普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)理

陳亞藍(lán)，王雪青,*，王怡雯，鄭子晴，葉美霞，付芳芳，趙 培，宋文軍，王素英，白曉麗，李長文

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南 普洱 665100）

普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)理

陳亞藍(lán)1，王雪青1,*，王怡雯1，鄭子晴1，葉美霞1，付芳芳1，趙 培1，宋文軍1，王素英1，白曉麗2，李長文2

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南 普洱 665100）

以正常培養(yǎng)和油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞系（human hepatocellular liver carcinoma cell line，HepG2）細(xì)胞為模型，通過測定普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，細(xì)胞中脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c）、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的轉(zhuǎn)錄水平，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phospho-AMP-activated protein kina se，p-AMPK）的蛋白表達(dá)水平研究普洱茶茶色素的減肥降脂作用機(jī)制。結(jié)果顯示，普洱茶茶色素能明顯降低油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型中TG和TC含量，作用程度依賴于普洱茶的作用質(zhì)量濃度。但對正常培養(yǎng)的HepG2的TG、TC作用影響不顯著。經(jīng)過普洱茶茶色素作用油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，能顯著下調(diào)細(xì)胞的FAS和SREBP-1c的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），顯著上調(diào)ABCA1的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），且使CYP7A1的轉(zhuǎn)錄水平呈上升趨勢，并顯著上調(diào)p-AMPK蛋白的表達(dá)量（P＜0.05）。因此，普洱茶茶色素可通過調(diào)控上述調(diào)控因子和酶的表達(dá)而改善油酸誘導(dǎo)下HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝水平。

HepG2；脂質(zhì)代謝；普洱茶；色素

陳亞藍(lán), 王雪青, 王怡雯, 等. 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17 ): 203-209. DOI:10.7506/spkx10 02-6630-201717033. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yalan, WANG Xueqing, WANG Yiwen, et al. Effect and mechanism of pigments from Pu-erh tea on lipid metabolism in HepG2 cell model[J]. Food Science, 2017, 38(17): 203-209. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717033. http://www.spkx.net.cn

在高節(jié)奏生活狀態(tài)、不健康的生活方式、高熱量飲食結(jié)構(gòu)的作用下，肥胖已成為威脅人類健康的全球性問題之一。研究發(fā)現(xiàn)肥胖與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切，是Ⅱ型糖尿病、高脂血癥、非酒精性脂肪肝、高血壓等的重要危險(xiǎn)因素[1]。因此，預(yù)防和治療肥胖已成為重要的社會(huì)問題。目前減肥的方式有運(yùn)動(dòng)、藥物治療、手術(shù)治療、中醫(yī)治療等，但這些方式難以堅(jiān)持或?qū)ι眢w造成損傷而難以為繼，所以從天然活性產(chǎn)物中獲取安全有效的成分預(yù)防和治療肥胖已刻不容緩。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)天然成分黃酮類物質(zhì)、多糖類物質(zhì)、茶多酚，或天然物質(zhì)菊花、花椒、山楂、葡萄籽等均有較好的減肥降脂效果[2-6]?，F(xiàn)有的研究表明一些天然活性物質(zhì)可通過過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、肝X受體（liver X receptors，LXRs）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）等信號(hào)途徑調(diào)控脂質(zhì)代謝而達(dá)到減肥效果[7]，其中相關(guān)信號(hào)途徑中脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、SREBPs、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase，HMGCR）、低密度脂蛋白受體等和調(diào)控因子及其信號(hào)間的相互作用被發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[8-9]。

