急性淋巴細胞白血病患兒亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T多態(tài)性與甲氨蝶呤毒性相關性的Meta分析

朱 忱，王曉玲，李曉玲

急性淋巴細胞白血病患兒亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T多態(tài)性與甲氨蝶呤毒性相關性的Meta分析

朱 忱1，2，王曉玲3，李曉玲2*

目的探討急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒中亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因 C677T 位點的多態(tài)性與甲氨蝶呤(MTX)毒副反應的相關性。方法通過檢索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Embase等數(shù)據(jù)庫，收集建庫至2016年8月1日關于ALL患兒MTHFR C677T位點的多態(tài)性與MTX毒副反應的觀察性隊列研究，并提取基因型、MTX毒性相關資料進行方法學質量評價，采用RevMan 5.3軟件進行Meta分析。結果共納入9篇文獻進行 Meta分析，結果顯示，MTHFR C677T多態(tài)性與肝毒性(如：CC vs. CT/TT，RR：0.81，95%CI：0.65～1.00，P=0.05)、血液毒性、黏膜毒性均不存在顯著相關性。但單個研究顯示，非洲人群在肝毒性、血液毒性、黏膜毒性(如：CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9)方面，677C 等位基因相對于其他人種而言具有較明顯的保護作用。結論在ALL患兒中，MTHFR C677T不是一個好的預測MTX毒性的指標，兩者的關系尚需要大樣本量、高質量的研究來進一步驗證。

兒童；急性淋巴細胞白血?。粊喖谆臍淙~酸還原酶；C677T；多態(tài)性；甲氨蝶呤；毒性

0 引言

急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見的一種惡性腫瘤，在兒童惡性腫瘤中約占30%[1]。甲氨蝶呤(MTX)是治療兒童ALL化療方案中重要的組成成分，在臨床治療上取得了很好的效果，但是MTX治療過程中所產生的相關毒性反應成為臨床的一個巨大的挑戰(zhàn)[2]，包括黏膜毒性、肝毒性、血液毒性、神經毒性等。因此，尋找一個能預測MTX毒性的指標尤為重要[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在MTX代謝通路中，葉酸代謝調節(jié)基因的多態(tài)性會對MTX的藥代動力學產生影響[4]，從而影響其療效及不良反應。而其中的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)則由于其在細胞內葉酸穩(wěn)態(tài)及代謝方面的重要性[5]，成為許多藥物基因組學研究的焦點。MTHFR基因的2個常見多態(tài)是C677T (rs1801133) 和A1298C (rs1801131)[6]，國內外學者對MTHFR C677T位點的多態(tài)性與MTX的毒副反應關系的研究較多，但結論存在爭議[7-8]。本文就這一存在爭論的問題，收集國內外近十年來報道的相關文獻，納入所有人種，進行Meta分析，探討ALL患兒中MTHFR基因C677T位點的多態(tài)性與MTX毒副反應的相關性。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 以methotrexate、methylenetetrahydrofolate reductase、MTHFR、gene、polymorphism、hematological malignancy、acute lymphoblastic leukemia、ALL、pediatric、children等為關鍵詞，兩位研究者獨立檢索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Embase等數(shù)據(jù)庫。檢索時間：建庫至2016年8月1日，語言限制：英語，研究類型不限。手動檢索ClinicalTrials.gov及納入文獻的參考文獻。

1.2 研究納入標準 兩名研究者分別獨立評價文獻相關性，納入評價 MTHFR C677T 基因多態(tài)性與MTX毒副作用相關性的研究，限定人群為ALL患兒，種族不限。且提供充足的基因型對應毒性發(fā)生情況的二分類變量數(shù)據(jù)，從而可計算風險比(RR)及95%置信區(qū)間(95%CI)。當同一組樣本研究出現(xiàn)在多個文獻中，只選取最近發(fā)表的文獻。如對文獻納入出現(xiàn)分歧，兩位研究者通過協(xié)商達成一致。

1.3 數(shù)據(jù)提取 兩位研究者獨立從納入的文章中提取相關數(shù)據(jù)，包括：作者、發(fā)表時間、種族或國家、患者數(shù)量、疾病、年齡、性別、治療方案、MTX劑量、基因型、甲氨蝶呤毒副作用、是否符合遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)及毒副作用分級標準。若納入文獻中相關數(shù)據(jù)缺失，則通過電話或郵件的形式聯(lián)系其通訊作者獲取數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)提取過程中若出現(xiàn)意見分歧，則尋求第3名研究者幫助，并且意見達成一致。

