不同濃度乙酸鈉對耐乙酸大腸桿菌DA19蛋白質(zhì)組學(xué)的影響*

張艷軍， 趙 利

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

不同濃度乙酸鈉對耐乙酸大腸桿菌DA19蛋白質(zhì)組學(xué)的影響*

張艷軍， 趙 利

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

對耐乙酸大腸桿菌DA19在含有不同濃度乙酸鈉的氮源限制基本培養(yǎng)基中進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)，并利用雙向凝膠電泳方法分離了穩(wěn)態(tài)時菌體蛋白，再利用質(zhì)譜方法對表達(dá)水平存在差異的蛋白進(jìn)行了鑒定.結(jié)果表明：添加外源乙酸鈉使得生物素羧基載體蛋白亞基、天冬氨酸半醛脫氫酶、巰基過氧化物酶、YgiW蛋白、外膜孔蛋白OmpC和假想蛋白等表達(dá)水平增加；而50S核糖體蛋白L9、果糖1,6-二磷酸醛縮酶、ATP合成酶α亞基和結(jié)合轉(zhuǎn)移蛋白TraT表達(dá)水平減低.由此推測，生物素羧基載體蛋白亞基、天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、巰基過氧化物酶、YgiW蛋白和外膜孔蛋白OmpC等與大腸桿菌DA19的乙酸耐受力提高相關(guān).

大腸桿菌；乙酸；蛋白質(zhì)組;雙向凝膠電泳

大腸桿菌在培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生乙酸，當(dāng)其積累到一定濃度時,會抑制菌體生長并降低產(chǎn)物表達(dá)水平.當(dāng)有乙酸存在時，大腸桿菌胞內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)會發(fā)生改變，從而引起代謝變化，增加其抗酸性，提高其細(xì)胞生存能力.Kirkpatrick等[1]利用雙向電泳考察了大腸桿菌W3110在外源乙酸存在時蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)：外源乙酸引起37種蛋白表達(dá)上調(diào)，包括轉(zhuǎn)運氨基酸和多肽的周質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(ArtI，F(xiàn)liY，OppA和ProX)、參與代謝的酶YfiD和GatY、生長調(diào)節(jié)因子RpoS和自身誘導(dǎo)物合成蛋白LuxS等；同時，導(dǎo)致17種蛋白(包括Pta)表達(dá)下調(diào).

提高大腸桿菌的乙酸耐受性，可以減輕乙酸對菌體生長的抑制情況，同時提高外源蛋白表達(dá)水平.例如，誘變選育的耐乙酸大腸桿菌DA19在乙酸質(zhì)量濃度達(dá)到12 g/L時仍可表達(dá)外源產(chǎn)物人表皮生長因子.雖然傳統(tǒng)的誘變育種方法并不是改造菌種和提高菌株乙酸耐受力的最佳選擇，但是對所得耐乙酸突變株的研究有助于理解其乙酸耐受機(jī)理,為設(shè)計新的耐乙酸途徑提供信息[2].而應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以準(zhǔn)確地研究微生物在環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的表達(dá)差異蛋白，從整體和動態(tài)的蛋白質(zhì)水平了解微生物響應(yīng)環(huán)境變化的生理機(jī)制[3].因此，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了不同濃度外源乙酸鈉存在下耐乙酸大腸桿菌DA19的表達(dá)差異蛋白，以期初步闡明大腸桿菌DA19對乙酸壓力的應(yīng)答機(jī)理，為下一步構(gòu)建乙酸耐受菌株提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌DA19為耐乙酸突變株，由大腸桿菌DH5α誘變篩選得到.

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、M培養(yǎng)基、MN培養(yǎng)基和MNA培養(yǎng)基的組成參見文獻(xiàn)[4].所有培養(yǎng)基均使用去離子水配制.

1.3 培養(yǎng)方法及條件

一級種子和二級種子培養(yǎng)方法及條件見文獻(xiàn)[4].連續(xù)培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐(國強生化FMG-5L)中進(jìn)行，培養(yǎng)方法和條件參見文獻(xiàn)[4].當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時，離心收集菌體，用于后續(xù)實驗.

1.4 差異蛋白質(zhì)分離與鑒定

1.4.1 蛋白質(zhì)樣品制備

取出冷凍保存的穩(wěn)態(tài)時的菌體，加入適量液氮并進(jìn)行研磨，再加入樣品裂解液，置于30 ℃恒溫水浴鍋中，1 h后取出，于15 000 r/min離心15 min，然后取上清液進(jìn)行第2次離心.利用Bradford法測定第2次離心后上清液中的蛋白濃度，然后將其分裝至1.5 mL離心管中，并置于-80 ℃冰箱中保存.