普洱茶已被證實(shí)有良好的減肥降脂功效，但其作用機(jī)理尚未完全闡明[10-11]。因此，本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞作為研究載體，經(jīng)過普洱茶茶色素干預(yù)正常培養(yǎng)、油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2后，測定HepG2細(xì)胞中甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量變化，脂質(zhì)代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)水平，從而在TG代謝和TC代謝方面研究普洱茶茶色素在減肥降脂中的作用機(jī)制，為普洱茶茶色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶茶色素干粉由云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司提供。具體制備方法如下：按照茶水料液比1∶10（m/V），水溫90 ℃，浸提30 min， 兩次浸提后合并浸液，減壓蒸餾，噴霧干燥成粉。普洱茶色素干粉主要成分為茶色素（49.44%，其中茶褐素占47.32%）、蛋白質(zhì)（25.75%）、多糖（16.74%）。

HepG2細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。0.25%胰蛋白酶、Triton-100、雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、飽和油紅O原液、10%中性甲醛、50×TAE、還原型5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液、30%的聚丙烯酰胺-N,N -亞甲雙丙烯酰胺溶液（質(zhì)量比為29∶1）、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）溶液、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）溶液 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 以色列Biological Industries公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；6、96孔板 無錫耐思生物科技有限公司；油酸、無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純） 博歐特化工貿(mào)易有限公司；全蛋白提取試劑盒、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；p-AMPK單克隆抗體（兔抗人）、磷酸甘油醛脫氫酶多克隆抗體（兔抗人）美國Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 美國Abbkine公司；DNA Ladder2000、焦碳酸二乙酯處理水 上海依科賽生物制品有限公司；Gene Green核酸染料 天根生化科技（北京）有限公司；核糖核酸酶抑制劑、瓊脂糖、Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Select Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 美國Life Technologies公司；顯、定影液 天津世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司；Western發(fā)光檢測試劑盒威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；TG、TC試劑盒南京建成生物總公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K高速離心機(jī) 美國Sigma公司；FHC-1200A超凈工作臺(tái) 北京國儀合信商貿(mào)有限公司；240i細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；SPECTRAMAX-M5酶聯(lián)免疫檢測儀 美國MD公司；Ti-u倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司；UV-1紫外透射分析儀 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；DYY-4C電泳儀 北京六一儀器廠；StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng) 美國Applied Biosystem公司；ChemiDocTMXRS凝膠電泳成像儀、T100 PCR擴(kuò)增儀、Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽、170-3940 Trans-Blot SD半干電轉(zhuǎn)儀槽 美國Bio-Rad公司；UV-2550型半微量紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清和雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的DMEM高糖培37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。每隔2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組

將HepG2細(xì)胞分為6 組，將1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液2 mL接種到6 孔板中，分別為對照組（正常培養(yǎng)基組，A1），對照組＋300（A2）、400 μg/mL（A3）茶色素處理組，終濃度為3 mmol/L油酸模型組（B1，油酸溶于0.01 mmol/L的NaOH中，加入5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），搖晃均勻制成20 mmmol/L的油酸母液，過0.22 μm濾膜備用），油酸模型＋300（B2）、400 μg/mL（B3）茶色素處理組（油酸與普洱茶茶色素同時(shí)加入），培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)TC和TG含量測定

按1.3.2節(jié)的分組，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用除去培養(yǎng)基液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗細(xì)胞2 次后加入1%的Triton-100裂解細(xì)胞40 min收集裂解液用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)TC和TG含量。

1.3.4 油紅O染色

參照文獻(xiàn)[12]中油紅O染色方法進(jìn)行改良，將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液用PBS清洗2～3 次；用10%的中性甲醛固定30 min；后用PBS清洗2～3 次，加入油紅O工作液1.5 mL，染色30 min；最后PBS清洗2～3 次，于顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定基因表達(dá)