1.4 質量評價 兩名研究者背對背獨立參照Newcastle-Ottawa Quality Assessment Scale (NOS)對納入文獻進行質量評價，意見不一致處可通過討論或第3名研究者介入評判，達成共識。

1.5 數(shù)據(jù)合并與分析 若納入文獻中有2篇或2篇以上文獻報道同一種毒性反應且沒有明顯異質性，則合并其數(shù)據(jù)并采用Cochrane協(xié)作網提供的RevMan 5.3軟件進行Meta分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用分層分析方法(Mantel-Haenszel方法)計算RR值及95%CI。用Q檢驗及I2評價異質性大小，當I2≥50%，表明有中度到重度的異質性，選擇隨機效應模型，反之選擇固定效應模型。用Z檢驗來計算RR值是否有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，采用顯性模型(CC vs. CT/CT)、隱形模型(CC/CT vs. TT)及純合子模型(CC vs.TT)分別計算RR值。本次Meta分析主要關注基因型與非血液毒性(肝毒性和黏膜毒性)及血液毒性之間的聯(lián)系。若數(shù)據(jù)合并后存在異質性，即按人種(高加索人、亞洲人和非洲人)進行亞組分析，并通過剔除NOS評分較低的研究對結果進行敏感性分析，檢驗結果的穩(wěn)定性。最后，使用Stata 12.0進行Egger檢驗，觀察其是否存在發(fā)表偏移。

2 結果

2.1 納入文獻特點 文獻篩選流程圖見圖1。按上述檢索方法共檢索到1 082篇文獻，排除520篇重復文獻，之后閱讀標題和摘要，最終篩選出125篇文獻并查找全文，通讀文獻后評價其是否符合納入標準。最終排除116篇，包括：26篇會議摘要(無法獲取全文)；4篇給編輯的信；34篇樣本人群為成人和兒童；23篇基因型對應毒性數(shù)據(jù)不全；25篇數(shù)據(jù)為連續(xù)變量形式；4篇研究數(shù)據(jù)重復。最后，共有9篇文獻符合標準，納入本次Meta分析，見表1。在這9個研究中，MTX劑量范圍為 2～5 g/m2。人種涉及高加索人(5篇)、亞洲人(1篇)、非洲人(1篇)及混合人種(2篇)。

圖1 MTHFR C677T 多態(tài)性與ALL患兒甲氨蝶呤毒性相關性的Meta分析文獻納入流程圖

2.2 文獻質量 9篇文獻均為觀察性的隊列研究。其中6分1篇，7分5篇，8分1篇，9分2篇。見表1。

2.3 在ALL患兒中MTHFR C677T 基因多態(tài)性與甲氨蝶呤相關毒性的關系 對不同毒性分別按顯性模型、隱性模型及純合子模型進行分析。見表2。

表1 納入9篇MTHFR C677T多態(tài)性與ALL患兒的甲氨蝶呤毒性相關性文獻的研究特征

注：—為文中未提及，√為文中提及；MTX：甲氨蝶呤；ADR：不良反應；NCI-CTCAE：美國國家癌癥研究所不良事件分級標準；NOS：Newcastle-Ottawa Quality Assessment Scale

表2 納入9篇MTHFR C677T多態(tài)性與ALL患兒的甲氨蝶呤毒性相關性文獻的合并分析結果

注：#存在較大異質性，進行異質性來源分析；*P<0.05

如表2所示，共有4個研究(總樣本量為833例)提到肝毒性(≥2級)，合并后未發(fā)現(xiàn)與 MTHFR C677T 基因的顯著關系(如：CC vs. CT/TT，RR：0.81，95%CI：0.65～1.00，P=0.05)。見圖2。在隱性模型和純合子模型中發(fā)現(xiàn)了較大異質性(CC/CT vs. TT，I2=84%；CC vs. TT，I2=74%)，按人種分為亞洲人、非洲人和混合人種，分別進行分析，發(fā)現(xiàn)僅在非洲人群的研究中，MTHFR C677T與肝毒性存在顯著關聯(lián)性(CC/CT vs. TT，RR：0.05，95%CI：0.01～0.33，P=0.002；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.58，P=0.01)。

