魚膠原蛋白酶解工藝及其活性肽抑制ACE酶的研究

,, ,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510641;2.華南師范大學生命科學學院,廣東廣州 510631)

魚膠原蛋白酶解工藝及其活性肽抑制ACE酶的研究

汪雨亭1,黃儒強2,王娟1,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510641;2.華南師范大學生命科學學院,廣東廣州 510631)

本研究通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化胃蛋白酶水解魚膠原蛋白制備膠原多肽的工藝。采用高效液相色譜法測定海水魚與淡水魚膠原多肽血管緊張素轉換酶(ACE)的抑制活性來表征其降血壓功能。研究表明:胃蛋白酶制備魚膠原多肽的最佳酶解工藝條件是水解溫度為37 ℃,初始pH為2.5,酶與底物比例為1∶125 (w/w),底物質量分數(shù)為3%(w/v),水解時間為12 h,此時魚膠原蛋白溶液的水解度為19.17%。研究發(fā)現(xiàn)海洋魚膠原蛋白和淡水魚膠原蛋白的酶解上清液均具有較高的ACE抑制活性,半抑制濃度IC50分別為1.34 mg/mL和1.52 mg/mL。利用超濾離心管獲得的不同分子量組分中,分子量小于3 ku的海洋膠原多肽CP-Ⅰ和淡水膠原多肽CP-Ⅲ的ACE抑制活性的半抑制濃度IC50分別為0.43 mg/mL和0.60 mg/mL,而相應分子量大于3 ku的海洋膠原多肽CP-Ⅱ和淡水膠原多肽CP-Ⅳ的半抑制濃度IC50分別為1.78 mg/mL和1.69 mg/mL。

血管緊張素轉換酶,魚,膠原蛋白,活性肽

高血壓是目前流行最為廣泛的心血管疾病,是危害人體身體健康的主要慢性疾病之一[1]。目前用于治療高血壓的降壓藥物有卡托普利、依那普利、培哚普利等。這類藥物都是人工合成的降壓藥物,需要長期服用且有一定的副作用如引起咳嗽、喪失味覺、腎臟損傷等[2]。這類藥物主要通過抑制血管緊張素轉換酶(ACE,EC 3.4.15.1)的活性來實現(xiàn)降壓。ACE是一種二肽羧肽酶,在人體血壓的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。一方面,ACE可催化水解血管緊張素Ⅰ轉變成具有血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ,血管緊張素II具有收縮血管平滑肌的效應,而血管收縮,會引發(fā)高血壓,是現(xiàn)己知作用最強的內(nèi)源性升壓肽;另一方面,ACE能促進一種血管活性多肽-舒緩激肽的降解,導致其失活,從而無法發(fā)揮舒緩激肽擴張毛細血管并增加其通透性達到舒張血管降低血壓的作用[3-5]。尋求合適的降壓物質即具有抑制ACE活性的物質已成為防治高血壓的重點。從生物資源中分離出的ACE抑制肽的降壓效果雖沒有人工合成的降壓藥物顯著,但其對正常血壓無影響,藥物毒副作用小[6-7]。故從各種天然資源中篩選具有ACE抑制活性的生物活性成分,已經(jīng)成為尋找和發(fā)掘天然降血壓物質的常用方法[8-9]。

ACE抑制劑的首次發(fā)現(xiàn)是在巴西腹蛇的蛇毒中,由Feerreira等人分離出來的[10]。迄今為止,人們已經(jīng)利用多種蛋白酶水解各種食物蛋白得到了超過200種的ACE抑制肽。一直以來,研究所采用的原材料多為陸地上的谷類、豆類、乳類和肉類等蛋白質[11-12],但隨著海洋中豐富的生物資源逐漸為人類所發(fā)現(xiàn),水產(chǎn)蛋白資源的開發(fā)和利用日益受到關注。魚膠原蛋白作為一種營養(yǎng)豐富的水產(chǎn)蛋白,具有低抗原性、低過敏性和分子結構較脆弱,酶解較容易等特點[13-15]。本研究以優(yōu)質魚膠原蛋白為原料,在不同酶解工藝條件下制備降血壓肽,并探究制備具有降血壓活性的魚膠原蛋白多肽的最佳酶解工藝條件。在最優(yōu)化條件下酶解魚膠原蛋白,通過ACE抑制率的體外檢測方法對水解產(chǎn)物的降血壓活性進行評價,以及比較海洋魚與淡水魚膠原蛋白水解后得到的降血壓肽的活性差異。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海洋魚膠原蛋白、淡水魚膠原蛋白(蛋白含量≥98%) 廣州合誠實業(yè)有限公司;胰蛋白酶(來源于豬胰臟,酶活力≥200 U/mg) 上海將來試劑股份有限公司;胃蛋白酶(Pepsin,酶活力≥250 U/mg) 安耐吉化學;堿性蛋白酶(酶活力≥200 U/mg) 北京奧博星生物技術有限責任公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate,HHL)、血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme from porcine kidney) 美國Sigma公司;乙腈、三氟乙酸(色譜純) 上海晶純生化科技股份有限公司;超濾離心管(4 mL 3KD) 上海晶睿生物科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