利用Trizol試劑提取HepG2肝細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測定260、280 nm波長處吸光度， 兩者比值在1.8～2.1之間，表示RNA純度高，并于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。按照試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并于20 μL反應(yīng)體系中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取八連排PCR管，加入SYBR Select Master Mix10 μL，cDNA 1 μL，上下游特異性引物各0.6 μL（5 μmol/L），7.2 μL DEPC水。先95 ℃預(yù)變性2 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min 循環(huán)40 次，結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線和擴(kuò)增曲線確認(rèn)特異性。應(yīng)用2－△△Ct法計(jì)算RNA相對表達(dá)量，以GAPDH基因作為內(nèi)參，測定基因及上下游引物分別為GAPD A：5 -TGGACCT GACCTGCCGTCTAG-3 ，5 -AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3 ；FAS：5 -CCGCCATCGCCATCGCCCTCAGTC-3 ，5 -CGCCCTTCCCGCCCGTGTGC-3 ；SREBP-1c：5 -GCTCCTCCATCAATGACAAAATC-3 ，5 -TGCAGAAAGCGAATGTAGTCGAT-3 ；CYP7A1：5 -CCGATGGATGGAAATACCAC-3 ，5 -GGCAGCGGTCTTTGAGTTAG-3 ；ABCA1：5 -CAAGGGGTAGGAGAAAGAGACGC-3 ，5 -CTCAGCCAGCACCCCCAG-3 。

1.3.6 Western blot測定蛋白表達(dá)

利用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，取樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（80 V，45～60 min后100 V至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部結(jié)束電泳），用PVDF膜進(jìn)行半干式電轉(zhuǎn)（采用恒壓20 V進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間：GAPDH，80 min；p-AMPK，90 min），取出PVDF膜于5%脫脂奶粉制得封閉液封閉1 h后加入一抗4 ℃搖床孵育過夜（一抗稀釋倍數(shù)1∶1000），次日二抗室溫?fù)u床孵育2 h（二抗稀釋倍數(shù)1∶2 000），隨后顯色、曝光、顯影、定影并于G el-pro analyzer凝膠定量分析軟件中進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)采用±s表示，SPSS 16.0軟件分析相關(guān)性和顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶茶色素對細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

圖 1 普洱茶茶色素對對HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響Fig. 1 Effect of pigments from Pu-erh tea on TG level of HepG2 cells

由圖1可知，普洱茶茶色素作用于細(xì)胞24 h后無論是正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞還是油酸處理培養(yǎng)的，其細(xì)胞內(nèi)TG的含量均下降，且呈計(jì)量依賴性。相較于正常培養(yǎng)的對照組，油酸組細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著升高（P＜0.05），300 μg/mL的普洱茶茶色素作用于油酸富集培養(yǎng)HepG2細(xì)胞后，胞內(nèi)TG含量相較于油酸組有所降低，但與對照組相比仍有顯著差異（P＜0.05）。而400 μg/mL的普洱茶茶色素使胞內(nèi)TG含量相較于油酸組顯著降低（P＜0.05），且于對照組相比無顯著差異。說明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)普洱茶茶色素能有效降低細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.2 普洱茶茶色素對細(xì)胞內(nèi)TC含量的影響

圖 2 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞內(nèi)TC含量的影響Fig. 2 Effect of pigments from Pu-erh tea on TC level of HepG2 cells

由圖2可明顯看出，油酸組細(xì)胞內(nèi)TC含量顯著高出對照組約3 倍，差異極顯著（P＜0.01）。不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素能降低油酸培養(yǎng)狀態(tài)下HepG2細(xì)胞內(nèi)TC含量且作用效果呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。400 μg/mL的普洱茶茶色素作用于油酸處理的HepG2細(xì)胞使胞內(nèi)TC含量從0.428 mmol/g減少到0.204 mmol/g，降低了約一半，但兩者差異不顯著（P＞0.05）。說明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，普洱茶茶色素能降低油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞內(nèi)TC含量，但作用效果不明顯。

2.3 油紅O染色觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況

圖 3 油紅O染色法后觀察普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響（×200）Fig. 3 Effect of pigments from Pu-erh tea on lipid content in HepG2 cells evaluated by oil red O staining (× 200)

