EpCAM蛋白激活DC誘導(dǎo)抗原特異性CTL治療卵巢癌的實驗研究

楊曉東 趙衛(wèi)東 席玉玲

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥230001)

·生物治療·

EpCAM蛋白激活DC誘導(dǎo)抗原特異性CTL治療卵巢癌的實驗研究

楊曉東 趙衛(wèi)東 席玉玲①

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥230001)

目的：探討EpCAM蛋白激活樹突細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD8+CTL)進(jìn)行卵巢癌免疫治療的效果，為卵巢癌的臨床治療提供幫助。方法：利用EpCAM蛋白誘導(dǎo)成熟DC同時檢測DC表面分子和白介素(IL)- 10與IL- 12表達(dá)量的變化，隨后通過EpCAM- DC誘導(dǎo)EpCAM抗原特異性CD8+CTL，繼而檢測EpCAM- DC- CD8+CTL對正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80和卵巢癌細(xì)胞SKVO3的殺傷效果，同時檢測干擾素(IFN)- γ釋放量。隨后進(jìn)一步檢測EpCAM- DC- CD8+CTL對卵巢癌移植裸鼠的腫瘤抑制程度，并通過病理學(xué)染色檢測治療后腫瘤組織變化情況。結(jié)果：與PBS刺激相比，EpCAM蛋白能夠顯著上調(diào)DC表面分子DC80、DC83、DC86和HLA- DR水平，依次達(dá)到4.79、4.85、4.60和10.91倍；同時EpCAM蛋白顯著提高IL- 12釋放和顯著抑制IL- 10分泌(P<0.05)。DC- CD8+CTL與EpCAM- DC- CD8+CTL均引起少量IOSE80細(xì)胞凋亡(P>0.05)，但EpCAM- DC- CD8+CTL對SKVO3細(xì)胞殺傷率是DC- CD8+CTL的6.82倍(P<0.05)。動物實驗表明，經(jīng)EpCAM- DC- CD8+CTL治療后，BALB/c- nu/nu卵巢癌移植腫瘤體積比明顯低于PBS組以及DC- CD8+CTL組，分別達(dá)到0.27和0.28倍(P<0.05)。HE染色顯示 EpCAM- DC- CD8+CTL治療導(dǎo)致腫瘤組織出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。結(jié)論：EpCAM蛋白刺激促進(jìn)了DC成熟繼而誘導(dǎo)產(chǎn)生EpCAM特異性CD8+CTL，EpCAM- DC- CD8+CTL能夠高效的殺傷腫瘤細(xì)胞并延遲腫瘤生長，對卵巢癌臨床免疫治療具有重要意義。

卵巢癌；免疫治療；EpCAM；DC；CTL

卵巢癌是女性中常見的生殖器官惡性腫瘤，是女性中死亡率最高的腫瘤之一。對女性的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅[1,2]。手術(shù)、化療以及放療由于自身的局限性限制了其癌癥治療的效果，尋找特異性的卵巢癌治療方案成為廣大醫(yī)療工作者研究的重點[3]。腫瘤免疫治療由于特異性強(qiáng)、治療效果明顯以及副作用低而受到了人們的關(guān)注[4]。EpCAM具有良好的腫瘤特異性，在腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)，使其成為腫瘤免疫治療的理想靶點，推動了腫瘤免疫治療的進(jìn)行[5]。本研究通過EpCAM蛋白刺激而獲得能夠呈遞EpCAM抗原的成熟DC細(xì)胞，后者進(jìn)一步刺激T細(xì)胞而獲得能夠識別EpCAM蛋白的抗原特異性CD8+CTL細(xì)胞，并探討了EpCAM特異性CD8+CTL的抗腫瘤特性，為卵巢癌的臨床免疫治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 SKVO3細(xì)胞(人卵巢癌細(xì)胞系)和IOSE80細(xì)胞(人正常卵巢細(xì)胞系)購于美國ATCC，RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基購于美國Cyagen;10%胎牛血清(FBS)購于天杭生物科技有限公司;粒細(xì)胞- 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM- CSF)、EpCAM抗原、IL- 12和IL- 10酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購于武漢默沙克生物科技有限公司;TNF- α、人IFN- γELISpot試劑盒、磁珠分選試劑盒(eBioscience)購于美國BD公司;Attune NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀(ThermoFisher)及相關(guān)抗體購于美國BD公司;BS- 1101酶標(biāo)分析儀購于南京德鐵實驗設(shè)備有限公司;CCK- 8試劑購于日本同仁化學(xué)研究所，游標(biāo)卡尺購于臺灣寶工工具有限公司;BALB/c- nu/nu裸鼠(4周)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2004- 0001。裸鼠飼養(yǎng)及動物實驗嚴(yán)格按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 EpCAM蛋白誘導(dǎo)成熟DC 采集健康志愿者新鮮外周血10 ml，室溫下2 000 r/min離心20 min，收集處于上層和中層間的白色狹窄細(xì)胞帶，并培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁2 h后，添加RPMI1640培養(yǎng)基2 ml，之后加入IL- 4 (500 U/ml)以及GM- CSF(1 000 U/ml)，培養(yǎng)至第3天，分成2組，一組加入PBS，另一組加入EpCAM抗原，培養(yǎng)至第6天時候加入1 000 U/ml TNF- α，刺激DC成熟后，在第7～8天收獲EpCAM- DC和成熟DC。未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)至另一個6孔培養(yǎng)板，加入2 ml RPMI1640(含10%FBS)，同時加入50 ng/ml IL- 4以及100 ng/ml GM- CSF，進(jìn)行T細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 DC表型檢測 收集成熟DC以及EpCAM- DC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，培養(yǎng)后加入CD80、DC83、DC86和HLA- DR抗體進(jìn)行標(biāo)記，之后加入二抗羊抗小鼠IgG- FITC孵育，最后用Attune NxT聲波聚焦流式細(xì)胞儀(ThermoFisher)進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。