共有8個研究涉及血液毒性，根據(jù)各研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計特點，可劃分為1～4級和3～4級。然而，合并后沒有發(fā)現(xiàn)與C677T基因的相關性(圖2)。另外，3～4級血液毒性合并后，存在較大異質性(CC vs. CT/TT，I2=80%；CC/CT vs. TT，I2=83%；CC vs. TT，I2=78%)?？紤]到種族的差異及納入研究數(shù)量有限，將顯性模型組按種族進行亞組分析，單純對高加索人進行合并，但異質性仍然存在(I2=84%)。在隱性模型和純合子模型中，按人種分別對各研究進行分析，發(fā)現(xiàn) 677C 等位基因在非洲人群中有保護作用(CC/CT vs. TT，RR：0.30，95%CI：0.13～0.71，P=0.006；CC vs. TT，RR：0.22，95%CI：0.06～0.84，P=0.03)，而在高加索人群中卻增加血液毒性發(fā)生風險(CC/CT vs. TT，RR：2.69，95%CI：1.04～6.96，P=0.04；CC vs. TT，RR：2.83，95%CI：1.05～7.65，P=0.04)。

針對黏膜毒性，將其分為1～4級和≥3級進行統(tǒng)計分析，結果顯示，1～4級黏膜毒性在各模型中均不存在顯著關聯(lián)性(圖2)，而≥3級的黏膜毒性只有1項研究報道，但該研究顯示 677C 等位基因在非洲人群中具有黏膜保護作用(CC vs. CT/TT，RR：0.15，95%CI：0.02～1.01，P=0.05；CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.63，P=0.01)。

2.4 異質性和敏感性分析 在本次Meta分析中，一些毒性數(shù)據(jù)合并存在異質性，因此，選擇隨機效應模型并進行亞組分析，尋找異質性來源。在按人種進行亞組分析后，有的異質性仍然存在，這種異質性可能是由于MTX劑量、毒性分級標準、樣本量等因素造成的。同時，我們對I2≥50%的合并結果進行敏感性分析。根據(jù)NOS評分結果，剔除得分較低的研究后，所有結果均沒有明顯改變，表明此次Meta分析結果是穩(wěn)定的。

2.5 發(fā)表偏倚 利用Egger檢驗定量評價納入的描述ALL患兒MTHFR C677T多態(tài)性與發(fā)生肝毒性風險相關性的文獻是否存在發(fā)表偏倚，結果表明，納入的研究不存在發(fā)表偏倚(P=0.654)。

3 討論

MTX是一種拮抗葉酸代謝的化療藥物，已經被廣泛用于兒童ALL的治療。盡管已經有許多學者對MTHFR C677T多態(tài)性與MTX毒性相關性進行了分析，但仍然沒有明確的結論，尤其是在兒童人群中。由于針對兒童患者的單個研究設計不同且缺乏說服力，所以筆者進行Meta分析，旨在為使用MTX治療的ALL患兒提供一個全面、可靠的MTHFR C677T多態(tài)性與毒性相關性的結論。

圖2 顯性模型(CC vs. CT/TT)下肝毒性(≥G2)、黏膜毒性(G1-4)及血液毒性(G1-4)與MTHFR C677T多態(tài)性關系的森林圖

納入研究的數(shù)據(jù)合并結果顯示，MTHFR C677T基因多態(tài)性與MTX毒性沒有顯著相關性，這一結果與2013年Lopez-Lopez等[5]Meta分析結果相似，但2014年Hagleitner等[17]的Meta分析則顯示，MTHFR 677T基因突變可增加MTX引起肝毒性的風險。這可能是由于Lopez-Lopez的研究設計與本次設計大體相同，而Hagleitner納入了骨肉瘤患者，使得治療方案、MTX劑量、療程、合并用藥間的差異增大，最終導致結果不同。本次納入的單個研究表明，①在非洲人群中，MTHFR C677T基因多態(tài)性與黏膜毒性的增加相關[10](CC vs. CT/TT，RR：0.15，95%CI：0.02～1.01，P=0.05；CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.63，P=0.01)；且在隱性模型和純合子模型中，677C等位基因在肝毒性(≥2級)(CC/CT vs. TT，RR：0.05，95%CI：0.01～0.33，P=0.002；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.58，P=0.01)和血液毒性(3～4級)(CC/CT vs. TT，RR：0.30，95%CI：0.13～0.71，P=0.006；CC vs. TT，RR：0.22，95%CI：0.06～0.84，P=0.03)方面發(fā)揮了保護的作用，且較其他人種保護作用更明顯。②而高加索人群中[11]，677T突變基因在隱性模型和純合子模型中，在血液毒性(3～4級)方面存在保護作用。然而，由于本次Meta分析納入研究數(shù)量有限且樣本量較小，所以需要進一步的大樣本研究來驗證不同種族中MTHFR C677T基因多態(tài)性與MTX毒性的關系。