細(xì)胞中油脂富集情況見圖3。通過油紅O染色可以觀察到，正常培養(yǎng)的細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞形態(tài)明顯，細(xì)胞周圍有少許油滴。而油酸處理24 h后的細(xì)胞，細(xì)胞腫大變形，邊緣輪廓不清晰，有明顯油圈，且在細(xì)胞邊緣和細(xì)

胞內(nèi)有明顯泡狀油滴堆積。對于普洱茶茶色素干預(yù)的正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞保持良好形態(tài)，細(xì)胞中紅色油滴相較對照組無明顯變化。而加入普洱茶茶色素的油酸處理組觀察可知，隨著茶色素質(zhì)量濃度的增加其細(xì)胞內(nèi)油滴量明顯減少，且在400 μg/mL的普洱茶茶色素的干預(yù)條件下細(xì)胞相較對照組變化不明顯，細(xì)胞邊緣輪廓仍可見。

2.4 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞FAS、SREBP-1c、ABCA1、CYP7A1基因表達(dá)水平的影響

圖 4 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞中FAS（a）、SREBP-1c（b）、CYP7A1（c）、ABCA1（d）基因的mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of pigments from Pu-erh tea on the mRNA expression level of FAS (a), SREBP-1c (b), CYP7A1 (c) and ABCA1 (d) in HepG2 cells

普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞中FAS和SREBP-1c表達(dá)水平的影響見圖4a、b。油酸組FAS和SREBP-1c的表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），不同質(zhì)量濃度普洱茶茶色素干預(yù)油酸培養(yǎng)的情況下細(xì)胞中FAS和SREBP-1c表達(dá)水平明顯低于油酸組，差異顯著（P＜0.05）且成劑量依賴性。茶色素對正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的FAS表達(dá)可上調(diào)和下調(diào)但作用效果不顯著。其中400 μg/mL的普洱茶茶色素對油酸干預(yù)的HepG2細(xì)胞的FAS表達(dá)下調(diào)作用最為顯著，且其下調(diào)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。在300 μg/mL普洱茶茶色素作用下其SREBP-1c的表達(dá)水平雖較對照組顯著增加，但明顯低于油酸組（P＜0.05），400 μg/mL普洱茶茶色素作用下，其SREBP-1c的相對表達(dá)水平（0.873）顯著低于油酸組（P＜0.05），且與對照組相差無幾。說明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)普洱茶茶色素能有效下調(diào)油酸環(huán)境下培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的SREBP-1c的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控下游脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的合成從而抑制脂肪酸的合成。

由圖4c可知，不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素對正常培養(yǎng)和油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的CYP7A1表達(dá)均能起到上調(diào)作用。油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中CYP7A1相對表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。400 μg/mL普洱茶茶色素干預(yù)油酸狀態(tài)下HepG2細(xì)胞其CYP7A1相對表達(dá)水平（0.60）明顯高于油酸組（0.09），但上調(diào)作用不顯著（P＞0.05）。

由圖4d可知，不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素對正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的ABCA1的表達(dá)分別有下調(diào)和上調(diào)作用，但作用效果不顯著。對油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的ABCA1的表達(dá)均能起到上調(diào)作用，且作用效果隨質(zhì)量濃度增加而上調(diào)作用加大。400 μg/mL普洱茶茶色素干預(yù)油酸狀態(tài)下HepG2細(xì)胞其ABCA1的表達(dá)水平（0.60）顯著高于油酸組（1.16）（P＜0.05），且上調(diào)效果極顯著高于對照組的表達(dá)水平（P＜0.01），說明高質(zhì)量濃度普洱茶茶色素能有效提高油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中ABCA1的mRNA表達(dá)水平，提高TC逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

2.5 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)水平的影響

圖 5 普洱茶茶色素對HepG2細(xì)胞中p-AMPK表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of pigments from Pu-erh tea on the expression level of p-AMPK in HepG2 cells

