褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對神經(jīng)細胞保護的影響比較

張淑琴，歐陽存，宣 博，陳 茜，楊廣笑，何光源，陳明潔

(1.江漢大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，湖北 武漢 430000)

褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對神經(jīng)細胞保護的影響比較

張淑琴1，歐陽存1，宣 博2，陳 茜2，楊廣笑2，何光源2，陳明潔2

(1.江漢大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430000；2.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，湖北 武漢 430000)

目的探討褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對人神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞增殖及缺糖缺氧保護的影響。方法在體外培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞中加入不同濃度的褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液，處理不同時間，采用MTT法檢測細胞活性；對SH-SY5Y 細胞進行糖氧剝奪處理，加入不同濃度的三種藥物處理細胞，分析三種藥物對SH-SY5Y細胞增殖及缺氧缺糖導致的細胞損傷的影響；采用流式細胞術(shù)檢測三種藥物處理后細胞的周期變化。結(jié)果三種藥物在一定濃度范圍內(nèi)促進細胞增殖。0.8 g/L褐藻多糖硫酸酯作用48 h后顯著促進細胞增殖，細胞增殖率提高63.6%；對SH-SY5Y細胞的糖氧剝奪損傷有保護作用，細胞增殖率比對照提高13.5%；明顯增加S期細胞比例，作用24 h由10.89%增加至18.18%。10%舒血寧注射液作用48 h后顯著促進細胞增殖，細胞增殖率提高55.0%；對細胞糖氧剝奪損傷有保護作用，細胞增殖率比對照提高20.1%；對細胞周期無明顯影響。5%丹紅注射液作用48 h后顯著促進細胞生長，細胞增殖率提高89.4%；明顯增加S期細胞比例，作用72 h由15.05%增加至22.0%；但對細胞缺氧缺糖損傷無明顯影響。結(jié)論一定濃度的褐藻多糖硫酸酯、舒血寧和丹紅在體外均顯著促進SH-SY5Y細胞的增殖，褐藻多糖硫酸酯和舒血寧降低缺氧缺糖導致的細胞損傷。三種藥物均具有有效的神經(jīng)細胞保護作用。

褐藻多糖硫酸酯，舒血寧，丹紅，SH-SY5Y細胞，細胞增殖，細胞周期，糖氧剝奪，神經(jīng)細胞保護

腦血管疾病(CVD)是神經(jīng)系統(tǒng)的常見多發(fā)病，是目前導致人類死亡的三大主要疾病之一，并且存活者中有50%～70%的致殘率，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1]。而腦梗死(缺血性腦卒中)是CVD中最常見的類型，占全部CVD的70%，是一種急性起病的腦血液供應(yīng)障礙疾病，由多種病理因素和危險因素參與，導致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損[1，2]。對于如何提高急性腦梗死的療效，降低死亡率及致殘率，一直是目前的研究熱點。本研究從神經(jīng)細胞的保護性著手，觀察褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液幾種藥物的神經(jīng)保護影響。褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中提取的一類硫酸化多糖，主要由巖藻糖和硫酸基組成，具有保護神經(jīng)細胞、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。舒血寧注射液和丹紅注射液是缺血性腦血管疾病的臨床用藥，其療效得到一定的認可，褐藻多糖硫酸酯目前尚沒有應(yīng)用于臨床。2012年6月至2016年2月作者以人神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞為材料，通過體外細胞培養(yǎng)與增殖檢測、細胞周期分析和缺氧缺糖損傷處理，比較褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液對人神經(jīng)細胞增殖的影響以及對細胞缺氧缺糖損傷的保護作用。希望此研究對缺血性腦血管疾病的臨床藥物的開發(fā)、選擇和使用具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1材料褐藻多糖硫酸酯、胰蛋白酶、MTT以及DMSO均購自Sigma公司。丹紅注射液由荷澤步長制藥有限公司提供，舒血寧注射液由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供。無支原體胎牛血清FBS購自杭州四季青公司，青霉素-鏈霉素溶液購自安特捷生物技術(shù)有限公司。PI檢測試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，Na2S2O3購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞購自中國典型培養(yǎng)物中心(CTCC)，用含10%FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細胞增殖檢測采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖。收集對數(shù)期細胞，接種至96孔板2×104個/孔，待細胞貼壁后，更換含有不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48或72 h后，每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，孵育4 h后棄上清，每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃暗培養(yǎng)15 min后，于490 nm測定光吸收值，以完全培養(yǎng)基為空白對照。細胞增殖率=(處理組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.4糖氧剝奪損傷處理應(yīng)用氧糖剝奪誘導卒中樣能量障礙是模擬體內(nèi)缺血性損傷最普遍的方法[6]。收集對數(shù)期細胞計數(shù)，接種細胞至96孔板2×104/孔，待細胞貼壁，藥物孵育24 h后，用2 mmol/L Na2S2O3的無糖Earle’s液處理，模擬神經(jīng)細胞缺血時的缺氧缺糖狀態(tài)，孵育1 h后，更換DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行MTT檢測。

1.5細胞周期分析采用PI染色法和流式細胞術(shù)。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)，接種至96孔板2×105個/孔，細胞貼壁后，更換含有各種藥物的新鮮培養(yǎng)基，處理48 h后，收集細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，去上清，每個樣品加入500 μl緩沖液重懸細胞，加入100 μl PI，混勻后室溫避光孵育30 min。通過流式細胞儀檢測，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

2 結(jié)果

2.1三種藥物對SH-SY5Y細胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果表明，三種藥物對SH-SY5Y細胞增殖均呈現(xiàn)濃度與時間相關(guān)性：0.6～2.0 g/L褐藻多糖硫酸酯促進細胞增殖，以0.8 g/L作用最為顯著，作用48 h和72 h細胞增殖率提高分別為63.6%和150%；高濃度褐藻多糖硫酸酯(>2.0 g/L)作用24 h即呈現(xiàn)細胞增殖抑制，作用48 h時顯著抑制細胞增殖，4 g/L抑制率達到40%。0.5～20%舒血寧注射液作用24 h無顯著影響，作用48 h促進細胞增殖，以10%作用最為顯著，作用48 h和72 h細胞增殖率提高分別為54.4%和57.5%。0.5%～10%丹紅注射液作用24 h無顯著影響，作用48 h促進細胞增殖，其中6%促增殖效果最為顯著，作用48 h和72 h細胞增殖率提高分別為89.5%和98.0%。見圖1。

圖1 三種藥物對SH-SY5Y細胞增殖的影響 a:褐藻多糖硫酸酯；b:舒血寧注射液；c:丹紅注射液

2.2三種藥物對SH-SY5Y細胞缺糖缺氧損傷的影響褐藻多糖硫酸酯和舒血寧注射液均有效降低缺氧缺糖對SH-SY5Y細胞的損傷，與對照組比較，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯使細胞增殖率提高13.5%，10%舒血寧注射液使細胞增殖率提高20.1%，差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.001)。丹紅注射液對細胞缺氧缺糖損傷沒有明顯影響。見圖2。

圖2 三種藥物對SH-SY5Y細胞缺糖缺氧的影響

2.3三種藥物對SH-SY5Y細胞周期的影響細胞周期分析結(jié)果表明，0.8 g/L 褐藻多糖硫酸酯和6%丹紅注射液均明顯提高S期細胞比例，表明褐藻多糖硫酸酯和丹紅注射液促進SH-SY5Y細胞DNA合成，提高細胞分裂增殖效率。舒血寧注射液對細胞周期無明顯影響。

表1 三種藥物對SH-SY5Y細胞周期的影響 (%)

3 討論

腦梗死的高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率對患者、家庭、社會都造成極大的負擔，目前對于腦梗死的診治方方面面都大力開展研究，其中，藥物的神經(jīng)保護也是一個很重要的方面。

褐藻多糖硫酸酯是從褐藻中提取的一類硫酸化多糖，研究發(fā)現(xiàn)其具有保護神經(jīng)細胞、抗凝血、抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[3]，大鼠腦缺血再灌注損傷后使用褐藻多糖鹽酸酯顯示其通過提高轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達縮小腦梗死體積，對腦缺血再灌注損傷大鼠起到神經(jīng)保護作用[4]，目前均在實驗階段，尚未應(yīng)用于臨床。舒血寧注射液為銀杏葉提取物，主要成分為總黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯，具有抗脂質(zhì)和抗氧化自由基過氧化作用，擴張血管，改善循環(huán)，應(yīng)用于心腦血管缺血性疾病[5，6]。丹紅注射液主要由丹參和紅花兩種中藥材經(jīng)提取而成，其中主要的有效成分為丹參水溶性成分丹參酸、丹參酚酸及紅花水溶性成分紅花黃色素、紅花酚苷和兒茶酚胺等，中醫(yī)認為具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)等功效，現(xiàn)代醫(yī)學研究認為具有很好的抗炎、降血脂、抗凝抑栓、抗凋亡、神經(jīng)保護等作用[7，8]，臨床廣泛用于治療高血壓、冠心病、腦血栓、心絞痛等心腦血管疾病[9]，在計算機系統(tǒng)生物學研究中也顯示丹紅注射液參與抗炎、細胞分化與凋亡、心血管疾病、抗腫瘤等作用[10]，與臨床治療范疇相吻合。

SH-SY5Y細胞株作為擬神經(jīng)細胞模型，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和防止措施的研究[11]。本研究以SH-SY5Y細胞株為材料，通過神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)實驗、細胞增殖檢測、細胞周期分析和缺氧缺糖損傷處理，分別將褐藻多糖硫酸酯、舒血寧注射液和丹紅注射液作用于神經(jīng)細胞，比較三種藥物對人神經(jīng)細胞增殖的影響以及對細胞缺氧缺糖損傷的保護效果，以利于缺血性腦血管疾病的臨床藥物的開發(fā)、正確選擇和有效使用。

本研究結(jié)果表明，三種藥物在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度和時間依賴性地促進SH-SY5Y細胞增殖，作用48 h以6%丹紅注射液效果最為顯著，細胞增殖率比對照提高89.5%；作用72 h以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，細胞增殖率比對照提高150%。褐藻多糖硫酸酯和舒血寧注射液均有效降低缺氧缺糖對SH-SY5Y細胞的損傷，舒血寧注射液效果尤佳。細胞周期分析結(jié)果表明，褐藻多糖硫酸酯和丹紅注射液均通過提高S期細胞比例，加速細胞由S期通過G2期進入M期，提高細胞分裂效率以實現(xiàn)其促進神經(jīng)細胞的增殖作用。

體外細胞實驗結(jié)果表明三種藥物具有一定的神經(jīng)細胞保護作用，根據(jù)實驗結(jié)果在臨床用藥中急性期48 h內(nèi)使用丹紅注射液，并且濃度控制在6%是否發(fā)揮臨床療效最佳。舒血寧對低氧低糖狀態(tài)下療效優(yōu)于丹紅，是否說明急性期之后舒血寧的療效優(yōu)于丹紅注射液。作用72 h則以8 g/L褐藻多糖硫酸酯增殖效果最佳，并且對缺血低糖情況下能有效的保護神經(jīng)細胞的損害，可以加速細胞由S期通過G2期進入M期，提高細胞分裂效率以促進神經(jīng)細胞的增殖，但更高濃度的褐藻多糖硫酸酯則抑制細胞的增殖，從體外細胞實驗可以展望褐藻多糖硫酸酯有著極好的前景。但作用的分子機制有待進一步研究。

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ComparisonofproliferativeeffectsofFucoidan，ShuxueninginjectionandDanhonginjectiononneuralcells

ZHANGShu-qing1，OUYANGCun1，XUANBo2，ZHENGQian2，YANGGuang-xiao2，HEGuang-yuan2，CHENMing-jie2

(1.DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity，Wuhan430000，China；2.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongUniversityofScience&Technology，Wuhan430000，China)

CHENMing-jie

ObjectiveTo investigate the effect of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection on proliferation and protection of oxygen-glucose deprivation (OGD) of human SH-SY5Y neuroblastoma cells.MethodsSH-SY5Y cells were treated with different concentrations of Fucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection for different time.Cell viability was determined by using MTT assay.SH-SY5Y cells were preconditioned for OGD.After treatment with the three types of drugs with different concentrations，cell viability was detected in order to analyze the effect of the drugs on cell proliferation and injure induced by OGD.Flow cytometry was used to analyze the cell cycle changes.ResultsThe three types of drugs at certain concentration increased the cell proliferation.0.8 g/L of Fucoidan treatment for 48 h，a 63.6% increase in the cell growth was observed.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 13.5% and percentage of S phase was markedly increased from 10.89% to 18.18% after treatment for 24 h when compared to the controls.10% Shuxuening injection treatment for 48 h，a 55.5% increase in cell growth was found.For protection of cell injury caused by OGD，the proliferation rate was increased by 20.1% but no obvious effect on the cell cycle distribution was observed when compared to the controls.5% Danhong injection treatment for 48 h，a 89.4% increase in the cell growth and a significantly increase in the cell percentage of S phase from 15.05% to 22.0% after 72-hour treatment were observed，but no obvious effect on OGD injury was found.ConclusionFucoidan，Shuxuening injection and Danhong injection at certain concentration significantly increase the proliferation of SH-SY5Y cells.Fucoidan and Shuxuening injection could reduce the cell injury caused by OGD.The three types of drugs all have a protective effect on neural cells.

Fucoidan；Shuxuening injection；Danhong injection；SH-SY5Y cells；Cell proliferation；Cell cycle；OGD；Protective effect on neural cells

武漢市科技攻關(guān)計劃資助項目(編號：201260523185)，武漢市衛(wèi)計委基金資助項目(編號：WG16D02)

陳明潔

R741.05

A

1672-6170(2017)05-0037-04

2017-02-26；

2017-05-24)