1.4.2 菌體蛋白分離

取含有300 μg蛋白的上清液，加入適量樣品水化液，使得樣品總體積達(dá)到450 μL，并混合均勻.取出-20 ℃冷凍保存的IPG膠條(GE Healthcare，24 cm，pH 3～10)，室溫下放置10 min.將制備好的蛋白樣品沿聚焦槽邊緣從左至右加入，然后用鑷子取下IPG膠條上的保護(hù)層，膠面朝下置于樣品溶液上，進(jìn)行等電聚焦.將聚焦好的IPG膠條置于SDS(十二烷基硫酸鈉)平衡緩沖液Ⅰ和SDS平衡緩沖液Ⅱ中分別平衡15 min后進(jìn)行第2向電泳.當(dāng)溴酚藍(lán)剛好跑出凝膠時停止電泳，取出凝膠，然后進(jìn)行銀染.每個樣品均重復(fù)3次.

1.4.3 圖像分析及質(zhì)譜鑒定

使用ImageScanner掃描儀掃描染色后的凝膠，并利用PDquest 8.0軟件對圖像進(jìn)行分析.手工切取凝膠上選定的差異蛋白點，然后送至上海博苑生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜檢測和鑒定.

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度外源乙酸鈉對大腸桿菌DA19蛋白表達(dá)的影響

大腸桿菌耐乙酸突變株DA19在不同濃度外源乙酸鈉存在下的蛋白表達(dá)情況如圖1所示.其中：圖1(a)為MN培養(yǎng)基(0 g/L乙酸鈉,對照組)中連續(xù)培養(yǎng)時菌體胞內(nèi)總蛋白；圖1(b)～(e)分別為3.6，4.8，7.0和9.0 g/L外源乙酸鈉存在下菌體胞內(nèi)總蛋白.

(a)0 g/L乙酸鈉;(b)3.6 g/L乙酸鈉;(c)4.8 g/L乙酸鈉;(d)7.0 g/L乙酸鈉;(e)9.0 g/L乙酸鈉圖1 大腸桿菌耐乙酸突變株DA19在不同濃度外源乙酸鈉存在下的蛋白表達(dá)情況

序號登錄號蛋白質(zhì)名稱等電點分子量/kDa分?jǐn)?shù)1)蛋白質(zhì)表達(dá)量2)ρ(乙酸鈉)/(g5L-1)03.64.87.09.01gi|48581153150S核糖體蛋白L96.1815.847710.090.210.0840.412gi|446276765生物素羧基載體蛋白亞基4.6616.738911681712012053gi|445956526果糖1,6-二磷酸醛縮酶5.7139.431310.030.0140.0270.0194gi|58000389結(jié)合轉(zhuǎn)移蛋白TraT9.2527.62941-0.0720.0200.185gi|486393867YgiW蛋白5.0814.1254-++++6gi|146323ATP合成酶α亞基5.9355.52481-0.1080.0920.207gi|446276765生物素羧基載體蛋白亞基4.6616.7202133.167.363.5578gi|447097214假定蛋白4.5119.6192-++++9gi|6650193外膜孔蛋白OmpC4.5540.5159144929665469010gi|606368天冬氨酸-β-半醛脫氫酶5.2640.215216.4611.27.52011gi|585372693生物素羧基載體蛋白亞基4.6616.712415.826.769.951012gi|1103833巰基過氧化物酶4.7518.081111818924393.8

注：1)分?jǐn)?shù)>46表明一致或高度同源(P<0.05).

2)蛋白質(zhì)在不同濃度外源乙酸鈉存在下的表達(dá)量，以MN培養(yǎng)基(0 g/L乙酸鈉)中的蛋白表達(dá)量為參照.“-”為未檢測到.

2.2 差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜分析

不同濃度乙酸鈉存在下大腸桿菌DA19表達(dá)差異蛋白較多，因此,選取所有乙酸鈉濃度下均存在差異或差異特別顯著的12個蛋白進(jìn)行質(zhì)譜解析(鑒定結(jié)果見表1)，同時將這些差異蛋白點標(biāo)注在雙向電泳膠片上(見圖1).生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：這些差異蛋白主要參與脂肪酸合成、氨基酸合成、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)等.