由圖5可知，油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中p-AMPK的表達(dá)水平明顯下降，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），說明油酸誘導(dǎo)下是細(xì)胞內(nèi)p-AMPK磷酸化程度降低。普洱茶茶色素對油酸培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的p-AMPK表達(dá)有極顯著上調(diào)作用（P＜0.01），其中400 μg/mL普洱茶茶色素干預(yù)油酸狀態(tài)下HepG2細(xì)胞的p-AMPK磷酸化水平（0.281）略高于對照組（0.260）。

3 討論與結(jié)論

FAS是脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶之一，可催化丙二酸單 酰輔酶A和乙酰輔酶A聚合成長鏈脂肪酸，最終以TG的形式貯存能量于肝細(xì)胞中[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)FAS的表達(dá)與肥胖密切相關(guān)，Roncari等[15]研究發(fā)現(xiàn)肥胖動(dòng)物的脂肪組織中FAS表達(dá)增加，且FAS表達(dá)水平的升高能顯著增加TG在體內(nèi)的沉積從而導(dǎo)致肥胖[16-17]。本研究中油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中FAS基因的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，與上述研究成果一致。在Way等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)普洱茶乙酸乙酯層萃取物作用HepG2細(xì)胞24 h后，F(xiàn)AS基因表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)中不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素均能下調(diào)油酸培養(yǎng)狀態(tài)下HepG2細(xì)胞的FAS基因表達(dá)且作用顯著，說明普洱茶茶色素能有效降低FAS基因的表達(dá)水平，減少脂肪酸的合成。

SREBP-1c是保持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接激活脂肪酸、TG合成及其合成代謝相關(guān)的30多個(gè)基因，若SREBP-1c過度表達(dá)會(huì)引起脂質(zhì)代謝紊亂，造成過多的脂質(zhì)在非脂肪組織內(nèi)沉積，引發(fā)脂肪肝、肥胖等一系列臨床表現(xiàn)[19]。本研究結(jié)果中，油酸組SREBP-1c基因的mRNA表達(dá)較對照組顯著增高，在普洱茶茶色素干預(yù)下其SREBP-1c基因的表達(dá)水平又有顯著降低（圖4b）。李蘇[20]的研究發(fā)現(xiàn)黑茶提取物能下調(diào)脂肪變性的HepG2細(xì)胞模型的SREBP-1c的過度表達(dá)，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

AMPK是預(yù)防肥胖、治療脂質(zhì)代謝紊亂的重要研究靶點(diǎn)，其能調(diào)控機(jī)體內(nèi)能量代謝，是調(diào)控多個(gè)脂肪和成和膽固醇合成相關(guān)酶的上游影響因子[21]。本研究中，普洱茶茶色素能激活油酸誘導(dǎo)狀態(tài)下HepG2細(xì)胞的p-AMPK蛋白磷酸化水平，從而直接或間接調(diào)控脂質(zhì)代謝，預(yù)防和治療肥胖。