1.2.3 IL- 10和IL- 12檢測 將4×105個/ml成熟DC和EpCAM- DC細(xì)胞分別接種于6孔板中，培養(yǎng)至第2天收集細(xì)胞上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL- 10和IL- 12，吸光度由BS- 1101酶標(biāo)分析儀測定，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL- 10和IL- 12濃度，操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 CD8+CTL的體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 成熟DC以及EpCAM- DC經(jīng)0.25 Gy γ射線照射后制備刺激細(xì)胞，按T細(xì)胞∶DC為10∶1比例進(jìn)行共培養(yǎng)，同時加入 50 U/ml 的IL- 2，培養(yǎng)7 d，重復(fù)上述操作3次。收獲CTL細(xì)胞，然后孵育CD8抗體，通過磁珠分選試劑盒(eBioscience)篩選CD8+CTL，相關(guān)操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) SKVO3細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，同時加入10%胎牛血清FBS；IOSE80細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，同時加入10%FBS；待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

1.2.6 CD8+CTL腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)檢測 DC- CD8+CTL和EpCAM- DC- CD8+CTL分別和IOSE80與SKVO3細(xì)胞以40∶1的比例進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，加入10 μl CCK- 8試劑，通過BS- 1101酶標(biāo)分析儀測定吸光度，并計算相關(guān)細(xì)胞凋亡率，操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.7 ELISPOT檢測IFN- γ 將IFN- γ抗體(Abc- am)預(yù)包被96孔板，加入DC- CD8+CTL和EpCAM- DC- CD8+CTL分別和IOSE80與SKVO3細(xì)胞共培養(yǎng)，單獨CD8+CTL作陰性對照，植物血凝素刺激的CD8+CTL作陽性對照，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行顯色，然后計算IFN- γ陽性斑點數(shù)目，操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。

1.2.8 建立裸鼠卵巢癌模型 將100 μl SKVO3細(xì)胞(1×106個)接種于裸鼠背部，飼養(yǎng)形成卵巢癌荷瘤裸鼠。待腫瘤體積長至80 mm3時進(jìn)行治療實驗。

1.2.9 CD8+CTL免疫治療卵巢癌荷瘤小鼠 將18只卵巢癌荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組：PBS組、DC- CD8+CTL組與EpCAM- DC- CD8+CTL組，每組各6只；PBS組裸鼠尾靜脈注射100 μl PBS，DC- CD8+CTL組裸鼠尾靜脈注射100 μl DC- CD8+CTL(2×107個)，EpCAM- DC- CD8+CTL組裸鼠尾靜脈注射100 μl EpCAM- DC- CD8+CTL (2×107個)，每組裸鼠間隔一周進(jìn)行1次治療。

1.2.10 腫瘤體積檢測 應(yīng)用游標(biāo)卡尺定期測量3組荷瘤裸鼠腫瘤長短直徑，并計算各組裸鼠腫瘤體積，計算公式：腫瘤體積=(L×W2)/2，W表示腫瘤短直徑，L表示腫瘤長直徑。

