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      2,4—二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度

      2017-09-04 08:18:20萬海方黃焱明汪國香羅宏張相彩陶凡趙萃王振
      中國現(xiàn)代醫(yī)生 2017年20期
      關(guān)鍵詞:丁基二叔血藥濃度

      萬海方+黃焱明+汪國香+羅宏+張相彩+陶凡+趙萃+王振

      [摘要] 目的 建立以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度方法。 方法 血清樣品用乙腈-甲醇(75:25)混合液蛋白沉淀后取上清液進樣分析,以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo),采用UltimateRXB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以水(H3PO4調(diào)pH=1.8)-乙腈(70∶30)為流動相,流速1.5 mL/min,檢測激發(fā)波長270 nm。結(jié)果 該法專屬性高,回收率高,日內(nèi)日間RSD低。丙泊酚血藥濃度在0.2~10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9998),最低檢測濃度0.2970 mg/L。 結(jié)論 本方法測定丙泊酚濃度方便、快捷、準(zhǔn)確度好、精密度高,為開展血藥濃度檢測、藥動學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

      [關(guān)鍵詞] 丙泊酚;高效液相色譜法;血藥濃度;2,4-二叔丁基苯酚

      [中圖分類號] R614 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701(2017)20-0105-04

      [Abstract] Objective To establish a detecting method of propofol plasma concentration by HPLC with 2, 4-ditert-butyl phenol as internal standard. Methods The supernatant of serum samples were analyzed after protein precipitation by acetonitrile-methyl alcohol(75∶25) mixed liquor. With 2, 4-ditert-butyl phenol as internal standard, UltimateR XB-C18 chromatographic column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used. Water(H3PO4, pH=1.8)-acetonitrile(70∶30) was used as mobile phase, flow velocity=1.5 mL/min, and detecting excitation wave length=270 nm. Results This method had high specificity and recovery, with low intra-day and inter-day RSD. When the plasma concentration of propofol was between 0.2~10.0 mg/L, it showed a good linear relation(r2=0.9998), and the lower limit of detection was 0.2970 mg/L. Conclusion This method is convenient and speedy, with high accuracy and precision, providing a methodological basis for plasma concentration detection and pharmacokinetic research.

      [Key words] Propofol; HPLC; Plasma concentration; 2, 4-ditert-butyl phenol

      丙泊酚(propofol),2,6-二異丙基苯酚,又名異丙酚,是速效短效靜脈麻醉藥。近年來,國內(nèi)外有關(guān)丙泊酚藥物代謝動力學(xué)的研究較多[1-4],但未見丙泊酚應(yīng)用于結(jié)核性膿胸患者的藥動學(xué)研究。為開展該研究,為臨床麻醉合理使用丙泊酚提供依據(jù),本文建立了以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度?,F(xiàn)報道如下。

      1 儀器與試劑

      1.1 儀器

      Agilent 1200高效液相色譜儀(美國,Agilent),配有G1311A四元泵、G1315D紫外檢測器、G1329A型進樣器(配有20 μL 進樣環(huán))、G1316A柱溫箱和Agilent化學(xué)工作站;XS205 Dual Range分析天平(瑞士,Mettler Toledo);Mettler Toledo Delta 320 pH計(瑞士,Mettler Toledo);高速離心機(美國,Thermo Fisher);Barnstead TII超純水系統(tǒng)(美國,Thermo Fisher);-80℃冰箱(日本,SANYO)。

      1.2 藥品與試劑

      丙泊酚注射液(規(guī)格:200 mg/支,批號:AJ059)、丙泊酚對照品(日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn),規(guī)格:25 g,批號:ZR28L-FK,純度>98.0%);內(nèi)標(biāo):2,4-二叔丁基苯酚(北京百靈威科技有限公司生產(chǎn),規(guī)格:100 g,批號:LI200111,純度≥99.5%);色譜級乙腈和甲醇從美國天地公司購得,本文中其他所有分析級化學(xué)品均由天津永大化學(xué)試劑有限公司購得;實驗用超純水均由美國賽默飛世爾Barnstead TII 超純水系統(tǒng)純化制得。

      2 方法

      2.1 色譜條件

      色譜柱:UltimateRXB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,月旭材料科技有限公司),流動相:水(H3PO4調(diào)pH=1.8)-乙腈(70∶30);檢測波長:270 nm;柱溫:30℃;流速:1.5 mL/min;進樣量:10 μL。

      2.2 試驗溶液的制備

      2.2.1 稀釋液 乙腈-甲醇(75:25)。

      2.2.2 丙泊酚對照品溶液 精密稱取40.00 mg丙泊酚對照品至10 mL容量瓶中,用稀釋液溶解,定容至刻度;精密移取上述溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中,用稀釋液定容至刻度,搖勻,待用。

      2.2.3 2,4-二叔丁基苯酚儲備液 精密稱取10.00 mg 2,4-二叔丁基苯酚對照品至10 mL容量瓶中,用稀釋液溶解,定容至刻度。

      2.2.4 2,4-二叔丁基苯酚對照品溶液 精密移取2,4-二叔丁基苯酚儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中,用稀釋液定容至刻度,搖勻,待用。

      2.3 血樣處理

      取出存放在-80 ℃冰箱中血樣,室溫解凍后取血樣400 μL,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)2,4-二叔丁基苯酚儲備液,590 μL 稀釋液,渦旋5 min,2000 g離心15 min,取上層清液進樣。

      2.4 方法專屬性實驗

      取空白血樣400 μL,加入600 μL 稀釋液,渦旋5 min,2000 g離心15 min,取上層清液進樣,得空白血清色譜圖1A,將一定濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)加入空白血清,按2.3項操作得色譜圖1B,受試者注射丙泊酚后,同法操作,得色譜圖1C,可見丙泊酚與內(nèi)標(biāo)2,4-二叔丁基苯酚的保留時間分別為6.65 min和10.67 min,兩者峰形良好,分離完全,理論塔板數(shù)按丙泊酚計算不低于14 837。

      3 結(jié)果

      3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

      取丙泊酚對照品,配制成濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。以丙泊酚的濃度(X)為橫坐標(biāo),丙泊酚的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=3.2733X-0.1223(r2=0.9998)。定量下限為0.2 mg/L。見圖2。

      3.2 回收率試驗

      取空白血清加入丙泊酚對照品,制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品,各5份,按照2.3項下方法操作,進樣測定,計算回收率,結(jié)果見表1。

      3.3 精密度試驗

      取空白血清,加入丙泊酚對照品,制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品,各5份,按照2.3項下方法操作,1 d內(nèi)重復(fù)測定5次,以測定日內(nèi)RSD。另取上述不同濃度的血清樣品,同樣處理,每日測定1次,重復(fù)測定5 d,以測定日間RSD,結(jié)果見表1。

      3.4 臨床樣品準(zhǔn)備

      胸外科結(jié)核性膿胸住院手術(shù)患者10例,年齡27~63歲,體重47~63.5 kg,1%丙泊酚按2 mg/kg的劑量單次靜脈給予,20 s注射完畢,分別于給藥結(jié)束后2、4、6、8、10、15、20、30、60、90 min通過橈動脈測壓管采動脈血1.5 mL,分離血清,存放在-80℃冰箱中,測定丙泊酚血藥濃度。結(jié)果見圖3。

      4討論

      結(jié)核病嚴(yán)重影響人民健康,是我國重點防治疾病之一[5]。對結(jié)核性膿胸及時、準(zhǔn)確的診斷和有效的治療,不僅有利于患者健康,而且對消除傳染源、控制結(jié)核病流行起重要的作用。近年來結(jié)核性膿胸的發(fā)病有所增加,并且出現(xiàn)了耐藥菌,通過外科手術(shù)治療方法對患者的病灶給予清除,以達到縮短療程、治愈的目的[6-9]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥[10,11],其起效快,作用時間短,且麻醉后舒適感較好,是胸外科結(jié)核性膿胸患者靜脈麻醉首選藥物,還廣泛用于無痛腸鏡、無痛胃鏡檢查以及無痛人工流產(chǎn)術(shù)和重癥監(jiān)護室鎮(zhèn)靜等。近年來,丙泊酚濃度測定及藥物代謝動力學(xué)研究較多,測定丙泊酚血藥濃度對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[12]、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[14]。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強、所需樣品量少,但儀器設(shè)備較昂貴,難以普及推廣。在高效液相色譜法中,電化學(xué)和二極管陣列檢測法國內(nèi)應(yīng)用較少。目前文獻報道的高效液相色譜法主要有高效液相-紫外檢測法(HPLC UV)、高效液相-熒光檢測法(HPLC Flu)。為適應(yīng)臨床藥代動力學(xué)研究的需要,本實驗室經(jīng)過色譜條件、內(nèi)標(biāo)確立和流動相的選擇、方法專屬性實驗等研究建立測定人血漿中丙泊酚濃度的方法,以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚濃度。

      本實驗以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚血漿藥物濃度,該方法簡單、易行、可重復(fù)。雖然質(zhì)譜法檢測丙泊酚血藥濃度在很多研究中使用,但由于質(zhì)譜設(shè)備昂貴,很多實驗室還沒有該設(shè)備[15,16]。研究報告顯示高效液相色譜法甚至可以與質(zhì)譜法達到相近的定量下限[17]。

      本實驗樣品預(yù)處理方法選擇乙腈-甲醇(75∶25)混合液蛋白沉淀法,較萃取法簡單,并且不需要大量的有機溶劑如環(huán)己烷、氯仿-乙酸乙酯混合液[18,19],也不需要花費昂貴的試劑盒[14]。流動相選用水(H3PO4 調(diào)pH=1.8)-乙腈(70∶30)時,丙泊酚和2,4-二叔丁基苯酚內(nèi)標(biāo)出峰時間合理,色譜峰形理想,而當(dāng)采用三氟乙酸調(diào)節(jié)水pH值時,雖然出峰時間合理,但色譜圖中基線不穩(wěn)定。血中代謝物質(zhì)和其他內(nèi)源性物質(zhì)的峰均不干擾丙泊酚的測定,說明該方法具有較高的專屬性。

      本方法測定丙泊酚濃度方便快捷,一天可以檢測完10例患者的100個血樣,臨床樣品測定結(jié)果表明,丙泊酚2 mg/kg 靜脈注射后2、4、6、8、10、15 min的平均血藥濃度與吳健等[20]報道的接近。該法檢測到最低濃度為0.2970 mg/L,靈敏度高,可滿足臨床藥動學(xué)研究需要,為開展血藥濃度檢測、藥代學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

      總之,以2,4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚在結(jié)核性膿胸患者血漿藥物濃度可行、方便,準(zhǔn)確,能夠為臨床合理使用該藥物提供依據(jù)。

      [參考文獻]

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      (收稿日期:2017-05-03)

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