PHS-25數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;Sartorius BP211D分析天平 中科院廣州化學研究所;Gk-16M高速冷凍離心機 上海科勞離心機儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;自動消化爐、KND-F型自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;電動攪拌器 常州奧華儀器有限公司儀器與設備;旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Waters高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1 魚膠原蛋白酶解工藝流程 稱取3 g膠原蛋白,用100 mL緩沖溶液溶解制成3%的膠原溶液,以此為底物。按照實驗設計調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋至所需溫度,按水解條件加酸(HCl)或堿(NaOH)配制緩沖溶液使之達到預定的pH,加入一定量的酶進行水解,水解時間為所設時間[16]。水解過程中用電動攪拌機不斷攪拌,水解達到預定時間后,沸水浴中滅活酶15 min,終止酶解反應,然后迅速冷卻至室溫,置于離心機中,以4000 r/min離心15 min后,傾倒出上清液,記錄上清液體積(mL),濾液用蒸餾水補充缺失體積至100 mL,酶解液用于水解度的測定。

1.2.2 水解度(DH)的測定 蛋白質含量測定方法采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2003),氨態(tài)氮含量的測定方法采用甲醛滴定法[17]。

水解度(DH)計算公式為:

式(1)

式(1)中:N1-酶解液中游離氨態(tài)氮的量,g/100 mL;N0-酶解前游離氨態(tài)氮量,g/100 mL;N-原料總氮量,g/100 mL。

1.2.3 最適蛋白酶的篩選 在各種蛋白酶的最適作用范圍內(nèi)，在各種蛋白酶的較佳作用條件下進行魚膠原蛋白水解(表1)，完成后分別測定水解物的水解度DH。

表1 各蛋白酶較佳作用條件Table 1 Reaction conditions of proteases

1.2.4 制備魚膠原蛋白肽的單因素酶解實驗 胃蛋白酶作用魚膠原蛋白的各因素基本條件定為:酶用量(酶與底物質量比)為1∶100,底物質量分數(shù)為3%(酶與底物質量比則采用5%便于酶量計算),pH2.0,反應溫度37 ℃,水解時間180 min。在固定其它條件下,改變其中一個條件以分別考察酶用量、底物質量分數(shù)、初始pH、反應溫度和反應時間對膠原蛋白水解度(DH)的影響。反應結束后沸水保溫15 min滅酶,測定反應后的水解度(DH)。

各因素濃度梯度如表2所示:

表2 魚膠原蛋白肽的單因素酶解實驗中各單因素的濃度梯度Table 2 The concentration gradient of single-factor in the enzymatic hydrolysis of collagen

1.2.5 制備魚膠原蛋白肽的正交實驗設計 根據(jù)單因素實驗結果,可基本確定反應時間為12 h,正交實驗設計則以底物質量分數(shù)、酶與底物質量比、反應溫度和初始pH為影響因素,以水解度為考察指標,進行 L9(34)正交實驗,因素水平見表3。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 Design of factors and levels of orthogonal experiments

1.2.6 膠原多肽的制備和分級 正交實驗所確定的胃蛋白酶水解魚膠原蛋白制備膠原多肽的最佳酶解工藝條件是水解溫度為37 ℃,初始pH為2.2,酶與底物比例為1∶125 (w/w),底物質量分數(shù)為3%(w/v)。采用該最優(yōu)方案分別水解海洋魚膠原蛋白以及淡水魚膠原蛋白。酶解液經(jīng)離心(3500×g,5 min)后,取上清液用截留分子量為3 ku的超濾離心管進行超濾處理,可分別得到海洋魚皮膠原多肽的分子量<3 ku的膠原多肽-I(collagen polypeptide-I,CP-Ⅰ)和分子量>3 ku(CP-Ⅱ)兩個組分和淡水魚皮膠原多肽的分子量<3 ku(CP-Ⅲ)和分子量>3 ku(CP-Ⅳ)兩個組分。將各待測組分以及兩種酶解上清液冷凍干燥,低溫保存。