3 討 論

3.1 不同濃度外源乙酸鈉對大腸桿菌DA19胞內(nèi)蛋白和周質(zhì)蛋白的影響

培養(yǎng)基中乙酸通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并迅速發(fā)生解離釋放出質(zhì)子，使得細(xì)胞液發(fā)生酸化，從而降低胞內(nèi)代謝酶的活性[2].為了應(yīng)對胞液酸化問題，大腸桿菌通過谷氨酸、精氨酸和賴氨酸的脫羧基反應(yīng)來減少胞內(nèi)質(zhì)子，從而提高胞內(nèi)pH[2].本研究中添加外源乙酸鈉使得天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(aspartate semialdehyde dehydrogenase.見圖1點10)表達(dá)水平增加了6.46～20倍，該酶催化天冬氨酰磷酸生成天冬氨酸-β-半醛，它是由天冬氨酸合成賴氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸生物途徑的第一個分支點.由此推測，大腸桿菌DA19可能通過增加賴氨酸含量，并通過脫羧基反應(yīng)來應(yīng)對乙酸帶來的胞液酸化問題.此外，該氨基酸合成途徑中的中間代謝物二氨基庚二酸是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成部分.因此，耐乙酸大腸桿菌DA19可能通過改變細(xì)胞壁組成來提高其乙酸耐受性.

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase)是一種生物素依賴的酶，包括生物素羧化酶亞基(biotin carboxylase)、生物素羧基載體蛋白亞基(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)和羧基轉(zhuǎn)移酶亞基(carboxyl transferase).該酶催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，為合成脂肪酸和次生代謝產(chǎn)物等提供底物.乙酰輔酶A羧化酶催化的反應(yīng)是脂肪酸合成途徑的第一步，同時也是該途徑的關(guān)鍵反應(yīng)步驟和限速步驟[5]，是碳水化合物轉(zhuǎn)化成脂肪酸的重要調(diào)控位點.本研究中添加外源乙酸鈉導(dǎo)致生物素羧基載體蛋白亞基(acetyl-CoA carboxylase biotin carboxyl carrier protein subunit.見圖1點2，7和11)表達(dá)水平明顯增加，從而使更多的分解代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合成途徑，這可能是大腸桿菌在外源乙酸存在情況下傾向于避免自身生成乙酸[6]的一個原因，同時也可能是該菌株應(yīng)對外源乙酸壓力的一種防御措施.此外，脂肪酸合成途徑產(chǎn)物還參與細(xì)胞膜的合成和維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.因此，耐乙酸大腸桿菌DA19也可能通過增加脂肪酸合成來維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而增加其對乙酸的耐受能力.

果糖1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase)是大腸桿菌糖酵解途徑中的一個酶，可以催化果糖1,6-二磷酸可逆地生成磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛.本研究結(jié)果顯示，添加外源乙酸鈉使得大腸桿菌DA19的果糖1,6-二磷酸醛縮酶(見圖1點3)酶活性顯著降低，表明該菌株可能通過降低EMP途徑流量來減少乙酸的生產(chǎn).

添加外源乙酸鈉導(dǎo)致大腸桿菌DA19的巰基過氧化物酶(thiol peroxidase.見圖1點12)表達(dá)水平顯著增加，該酶是一類廣泛分布于各種細(xì)菌中的抗氧化酶，對細(xì)菌的有氧生長是必不可少的.研究表明，細(xì)菌巰基過氧化物酶可以催化脂類過氧化物的還原過程，防止細(xì)胞膜被活性氧所氧化，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用[7].同時，與對照組相比，在添加乙酸鈉情況下均檢測到了YgiW蛋白(見圖1點5).該蛋白是一種重要的壓力響應(yīng)蛋白，與H2O2、鈣及酸耐受性相關(guān)，吲哚相關(guān)的酸抗性蛋白AriR和H2O2均可以誘導(dǎo)其表達(dá)[8].由此推測，添加外源乙酸鈉可能增加了大腸桿菌DA19胞內(nèi)活性氧的濃度.

50S核糖體蛋白L9(50S ribosomal protein L9)由rplI基因編碼，它可以結(jié)合到23S RNA，同時該蛋白突變會使大腸桿菌K12對熱敏感[9].本研究中添加外源乙酸鈉使得大腸桿菌DA19的50S核糖體蛋白L9(見圖1點1)表達(dá)水平顯著降低，表明該蛋白表達(dá)受到乙酸的抑制.