脂質(zhì)過度蓄積（主要是TG）是造成肥胖、形成非酒精性脂肪肝、影響肝功能正常進(jìn)行的先決因素[22]。油酸組TG含量較正常培養(yǎng)組急劇上升且油酸組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞輪廓不清晰，細(xì)胞內(nèi)油脂滴多，細(xì)胞外有大量油圈，說明油酸誘導(dǎo)狀態(tài)下的HepG2細(xì)胞已發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞損傷且脂質(zhì)蓄積過多。由此推測，在油酸誘導(dǎo)處理的情況下，HepG2細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)增加過多，超過細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)能力，從而調(diào)控FAS等合成脂肪酸的基因過度表達(dá)，致使脂肪酸合成異常增加[23]。另一方面，油酸誘導(dǎo)作用下機(jī)體通過反饋調(diào)節(jié)上調(diào)了FAS的表達(dá)水平進(jìn)一步增加了細(xì)胞合成脂肪酸的能力。由此，在油酸誘導(dǎo)下細(xì)胞中TG增加，同時(shí)也引起游離脂肪酸含量的提高，增添了肝細(xì)胞的工作負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性進(jìn)一步造成肥胖。而不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素能上調(diào)p-AMPK蛋白表達(dá)水平，下調(diào)SREBP-1c及FAS基因的mRNA表達(dá)量，特別是400 μg/mL時(shí)油酸狀態(tài)下HepG2細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)水平相較于油酸組上調(diào)水平極顯著（P＜0.01），SREBP-1c及FAS基因的mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低，細(xì)胞形態(tài)改善明顯。推測可能是高質(zhì)量濃度普洱茶茶色素激活A(yù)MPK蛋白磷酸化，繼而增強(qiáng)分解代謝，磷酸化的AMPK蛋白能抑制SREBP-1c基因的mRNA表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)FAS基因的mRNA表達(dá)水平從而有效減少肝臟細(xì)胞中TG含量，預(yù)防過多TG在肝細(xì)胞中沉積，改善肝細(xì)胞形態(tài)，保障肝功能正常運(yùn)行，有效預(yù)防肥胖和非酒精性脂肪肝的形成。

CYP7A1能夠?qū)⒏闻K中的TC以膽汁酸的形式排除體外從而降低肝臟中TC含量，普洱茶茶色素在TC調(diào)節(jié)方面的研究甚少。已有研究表明，激活PPARα能促進(jìn)與RXRα的結(jié)合形成異源二聚體，從而刺激CYP7A1啟動(dòng)子，上調(diào)其表達(dá)量[24]。在徐惠龍[24]的研究中高脂模型的PPARα的表達(dá)低于正常對照組，說明在高脂作用下能下調(diào)機(jī)體中PPARα表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中在油酸作用下CYP7A1的表達(dá)量較對照組顯著降低（P＜0.05），由此推測在本實(shí)驗(yàn)研究中油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，能下調(diào)其PPARα表達(dá)，而PPARα正向調(diào)節(jié)CYP7A1的表達(dá)水平，因此在油酸作用下HepG2細(xì)胞中CYP7A1表達(dá)量下降。不同質(zhì)量濃度的普洱茶茶色素均能上調(diào)正常培養(yǎng)和油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的CYP7A1的表達(dá)，且呈劑量依賴性，可能是肝臟循環(huán)中的膽汁酸反饋調(diào)節(jié)作用所致，推測普洱茶茶色素能與膽汁酸結(jié)合形成螯合物而排出體外，增加了肝臟細(xì)胞中膽汁酸的排出量，從而減少了膽汁酸對CYP7A1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，上調(diào)了CYP7A1表達(dá)量從而進(jìn)一步促進(jìn)TC轉(zhuǎn)化為膽汁酸。但在該實(shí)驗(yàn)中，普洱茶茶色素雖能上調(diào)CYP7A1的表達(dá)量，但油酸＋300 μg/mL茶色素和油酸＋400 μg/mL茶色素組相較于油酸組均無顯著差異，推測普洱茶茶色素在該方面作用不明顯。