1.2.7 ACE抑制率的測定

1.2.7.1 測試樣品的制備 將以上六種凍干組分按一定量溶于超純水配制成相同濃度的溶液。按表4順序加入各溶液,37 ℃保溫10 min后,加HHL溶液啟動反應,37 ℃保溫30 min后加1 mol/L HCl 50 μL終止反應,過PP型微孔濾膜去除大顆粒雜質,反應液體經(jīng)0.45 μm微濾膜過濾作為待測樣品溶液[18]。

表4 膠原蛋白降血壓肽ACE抑制活性的方法Table 4 The determine method of ACE inhibitory activity

其中試劑的配制參照以下的方法:

0.1 mol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH8.3,含0.3 mol/L NaCl):稱取12.37 g硼酸,加熱溶解后定容至1 L備用。稱取19.07 g硼砂(Na2B4O7·10H2O),加熱溶解后定容至1 L備用。量取175 mL硼砂溶液和325 mL硼酸溶液混合在一起,用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)至pH8.3,然后再加入17.532 g NaCl,定容至1 L即可。

ACE溶液:取0.1UN ACE溶于1 mL 0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH8.3,含0.3 mol·L-1NaCl)。

HHL溶液:取適量HHL,用0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH8.3,含0.3 mol·L-1NaC1)配成6.0 mmol·L-1HHL溶液。

1.2.7.2 ACE抑制率體外檢測原理 原理基于HHL在ACE催化作用下水解后會生成馬尿酸(HA)和組氨酰亮氨酸。未完全反應的HHL在228 nm處具有吸收峰,故可測定其吸光度以期量化。

1.2.7.3 HHL含量測定 色譜條件:實驗色譜柱EC-C18(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),流動相乙腈-水-三氟乙酸,體積比50∶50∶0.05,檢測波長228 nm,流速0.4 mL/min,柱溫37 ℃,進樣量10 μL[10]。

1.2.7.4 ACE抑制率的計算

式(2)

式(2)中,S1為實驗組HA的峰面積,S0為對照組HA的峰面積。

1.2.7.5 IC50值的測定方法 將六種凍干組分分別配制成一定質量濃度梯度的溶液,并測定各溶液的ACE抑制率。以水解物質量濃度為橫坐標、ACE抑制率為縱坐標繪制曲線,通過ACE抑制活性與水解產(chǎn)物質量濃度之間存在質量濃度效應關系,確定各水解產(chǎn)物的IC50值。

2 結果與討論

2.1最適蛋白酶的篩選

分別在表1所示各種蛋白酶的推薦使用條件下，以5000 U/g加酶量水解魚膠原蛋白，得到水解度DH如圖1。胰蛋白酶水解魚膠原蛋白的DH為5.72%±0.14%之間，堿性蛋白酶的DH在6.43%±0.27%，而胃蛋白酶水解魚膠原蛋白的DH為8.23%±0.32%。和其他兩種相比，胃蛋白酶作用后的膠原蛋白多肽的水解度相對較高，因此本研究采用胃蛋白酶作為進行后續(xù)實驗的水解酶。

圖1 不同蛋白酶對魚膠原蛋白的作用效果Fig.1 The hydrolysis effect of proteases on fish collagen

2.2單因素酶解實驗結果

圖2 制備魚膠原蛋白肽的單因素酶解實驗結果Fig.2 Results of single factor experiments of preparation of fish collagen peptide by enzymatic hydrolysis

由圖2a可知,胃蛋白酶在不同底物質量分數(shù)條件下水解膠原蛋白,初始階段隨著底物質量分數(shù)的升高,水解程度升高,在底物質量分數(shù)為3%時,水解程度最高,之后水解度呈下降趨勢。底物濃度較小時,酶解的速率較低,底物的水解度較小,而底物濃度過高時,酶解速率主要取決于酶的濃度,底物濃度過高導致和酶的結合度過高不利于水解的進行,所以水解度呈下降趨勢。由圖2b可知,胃蛋白酶在不同酶與底物質量比例條件下水解膠原蛋白,水解程度隨酶與底物質量比例從1∶50的減小而增加,當酶與底物質量比例為 1∶100時,水解程度最高,隨后呈下降趨勢。酶與底物的比例過低時,酶能作用的底物量較少,酶解速率較低故水解度較低,而酶與底物的比例過高時,則酶分子過量,可供酶作用的底物量不足,酶解速率減慢,故水解度呈下降趨勢。由圖2c可知,胃蛋白酶在不同pH條件下水解膠原蛋白,水解程度隨pH的升高先增加后降低,當pH為2.0時,胃蛋白酶的活性最強,水解度較高。由圖2d可知,胃蛋白酶在不同溫度條件下水解膠原蛋白,溫度為37 ℃時,水解度最高,也說明此溫度下胃蛋白酶的活性最強。由圖2e可知,隨著水解時間的延長,魚膠原蛋白的水解度不斷增大。在1～3 h的時間內(nèi),水解度整體上呈線性增加。在反應3～9 h時間內(nèi)水解度增幅相對顯著,在9～12 h時,水解度增幅較小,趨向飽和狀態(tài)。由于反應時間的過長對能源的消耗過高,且不能達到水解度較大的增幅,所以12 h為較佳水解時間。

2.3制備魚膠原蛋白肽的正交實驗結果

正交實驗的實驗結果如圖所示。

由表5可知,通過測定胃蛋白酶水解魚膠原蛋白制備的膠原多肽的的水解度,得出4種因素對水解度結果影響大小依次為D>A>B>C,即底物質量分數(shù)>水解溫度>初始pH>酶與底物比例。方差實驗分析結果表明,底物質量分數(shù)和溫度對水解度的影響較為顯著,而初始pH、酶與底物比例則對水解度的影響不顯著。通過正交實驗基本可以確定胃蛋白酶水解魚膠原蛋白的最佳酶解工藝條件組合為A2B3C3D1,即水解溫度為37 ℃,初始pH為2.5,酶與底物比例為1∶125 (w/w),底物質量分數(shù)為3%(w/v),此時魚膠原蛋白溶液的水解度為19.17%。

表5 胃蛋白酶水解魚膠原蛋白的正交實驗結果Table 5 Results of orthogonal experiments

圖3 測定魚膠原蛋白肽ACE抑制活性的色譜圖集Fig.3 Chromatographs of ACE inhibitory activity of collagen peptide

圖4 水解物質量濃度與ACE抑制率關系曲線Fig.4 Relationship between concentration and ACE inhibitory activity of hydrolyzed casein

2.4膠原多肽ACE抑制活性測定結果

取10 μL的反應液在HPLC上進行上樣分析,分析后得色譜圖。圖3b為將ACE滅活后與HHL并存的色譜圖,先加入的HCl可完全抑制ACE的活性,且在在混合反應物中未檢測出HA(結果未顯示)。其中圖3b中HHL的保留時間為11.373 min。圖3a為未加入ACE抑制劑的ACE催化HHL生成HA的色譜圖,與圖3b比較可知HA是HHL在ACE催化水解下的產(chǎn)物。圖3a中HA和HHL完全基線分離,HA的保留時間為7.026 min,HHL的保留時間為11.754 min。同時圖3c～圖3h為各組分(溶液濃度為1.25 mg/mL)作為ACE抑制劑加入反應液中,HHL和HA的色譜圖(圖3c～圖3e分別對應海洋魚膠原多肽粗品、CP-Ⅱ和CP-I的色譜圖;圖3f～圖3h分別對應淡水魚膠原多肽粗品、CP-IV 和CP-III的色譜圖。圖3c～圖3h的HA和HHL的保留時間均與圖3a的保留時間相近。將圖3c～圖3h與圖3a比較可知,加入了膠原蛋白酶解產(chǎn)物所產(chǎn)生的HA峰面積(或含量)顯著減少,證明膠原蛋白酶解產(chǎn)物可在體外對ACE酶產(chǎn)生抑制效果。

各組分對ACE的半抑制濃度的測定結果如下圖:

根據(jù)擬合方程計算出IC50值,計算結果如下表:

表6 膠原蛋白降血壓肽各組分對ACE的半抑制濃度計算結果Table 6 IC50 of ACE inhibitory activity of different fractions of collagen peptides