此外，與對照組相比，在添加乙酸鈉的情況下均檢測到了一種假定蛋白(hypothetical protein.見圖1點8)，其具體的功能尚不明確，需要做進(jìn)一步的研究.

3.2 不同濃度外源乙酸鈉對大腸桿菌DA19膜蛋白的影響

大腸桿菌具有一系列完善的反應(yīng)機(jī)制以應(yīng)對各種環(huán)境壓力，其中細(xì)胞膜是抵御環(huán)境、宿主免疫系統(tǒng)和抗生素的天然屏障.例如，醋酸菌通過改變膜成分來阻止乙酸進(jìn)入細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)其乙酸耐受性[2].外膜是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的特有結(jié)構(gòu)，外膜蛋白以多種結(jié)構(gòu)形式鑲嵌在外膜中，行使多種功能，參與各種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的正常運作，在細(xì)菌的生命活動中起著重要作用[10].

本研究中，添加外源乙酸鈉導(dǎo)致大腸桿菌DA19的外膜孔蛋白OmpC(outer membrane protein C.見圖1點9)表達(dá)水平極顯著增加.OmpC是一種大量存在于細(xì)胞膜上的外膜孔蛋白，該蛋白允許分子量小于600 Da的親水性溶質(zhì)或者離子通過，是物質(zhì)運輸進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)的一種重要的孔蛋白，參與葡萄糖和抗生素的轉(zhuǎn)運[10].同時，OmpC在應(yīng)對外界環(huán)境壓力及乙酸耐受性方面也起著非常重要的作用.例如：添加乙酸使得大腸桿菌O157:H7胞內(nèi)ompC基因表達(dá)增加2～3倍[11]；當(dāng)敲除ompC和ompF后，大腸桿菌的酸抗性降低[12]；同時，較小的OmpC孔蛋白在不良的環(huán)境中表達(dá)升高，可降低膜滲透性[10].由此推測，耐乙酸大腸桿菌DA19通過增加OmpC孔蛋白表達(dá)量，降低膜滲透性，從而減少乙酸進(jìn)入胞內(nèi).這可能是其乙酸耐受性增強的一個原因.

添加外源乙酸鈉導(dǎo)致大腸桿菌DA19的ATP合成酶α亞基(ATP synthase alpha subunit.見圖1點6)表達(dá)水平有所降低.大腸桿菌F0F1型ATP合成酶結(jié)合在膜上，在自由能轉(zhuǎn)換中起著重要作用.在好氧條件下，呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子動力提供能量，ADP在ATP合成酶作用下生成ATP.氧化磷酸化途徑是合成ATP的主要途徑，其產(chǎn)能效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于底物水平磷酸化途徑.文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)，缺乏完整的ATP合成酶的大腸桿菌在以葡萄糖為碳源的基本培養(yǎng)基中好氧生長時生長速率和菌體得率只有野生菌的75%和55%.本研究結(jié)果表明，大腸桿菌DA19的最大比生長速率隨外源乙酸鈉濃度的增加而顯著降低(數(shù)據(jù)未列出).由此推測，外源乙酸鈉可以降低大腸桿菌DA19的ATP合成酶的表達(dá)，進(jìn)而降低ATP合成速率和合成量，從而降低菌體比生長速率.

此外，添加外源乙酸鈉導(dǎo)致大腸桿菌DA19的結(jié)合轉(zhuǎn)移蛋白TraT(conjugal transfer protein TraT.見圖1點4)表達(dá)水平顯著降低.該蛋白是一種菌體外膜脂蛋白，由traT基因編碼，它與菌體的補體抗性和致病力關(guān)系密切，同時還可以與外膜蛋白OmpA相互結(jié)合[14].

綜上所述，本研究利用雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜和生物信息學(xué)方法，對不同濃度乙酸鈉存在下耐乙酸大腸桿菌DA19的菌體總蛋白進(jìn)行了研究，并分離鑒定了表達(dá)水平存在差異的蛋白，它們主要參與脂肪酸合成、氨基酸合成、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)等代謝途徑，推測生物素羧基載體蛋白亞基、天冬氨酸-β-半醛脫氫酶、巰基過氧化物酶、YgiW蛋白和外膜孔蛋白OmpC等與大腸桿菌DA19的乙酸耐受力提高相關(guān).

[1]Kirkpatrick C,Maurer L M,Oyelakin N E,et al.Acetate and formate stress:Opposite responses in the proteome ofEscherichiacoli[J].Journal of Bacteriology,2001,183(21):6466-6477.