在ALL患兒的化療方案中，MTX的劑量主要采用大劑量(>1 g/m2，與成人有所不同)[18]。本次納入的研究MTX劑量為2、2.5、5 g/m2，由于劑量相似，且有關劑量對應毒性數(shù)據(jù)缺乏，所以無法進行亞組分析證明劑量對基因-毒性關系的影響。然而，Zhao等[2]在成人血液惡性腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T的突變對MTX毒性增加的風險是獨立于MTX劑量的。但是仍然缺少相關數(shù)據(jù)，需要更多新的研究來得到更可靠的結論。

在實際臨床實踐中，兒童對MTX的反應好于成人[2]。研究顯示，ALL患兒較成人有更好的療效，且5年無事件生存率接近80%，而成人只有40%[1,19]。因此，或許兒童MTHFR C677T的多態(tài)性與MTX毒性之間的關系較成人不明顯，這可能也是造成本次Meta分析無相關性的一個原因。

本次數(shù)據(jù)合并過程中存在異質性，且在顯性模型的血液毒性(3～4級)中，按人種進行亞組分析仍無法消除其異質性(I2=80%)，于是我們嘗試剔除NOS得分最低的研究，發(fā)現(xiàn)異質性顯著下降(I2=56%)，表明研究的不同質量也是異質性的來源之一。此外，為了使本次分析結果更為保守，對于存在異質性(I2≥50%)的組，我們選擇使用隨機效應模型。本次研究異質性來源還可能是MTX劑量、療程、毒性分級標準以及葉酸補充情況。

本研究存在的局限性：①納入研究的數(shù)量及樣本量較少；②納入的人種比例不均衡，高加索人占多數(shù)，亞洲人(140例)和非洲人(40例)占比較少，可能影響結果的準確性；③各研究中MTX治療方案不同，導致療程不同及合并用藥不同，這可能會影響MTX毒性的發(fā)生，從而影響基因多態(tài)性與毒性之間的關系；④不同研究采用不同的毒性分級標準，雖然各種標準大同小異，但是某些細節(jié)上的差異也會影響毒性分級的一致性，從而影響各級毒性的發(fā)生人數(shù)。因此，需要進一步的多中心、大樣本、信息詳實的研究來探討ALL患兒MTHFR C677T多態(tài)性與MTX毒性的關系。

4 結論

本次Meta分析表明，在ALL患兒中，MTHFR C677T不是一個好的預測MTX毒性的指標。但由于本次研究納入文獻較少，樣本量小，所以仍需要大樣本量、高質量的研究來進一步驗證。

[1] Johnston WT,Lightfoot TJ,Simpson J,et al.Childhood cancer survival:a report from the United Kingdom Childhood Cancer Study[J].Cancer Epidemiol,2010,34(6):659-666.

[2] Zhao M,Liang L,Ji L,et al.MTHFR gene polymorphisms and methotrexate toxicity in adult patients with hematological malignancies:a meta-analysis[J].Pharmacogenomics,2016,17(9):1005-1017.

[3] Imanishi H,Okamura N,Yagi M,et al.Genetic polymorphisms associated with adverse events and elimination of methotrexate in childhood acute lymphoblastic leukemia and malignant lymphoma[J].J Hum Genet,2007,52(2):166-171.

[4] Park JA,Shin HY.Influence of genetic polymorphisms in the folate pathway on toxicity after high-dose methotrexate treatment in pediatric osteosarcoma[J].Blood Res,2016,51(1):50-57.

[5] Lopez-Lopez E,Martin-Guerrero I,Ballesteros J,et al.A systematic review and meta-analysis of MTHFR polymorphisms in methotrexate toxicity prediction in pediatric acute lymphoblastic leukemia[J].Pharmacogenomics J,2013,13(6):498-506.

[6] Bellampalli R,Phani NM,Bhat KG,et al.Significance of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene variants in acute lymphoblastic leukemia in Indian population:an experimental,computational and meta-analysis[J].Leuk Lymphoma,2015,56(5):1450-1459.

[7] Ruiz-Argüelles GJ,Coconi-Linares LN,Garcés-Eisele J,et al.Methotrexate-induced mucositis in acute leukemia patients is not associated with the MTHFR 677T allele in Mexico[J].Hematology,2007,12(5):387-391.