由圖4可知,水解物的質量濃度增加,ACE抑制率增大,說明ACE抑制率與水解物質量濃度之間有質量濃度一效應關系;但當質量濃度增大到某一值時,ACE抑制率趨于平穩(wěn)。表7顯示經(jīng)胃蛋白酶水解后得到的海洋魚膠原多肽的IC50值為1.34 mg/mL,而相應的淡水海洋魚膠原多肽的IC50值為1.52 mg/mL。即海洋魚膠原多肽的降血壓活性稍高于淡水海洋魚皮膠原多肽。經(jīng)超濾離心管分離后的兩大組分中,分子量<3 ku的組分的ACE抑制活性優(yōu)于分子量>3 ku的組分。其中CP-Ⅰ的IC50值為0.43 mg/mL,CP-Ⅲ的IC50值為0.60 mg/mL。這表示產(chǎn)物中具有ACE抑制活性的多肽分子量較小,這一點與其他ACE抑制肽的研究中認為分子量小于1 kDa的寡肽降血壓活性更強的結論是一致的[19-20]。

3 結論

本研究通過單因素實驗和正交實驗確定了胃蛋白酶水解魚膠原蛋白制備膠原多肽的最佳酶解工藝條件是水解溫度為37 ℃,初始pH為2.2,酶與底物比例為1∶125 (w/w),底物質量分數(shù)為3%(w/v),水解時間為12 h,此時魚膠原蛋白溶液的水解度為19.17%。

本研究利用HPLC測定了在最佳酶解條件下得到的海洋魚以及淡水魚膠原蛋白多肽的ACE抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)海洋魚皮膠原多肽及淡水魚皮膠原多肽均具有較高的ACE抑制活性,半抑制濃度IC50分別為1.34 mg/mL和1.52 mg/mL。利用超濾離心管獲得的不同分子量組分中,分子量小于3 ku的海洋膠原多肽CP-Ⅰ和淡水膠原多肽CP-Ⅲ的ACE抑制活性的半抑制濃度IC50分別為0.43 mg/mL和0.60 mg/mL,而相應分子量大于3 ku的海洋膠原多肽CP-Ⅱ和淡水膠原多肽CP-Ⅳ的半抑制濃度IC50分別為1.78 mg/mL和1.69 mg/mL.分析可知,海洋魚膠原蛋白的ACE抑制活性更強。相關研究今后應進一步對魚皮膠原蛋白ACE抑制肽進行分離純化并研究其作用機理,為高血壓的防治以及漁業(yè)資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

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Studyonenzymatichydrolysisprocessoffishcollagenandantihypertensivepeptidesofcollagen

WANGYu-ting1,HUANGRu-qiang2,WANGJuan1,*

(1.College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China;2.College of Life Sciences,South China Normal University,Guangzhou 510631,China)

Single-factor and orthogonal experiments were employed to optimize the preparation process of collagen polypeptide through the hydrolysis of the fish collagen by pepsin. The angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory activity of marine and freshwater fish collagen was determined by high performance liquid chromatography to characterize its blood pressure-lowering function. It showed that the optimal hydrolysis condition of pepsin was emzyme-to-substrate ratio of 1∶125,substrate concentration 3%,temperature 37 ℃,initial pH2.5 and reaction time 12 h while DH was 19.17%. The results showed that the supernatant of enzymatic hydrolysis of marine fish collagen and freshwater fish collagen possessed higher ACE inhibitory activity,while the IC50of their hydrolysates to ACE were 1.34 mg/mL and 1.52 mg/mL. The hydrolysate was separated by Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices with the molecular weight lower than 3 ku. The inhibitory activities of the two fractions was determined. The results showed that the IC50of CP-Ⅰ(≤3 ku)and CP-Ⅲ(≤3 ku)were 0.43 mg/mL and 0.60 mg/mL. While the IC50of CP-Ⅱ(≥3 ku)and CP-Ⅳ(≥3 ku)were 1.78 mg/mL and 1.69 mg/mL.

angiotensin converting enzyme;fish;collagen protein;bioactive peptide

2016-05-16

汪雨亭(1993-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學與工程,E-mail:529763004@qq.com。

*通訊作者:王娟(1981-),女,博士,副研究員,研究方向:食品科學與工程,E-mail:wangjuan@scut.edu.cn。

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項科技攻關與研發(fā)項目(A201301C10)。

TS254.1

:A

:1002-0306(2017)17-0017-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.004