[3]Shu Liebo,Ding Wei,Wu Jinhong,et al.Proteomic analysis of rice leaves shows the different regulations to osmotic stress and stress signals[J].Journal of Integrative Plant Biology,2010,52(11):981-995.

[4]張艷軍,張萍華,周燦,等.不同濃度外源乙酸鈉對耐乙酸大腸埃希菌DA19代謝和關(guān)鍵酶酶活的影響[J].微生物學(xué)報,2016(5):15-20.

[5]Choi-Rhee E,Cronan J E.The biotin carboxylase-biotin carboxyl carrier protein complex ofEscherichiacoliacetyl-CoA carboxylase[J].The Journal of Biological Chemistry,2003,278(33):30806-30812.

[6]Polen T,Rittmann D,Wendisch V F,et al.DNA microarray analyses of the long-term adaptive response ofEsherichiacolito acetate and propionate[J].Applied and Environmental Micorbiology,2003,69:1759-1774.

[7]Baker L M,Poole L B.Catalytic mechanism of thiol peroxidase fromEscherichiacoli.Sulfenic acid formation and overoxidation of essential CYS61[J].The Journal of Biological Chemistry,2003,278(11):9203-9211.

[8]Lee J,Hiibel S R,Reardon K F,et al.Identification of stress-related proteins inEscherichiacoliusing the pollutantcis-dichloroethylene[J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(6):2088-2102.

[9]Isono K,Kitakawa M.Cluster of ribosomal protein genes inEscherichiacolicontaining genes for proteins S6,S18,and L9[J].PNAS,1978,75(12):6163-6167.

[10]楊君寧.大腸埃希氏菌TolC與OmpF、OmpC及其雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互關(guān)系的研究[D].廣州:中山大學(xué),2010.

[11]Arnold C N,McElhanon J,Lee A,et al.Global analysis ofEsherichiacoligene expression during the acetate-induced acid tolerance response[J].Journal of Bacteriology,2001,183:2178-2186.

[12]Bekhit A,Fukamachi T,Saito H,et al.The role of OmpC and OmpF in acidic resistance inEscherichiacoli[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin,2011,34(3):330-334.

[13]Von Meyenburg K,J?rgensen B B,Nielsen J,et al.Promoters of the atp operon coding for the membrane bound ATP synthase ofEscherichiacolimapped by Tn10 insertion mutations[J].Molecular and General Genetics,1982,188:240-248.

[14]賴平安,王金洛,徐建國,等.雞大腸桿菌traT基因的擴(kuò)增及TraT-DIG探針制備[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2004,31(3):235-240.

(責(zé)任編輯 薛 榮)

Effect of exogenous sodium acetate on proteomics of the acetate-tolerantEscherichiacoliDA19

ZHANG Yanjun， ZHAO Li

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

The acetate-tolerantEscherichiacoliDA19 was continuously cultured in nitrogen-limited defined media without or with the different concentration of sodium acetate. The proteins of DA19 at steady-state condition were separated by two-dimensional gel electrophoresis， and the proteins differently expressed at different concentration of sodium acetate were identified by mass spectrum. The results indicated that adding exogenous sodium increased significantly the expression level of acetyl-CoA carboxylase biotin carboxyl carrier protein subunit, aspartate semialdehyde dehydrogenase, thiol peroxidase, protein YgiW, outer membrane protein OmpC and hypothetical protein. But it decreased significantly the expression level of 50S ribosomal protein L9, fructose-bisphosphate aldolase, ATP synthase alpha subunit and conjugal transfer protein TraT. Based on the results of proteomic analysis, it was suggected that the acetate-tolerantEscherichiacoliDA19 coped with the exogenous sodium acetate stress by acetyl-CoA carboxylase biotin carboxyl carrier protein subunit, aspartate semialdehyde dehydrogenase, thiol peroxidase, protein YgiW and outer membrane protein OmpC were related to the acetate-tolerant ability of DA19.

Escherichiacoli; acetic acid; proteomic analysis; two-dimensional gel electrophoresis

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.010

?2016-12-20；

2017-03-13

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LQ12C01001)；金華市科學(xué)技術(shù)研究計劃項目(2014-2-042)；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(2015C32043)

張艷軍(1979-)，男，河北唐山人，講師，博士.研究方向：發(fā)酵工程.>

Q935

A

1001-5051(2017)03-0307-05