PD-L1蛋白的Westernblot檢測取匯合率達80%左右的細胞，提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白，總體積20 μL上樣，利用SDS-PAGE預制膠110 V電泳100 min分離目的蛋白，轉移至NC膜上。剪下目的條帶，用Blocker/Diluent A和B室溫封閉1 h。加入兔抗人PD-L1多克隆抗體(按11 000稀釋)及兔抗人GAPDH單克隆抗體(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。第2天，TBST洗3遍，每次5 min。加入熒光二抗IRDye 800CW山羊抗兔IgG(H+L)(按15 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST洗3遍，每次5 min，最后用ddH2O漂洗蛋白膜后，置Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中掃描，利用Image Studio Version 2.0.38軟件對圖像進行灰度分析。以PD-L1與GAPDH條帶灰度值的比值作為PD-L1蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.5統(tǒng)計學處理使用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較5種細胞中PD-L1 mRNA和蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

各細胞PD-L1 mRNA和蛋白的表達情況見圖1、表2。與人乳腺細胞HBL-100相比，PD-L1在MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-7/ADR中均呈現較高水平的表達，且MDA-MB-231中表達最高。

1:HBL-100；2:MCF-7；3:MCF-7/ADR；4:MDA-MB-231；5:MDA-MB-468。 圖1 5種細胞Western blot實驗結果

細胞nmRNA蛋白HBL-10031.010±0.1770.0019±0.0010MCF-730.349±0.0800.0007±0.0005MCF-7/ADR312.828±3.709*0.0093±0.0046*MDA-MB-468315.135±0.821*0.0070±0.0067MDA-MB-231321.823±6.032*0.0167±0.0064*F(P)25.650(<0.001)9.019(0.002)

*:與HBL-100相比，P<0.05。

3 討論

目前，治療乳腺癌主要是采用包括手術治療、化學治療、放射治療、內分泌治療、生物治療、中醫(yī)中藥治療在內的綜合治療方式[1，4-5]。分子免疫治療是一種具有臨床應用前景的新型治療途徑，可以利用機體自身免疫系統(tǒng)識別和摧毀腫瘤細胞，防止乳腺癌的復發(fā)和病灶的轉移[6]。現在使用腫瘤靶向單克隆抗體的被動免疫治療已經獲得廣泛的治療效果[7]，但是T細胞定向的主動免疫治療卻收效甚微[8]。PD-L1是PD-1的主要配體[9]，高表達于多種造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)腫瘤細胞表面，包括黑色素瘤、膠質瘤、肺癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌等[10-11]，可作為分子免疫治療的新靶點，誘導阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以抑制T細胞的免疫活性并且限制腫瘤細胞死亡[12]。

Soliman等[13]將不同乳腺癌細胞系分為管腔型和基底型進行相關研究，結果表明基底型乳腺癌細胞(包括BT-20、HCC1143、MDA-MB-231及HCC38)持續(xù)高表達PD-L1，其中基底B型乳腺癌細胞(MDA-MB-231及HCC38)PD-L1表達量最高。CCLE數據庫亦顯示PD-L1 mRNA在基底型細胞如MDA-MB-231、MDA-MB-468中的表達水平高于非基底型細胞如MCF-7[13]。該研究結果顯示PD-L1在MCF-7/ADR、MDA-MB-468及MDA-MB-231細胞中的表達水平升高，尤其是在MDA-MB-231細胞中，但在MCF-7中表達水平較低，與上述研究結果相一致，但并沒有文獻報道過PD-L1在MCF-7/ADR細胞也有較高水平的表達。這為今后進一步研究PD-L1在不同乳腺癌組織中表達情況及其與乳腺癌患者預后關系奠定了一定的實驗基礎。

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(2016-11-15收稿 責任編輯徐春燕)

Expression of programmed death-ligand 1 in different human breast cancer cell lines

WANGXinru1),LIDuolu1),YANGMeng1),JIANGDongbao2),ZHANGYadi1),KANQuancheng1)

1)DepartmentofClinicalPharmacology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGastrointestinalSurgery,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

programmed death-ligand 1;breast cancer

Aim: To investigate the expression of programmed death-ligand 1(PD-L1) in different human breast cancer cell lines. Methods: Using Western blot and fluorescence quantitative PCR, we detected the protein and mRNA expressions of PD-L1 in human breast epithelium cell line HBL-100 and the other 4 human breast cancer cell lines including MCF-7, MCF-7/ADR, MDA-MB-231, and MDA-MB-468.Results: Compared with HBL-100, PD-L1 had higher expression in MDA-MB-231, MDA-MB-468 and MCF-7/ADR cells(P<0.05), especially in MDA-MB-231 cells(P<0.001).Conclusion: PD-L1 is mainly expressed in breast cancer cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.021

*河南省高等學校重點科研項目 16A350003

R967

#通信作者，男，1963年9月生，博士，主任藥師,教授，研究方向：臨床藥學免疫，E-mail：qckan19632012@163.com