1.2.11 腫瘤組織病理學(xué)檢測 經(jīng)不同方案治療22 d的荷瘤裸鼠處死，收集腫瘤組織進(jìn)行石蠟切片機(jī)蘇木精- 伊紅(HE)染色，詳細(xì)程序嚴(yán)格按照HE染色程序與石蠟切片程序進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 EpCAM刺激對DC細(xì)胞表面分子的影響 流式細(xì)胞分析顯示EpCAM刺激的DC細(xì)胞表面分子CD80、DC83、DC86和HLA- DR陽性細(xì)胞率顯著升高，依次達(dá)到PBS刺激的表面分子陽性細(xì)胞的4.79、4.85、4.60和10.91倍(P<0.05)，說明EpCAM刺激有利于DC細(xì)胞的抗原呈遞，見圖1。

2.2 EpCAM刺激DC釋放IL- 10和IL- 12情況ELISA檢測結(jié)果說明EpCAM能夠顯著抑制DC釋放IL- 10，EpCAM- DC組IL- 10水平是DC組的0.83倍(P<0.05)；然而EpCAM顯著促進(jìn)DC釋放IL- 12，EpCAM- DC組IL- 12水平是DC組的1.48倍(P<0.05)，見圖2。

圖1 EpCAM刺激對DC細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響Fig.1 Effect of EpCAM stimulation on surface markers of DC cellsNote: A.Effects of EpCAM stimulation on surface phenotype of DC by flow cytometry;B.Statistical analysis of DC surface phenotype positive cells.Compared with DC group,*.P<0.05.

2.3 CD8+CTL與IOSE80或SKVO3培養(yǎng)后IFN- γ釋放情況 酶聯(lián)免疫斑點實驗顯示，DC- CD8+CTL和EpCAM- DC- CD8+CTL分別與正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80共培養(yǎng)后，IFN- γ斑點數(shù)量相近，差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)；而EpCAM- DC- CD8+CTL與人卵巢癌細(xì)胞SKVO3共培養(yǎng)后，IFN- γ斑點數(shù)量顯著高于DC- CD8+CTL組斑點數(shù)目，同時其顯著高于EpCAM- DC- CD8+CTL與IOSE80共培養(yǎng)的IFN- γ的斑點數(shù)量(P<0.05)，見圖3。

2.4 CD8+CTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況 應(yīng)用CCK- 8檢測CD8+CTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，DC- CD8+CTL與EpCAM- DC- CD8+CTL分別誘導(dǎo)IOSE80的細(xì)胞凋亡率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與DC- CD8+CTL相比，EpCAM- DC- CD8+CTL能夠顯著提高卵巢癌細(xì)胞SKVO3凋亡率，其凋亡率增加6.82倍，EpCAM- DC- CD8+CTL誘導(dǎo)SKVO3的凋亡率是誘導(dǎo)IOSE80的凋亡率的6.37倍(P<0.05)，見圖4。

圖2 EpCAM刺激對DC釋放IL- 10與IL- 12的影響Fig.2 Effect of EpCAM stimulation on DC release of IL- 10 and IL- 12Note: Compared with DC group,*.P<0.05.

圖3 CD8+ CTL和IOSE80或SKVO3細(xì)胞培養(yǎng)后IFN- γ釋放情況Fig.3 Released of IFN- γ after CD8+ CTL and IOSE80 or SKVO3 cell cultureNote: Compared with DC- CD8+ CTL in the incubation of SKVO3,*.P<0.05;compared with EpCAM- DC- CD8+ CTL in the incubation of IOSE80,#.P<0.05.

圖4 CD8+ CTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況Fig.4 CD8+ CTL induced apoptosisNote: Comparison of SKVO3 incubation with DC- CD8+ CTL,*.P<0.05;comparison of IOSE80 incubation with EpCAM- DC- CD8+ CTL,#.P<0.05.

圖5 各組荷瘤小鼠經(jīng)免疫治療后腫瘤體積變化情況Fig.5 Changes of tumor volume after immunotherapy in each group of miceNote: Compared with PBS group,*.P<0.05;compared with DC- CD8+ CTL group,#.P<0.05.

圖6 CD8+ CTL治療后BALB/c- nu/nu腫瘤組織HE染色Fig.6 HE staining of BALB/c- nu/nu tumor after CD8+ CTL treatment

2.5 CD8+CTL免疫治療對BALB/c- nu/nu裸鼠卵巢癌腫瘤體積影響 免疫治療前，各組BALB/c- nu/nu裸鼠腫瘤體比較差異不明顯(P>0.05)；PBS處理后BALB/c- nu/nu裸鼠腫瘤體積明顯增加，達(dá)到28.45倍，BALB/c- nu/nu裸鼠經(jīng)DC- CD8+CTL處理后，腫瘤體積明顯增加，達(dá)到27.34倍，腫瘤體積比比較無差異(P>0.05)。BALB/c- nu/nu荷瘤小鼠經(jīng)過EpCAM- DC- CD8+CTL處理后，腫瘤體積緩慢增加，達(dá)到治療前的7.54倍，其腫瘤體積比明顯低于PBS組以及DC- CD8+CTL組(P<0.05)，見圖5。

2.6 荷瘤小鼠經(jīng)CD8+CTL治療后腫瘤組織HE染色 BALB/c- nu/nu荷瘤鼠經(jīng)PBS與DC- CD8+CTL處理后，腫瘤組織HE染色結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞排列緊密同時核仁明顯，未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。EpCAM- DC- CD8+CTL處理后的腫瘤組織細(xì)胞核出現(xiàn)明顯固縮同時細(xì)胞間隙增大，并且出現(xiàn)明顯的水腫和空泡現(xiàn)象,見圖6。

3 討論

卵巢癌是女性中常見的生殖器官惡性腫瘤，多發(fā)于35歲以上的中年女性，且死亡率在女性婦科腫瘤中占首位[6]。目前，卵巢癌具有較高的死亡率，并且早期診斷困難，易錯過最佳治療時機(jī)，同時出現(xiàn)癌癥轉(zhuǎn)移[7]。對患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅。手術(shù)、化療以及放療由于自身的局限性限制了其癌癥治療的效果，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時對身體造成嚴(yán)重的損傷[8]。如何特異性地進(jìn)行癌癥治療成為了癌癥治療的關(guān)鍵。免疫治療是一種先進(jìn)的癌癥治療方式，具有特異性高、副作用小以及腫瘤殺傷效果明顯的特點，受到了人們的廣泛關(guān)注[9,10]。腫瘤免疫治療能夠通過提高免疫細(xì)胞的腫瘤抗原識別能力以及殺傷敏感性，免疫細(xì)胞回輸后，能夠提高機(jī)體固有免疫功能，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，同時減少了機(jī)體的損傷[11,12]。然而合適的腫瘤識別靶點是保證免疫治療成功實施的關(guān)鍵[13]。EpCAM是一種鈣離子非依賴性的是嗜同種上皮細(xì)胞間黏附分子，在上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而卵巢腫瘤以卵巢上皮癌最為常見，因此EpCAM是上皮源性惡性腫瘤的理想標(biāo)志物[14]。相關(guān)研究表明，EpCAM是一種理想的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，對癌癥的治療具有重要的幫助作用。

本研究通過EpCAM抗原刺激DC獲得可以呈遞EpCAM抗原的成熟DC細(xì)胞，后者進(jìn)一步刺激T細(xì)胞而得到能夠特異識別EpCAM蛋白的CTL細(xì)胞，分離EpCAM抗原特異性CD8+CTL用于卵巢癌免疫治療。研究表明，成熟前DC高效識別腫瘤抗原，從而促進(jìn)其成熟，繼而增強(qiáng)了其抗原呈遞能力，有利于激活T細(xì)胞而獲得抗原特異性CD8+CTL[15]?？乖蔬f能力EpCAM蛋白刺激提高了DC表明分子CD80、CD83、CD86以及HLA- DR水平，CD83的升高表明了DC的成熟，CD83和CD86水平的升高有利于DC與T細(xì)胞的識別，而HLA- DR水平升高有利于激活T細(xì)胞，獲得EpCAM特異性CD8+CTL，保證了免疫治療的進(jìn)行，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的殺傷[16]。IL- 12介導(dǎo)初始免疫反應(yīng)以及繼發(fā)免疫反應(yīng)，同時觸發(fā)Th1反應(yīng)，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子；IL- 12可以誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN- γ，達(dá)到殺傷卵巢癌細(xì)胞的目的。然而DC分泌的IL- 10能夠抑制Th1反應(yīng)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避，影響了腫瘤免疫治療的效果[17,18]。EpCAM蛋白刺激后，DC高表達(dá)IL- 12，同時低表達(dá)IL- 10，因此，EpCAM蛋白的刺激促進(jìn)了Th1反應(yīng)的發(fā)生。卵巢癌細(xì)胞殺傷實驗說明EpCAM- DC- CD8+CTL可以有效殺傷卵巢癌細(xì)胞SKVO3，而對IOSE80正常卵巢上皮細(xì)胞殺傷效果較低。動物實驗進(jìn)一步表明EpCAM- DC- CD8+CTL能夠損傷腫瘤細(xì)胞，減緩腫瘤的發(fā)展。EpCAM- DC- CD8+CTL能夠通過EpCAM有效識別卵巢癌上皮細(xì)胞，通過釋放穿孔素破壞腫瘤細(xì)胞膜，同時釋放顆粒酶激活caspases信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；同時EpCAM- DC- CD8+CTL表明的FasL和腫瘤細(xì)胞的Fas相互識別，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞程序性死亡；達(dá)到治療卵巢癌的目的[19,20]。以EpCAM為靶點的腫瘤免疫治療對卵巢癌的治療具有重要的幫助。

綜上所述，本研究通過EpCAM刺激DC成熟，DC進(jìn)一步刺激T細(xì)胞而獲得EpCAM特異性CD8+CTL用于卵巢癌免疫治療。EpCAM刺激后，成熟的DC表明標(biāo)記物及IL- 12表達(dá)量顯著升高，但I(xiàn)L- 10表達(dá)量顯著降低；EpCAM- DC誘導(dǎo)的EpCAM特異性CD8+CTL具有特異性的卵巢癌殺傷能力，顯著抑制移植腫瘤的發(fā)展。對卵巢癌的免疫治療具有重要臨床意義。

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[收稿2016- 11- 23]

(編輯 張曉舟)

Experimental study on ovarian cancer immunotherapy by EpCAM activated dendritic cells induce antigen- specific CD8+cytotoxic T lymphocytes

YANG Xiao- Dong,ZHAO Wei- Dong,XI Yu- Ling.

Department of Gynaecology and Obstetrics,Anhui Provinical Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001,China

Objective:To observe the effect on ovarian cancer immunotherapy by dendritic cells (DC) which activated by Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) induce antigen- specific CD8+cytotoxic T lymphocytes (CTL) and to provide some help to ovarian cancer immunotherapy.Methods: Interleukin (IL)- 12,and IL- 10 of DC were tested after inducing by EpCAM.Subsequently,EpCAM specific CTL CD8+was induced by EpCAM- DC.The therapeutic effect and interferon (IFN)- γ of EpCAM- DC- CD8+CTL on normal ovarian epithelial cells IOSE80 and ovarian cancer cell SKVO3 was detected.After treatment of EpCAM- DC- CD8+CTL,the volume of ovarian tumor of bearing BALB/c- nu/nu mice was detected.Meanwhile,the morphology changes of tumor tissue were observed by HE staining.Results: Compared with PBS,EpCAM stimulation significantly inceased surface markers DC80,DC83,DC86 and HLA- DR levels,and added up to 4.79,4.85,4.60 and 10.91 times (P<0.05).EpCAM stimulation significantly increased the expression of IL- 12 and reduced the secretion of IL- 10 (P<0.05).Both of DC- CD8+CTL and EpCAM- DC- CD8+CTL resulted in minute amount of IOSE80 cell killing (P>0.05).However,the killing rate of EpCAM- DC- CD8+CTL on SKVO3 cells was 6.82- folds as much as that of DC- CD8+CTL.Animal experiments showed that ovarian cancer transplantation tumor volume ratio after EpCAM- DC- CD8+CTL treatment,was significantly lower than PBS group and DC- CD8+CTL group,which reached 0.27 and 0.28 times,respectively (P<0.05).HE staining showed that EpCAM- DC- CD8+CTL treatment resulted in significant changes of tumor tissues in pathology.Conclusion: EpCAM protein stimulated the maturation of DC that induced the production of EpCAM specific CD8+CTL.EpCAM- DC- CD8+CTL can effectively kill ovarian tumor cells and delay the growth of tumor,which is of great significance for the immunotherapy of ovarian cancer.

Ovarian cancer;Immunotherapy;EpCAM;DC;CTL

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.012

楊曉東(1983年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科相關(guān)疾病診治方面的研究，E- mail：yangxiaodong343@163.com。

及指導(dǎo)教師：趙衛(wèi)東(1970年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事婦科微創(chuàng)手術(shù)及婦科惡性腫瘤綜合治療方面的研究，E- mail：4899511@qq.com。

R737.31

A

1000- 484X(2017)08- 1181- 05

①蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，蚌埠233004。