[8] Liu SG,Li ZG,Cui L,et al.Effects of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms on toxicities during consolidation therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia in a Chinese population[J].Leuk Lymphoma,2011,52(6):1030-1040.

[9] Kishi S,Griener J,Cheng C,et al.Homocysteine,pharmacogenetics,and neurotoxicity in children with leukemia[J].J Clin Oncol,2003,21(16):3084-3091.

[10]Tantawy AA,El-Bostany EA,Adly AA,et al.Methylene tetrahydrofolate reductase gene polymorphism in Egyptian children with acute lymphoblastic leukemia[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2010,21(1):28-34.

[11]D′Angelo V,Ramaglia M,Iannotta A,et al.Methotrexate toxicity and efficacy during the consolidation phase in paediatric acute lymphoblastic leukaemia and MTHFR polymorphisms as pharmacogenetic determinants[J].Cancer Chemother Pharmacol,2011,68(5):1339-1346.

[12]Karathanasis NV,Stiakaki E,Goulielmos GN,et al.The role of the methylenetetrahydrofolate reductase 677 and 1298 polymorphisms in Cretan children with acute lymphoblastic leukemia[J].Genet Test Mol Biomarkers,2011,15(1-2):5-10.

[13]Sepe DM,McWilliams T,Chen J,et al.Germline genetic variation and treatment response on CCG-1891[J].Pediatr Blood Cancer,2012,58(5):695-700.

[14]Zgheib NK,Akra-Ismail M,Aridi C,et al.Genetic polymorphisms in candidate genes predict increased toxicity with methotrexate therapy in Lebanese children with acute lymphoblastic leukemia[J].Pharmacogenet Genomics,2014,24(8):387-396.

[15]Roy Moulik N,Kumar A,Agrawal S,et al.Role of folate status and methylenetetrahydrofolate reductase genotype on the toxicity and outcome of induction chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Lymphoma,2015,56(5):1379-1384.

[16]Aráoz HV,D′Aloi K,Foncuberta ME,et al.Pharmacogenetic studies in children with acute lymphoblastic leukemia in Argentina[J].Leuk Lymphoma,2015,56(5):1370-1378.

[17]Hagleitner MM,Coenen MJ,Aplenc R,et al.The role of the MTHFR 677C>T polymorphism in methotrexate-induced liver toxicity:a meta-analysis in patients with cancer[J].Pharmacogenomics J,2014,14(2):115-119.

[18]Huang L,Tissing WJ,De Jonge R,et al.Polymorphisms in folate-related genes:association with side effects of high-dose methotrexate in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2008,22(9):1798-1800.

[19]Pui CH.Genomic and pharmacogenetic studies of childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Front Med,2015,9(1):1-9.

AssociationbetweentheC677TpolymorphismsofMTHFRandthetoxicityofmethotrexateinpediatricacutelymphoblasticleukemia:aMeta-analysis

ZHU Chen1,2，WANG Xiao-ling3,LI Xiao-ling2*

(1.Sir Run Run Shaw Hospital,Medical School,Zhejiang University,Hangzhou 310016,China;2.Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China;3.Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China)

ObjectiveTo systemically analyze the association between the C677T polymorphisms of MTHFR and the toxicity of methotrexate (MTX) in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL).MethodsThe articles about association between MTHFR C677T polymorphism and MTX-induced toxicity in pediatric ALL were achieved by searching PubMed,Cochrane Library,Web of Science and Embase from the establishment of database to August 2016.The methodology quality was evaluated by extracting related information of genotype and MTX toxicity.RevMan 5.3 software was applied to perform the Meta-analysis.ResultsTotally 9 studies were included.The Meta-analysis results indicated that there was no significant association between MTHFR C677T and hepatotoxicity (CC vs.CT/TT,RR:0.81,95%CI:0.65～1.00,P=0.05),hematologic toxicity and mucositis.However,single study showed that the protective effect of 677C was more obvious in the African on hepatotoxicity,hematologic toxicity and mucositis (CC/CT vs.TT,RR:0.10,95%CI:0.03～0.39,P=0.000 9).ConclusionMTHFR C677T polymorphisms do not seem to be a good marker of MTX-related toxicity in pediatric ALL.Large-sample and high-quality studies are required to verify the conclusions.

Children;ALL;MTHFR;C677T;Polymorphism;MTX;Toxicity

2016-11-29

1.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院，杭州 310016;2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥劑科，北京 100053；3.首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院，北京 100045

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201709007