對于ABCA1的研究一般在外周細(xì)胞或組織中，在普洱茶的減肥降脂中鮮少有對肝細(xì)胞中ABCA1的研究。在肝細(xì)胞中，ABCA1位于肝細(xì)胞膜上，可將肝細(xì)胞內(nèi)的TC轉(zhuǎn)運(yùn)到泛脂的載脂蛋白A-Ⅰ上，從而調(diào)控肝細(xì)胞中TC外流，以降低肝細(xì)胞中TC的含量[25]，此外，這些已部分脂質(zhì)化的載脂蛋白A-Ⅰ可以更多地接收外周細(xì)胞中由ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇，形成高密度脂蛋白，從而使外周細(xì)胞中的膽固醇進(jìn)入肝臟進(jìn)行代謝加工，以膽汁酸排出[26]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除ABCA1基因的小鼠血漿低、高密度脂蛋白膽固醇降低，細(xì)胞內(nèi)膽固醇也大量聚積，形成大量的泡沫狀細(xì)胞[27]。在本研究中油酸誘導(dǎo)的高脂狀態(tài)下，一方面HMGCR的表達(dá)水平提高[28]；另一方面p-AMPK蛋白表達(dá)水平降低，負(fù)調(diào)控HMGCR的表達(dá)使其表達(dá)水平進(jìn)一步提高從而增加內(nèi)源性TC的合成，使細(xì)胞內(nèi)TC增多[29-30]。TC含量增加再反饋調(diào)節(jié)ABCA1的表達(dá)，使其上調(diào)。在不同質(zhì)量濃度普洱茶茶色素作用下，油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中ABCA1不同程度上調(diào)，特別在400 μg/mL普洱茶茶色素干預(yù)下其ABCA1表達(dá)水平高于對照組且差異顯著（P＜0.05）。說明普洱茶茶色素能有效上調(diào)肝細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)，提高肝細(xì)胞中TC的外排，維護(hù)肝細(xì)胞內(nèi)TC平衡。

經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶茶色素一方面通過激活A(yù)MPK磷酸化，從而下調(diào)SREBP-1c和FAS的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到降低肝細(xì)胞中TG含量的作用，另一方面，普洱茶茶色素通過上調(diào)ABCA1和CYP7A1的轉(zhuǎn)錄水平降低細(xì)胞中TC含量，從而在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中TG和TC代謝兩方面起到減肥降脂作用。然而，AMPK是否能調(diào)控ABCA1和CYP7A1的上游調(diào)控因子LXRα和PPARs而達(dá)到減肥降脂作用還有待進(jìn)一步研究。

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Effect and Mechanism of Pigments from Pu-erh Tea on Lipid Metabolism in HepG2 Cell Model

CHEN Yalan1, WANG Xueqing1,*, WANG Yiwen1, ZHENG Ziqing1, YE Meixia1, FU Fangfang1, ZHAO Pei1, SONG Wenjun1, WANG Suying1, BAI Xiaoli2, LI Changwen2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Yunnan Tasly Deepure Biological Tea Group Co. Ltd., Puer 665100, China)

The contents of triglyceride (TG) and total cholesterol (TG), the mRNA expression level of fatty acid synthase (FAS), sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP-1c), cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) and ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1), and the protein expression level of phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK) were investigated for studying the effects of pigments from Pu-erh tea on lipid metabolism in HepG2 cell line cultured with normal or oleic acid enriched medium. The results showed that pigments from Pu-erh tea signifi cantly decreased the contents of TG and TC in HepG2 cells cultured in oleic acid-enriched medium in a dose-dependent manner, although having no signifi cant effect on HepG2 cells cultured in normal medium. The mRNA expression levels of FAS and SREBP-1c were signifi cantly down-reg ulated, and the mRNA level of ABCA1 was signifi cantly up-re gulated, the mRNA expression level of CYP7A1 showed an increased tendency and the protein expression level o f p-AMPK was signifi cantly up-regulated after the treatment with pigments from Pu-erh tea for 24 hours in HepG2 cells cultured in oleic acid-enriched medium (P ＜ 0.05). Therefore, pigments from Pu-erh tea could improve lipid metabolism in HepG2 cells cultured in oleic acid-enriched medium by regulating the mRN A levels of enzymes and transcription factors.

HepG2 ; lipid metabolism ; Pu-erh tea; pigments

10.7506/spkx1002-6630-201717033

R961

A

1002-6630（2017）17-0203-07引文格式：

2016-06-23

天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)規(guī)劃資助項(xiàng)目（T D12-5049）；天津市高?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20120603）；天津商業(yè)大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃（SRT）基金項(xiàng)目

陳亞藍(lán)（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的研究與開發(fā)。E-mail：704930060@qq.com *通信作者：王雪青（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)的研究與開發(fā)。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn