• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙曲霉Bem46基因敲除株構(gòu)建及其功能初步研究

    2017-09-03 10:17:28李佳娟馮文莉
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)山梨醇二者

    李 雯,李佳娟,馮文莉,馬 彥

    煙曲霉Bem46基因敲除株構(gòu)建及其功能初步研究

    李 雯,李佳娟,馮文莉,馬 彥

    目的構(gòu)建煙曲霉Bem46基因敲除株,初步明確Bem46基因在煙曲霉生長(zhǎng)出芽和各種壓力傳導(dǎo)中的作用,以及對(duì)細(xì)胞壁形成的影響。方法采用生物信息學(xué)方法查找煙曲霉中Bem46基因,設(shè)計(jì)引物,并以pyrG作為篩選標(biāo)記構(gòu)建煙曲霉Bem46基因敲除株(ΔBem46)。觀察含不同壓力物質(zhì)培養(yǎng)基上對(duì)照菌株和ΔBem46徑向生長(zhǎng)速度,觀察兩菌株發(fā)芽狀況以及在含有細(xì)胞壁抑制劑培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果通過(guò)序列比對(duì)在煙曲霉基因組中找到了Bem46基因,其編號(hào)為Afu7g04660,由1 116 bp堿基組成,編碼311個(gè)氨基酸。使用原生質(zhì)體法得到煙曲霉ΔBem46并經(jīng)PCR和Southernblot確認(rèn)。經(jīng)觀察在含有山梨醇作為滲透壓力來(lái)源的培養(yǎng)基上ΔBem46生長(zhǎng)明顯較對(duì)照菌株快。顯微鏡下觀察到在GMM液體培養(yǎng)基中,ΔBem46發(fā)芽速度慢于對(duì)照株。結(jié)論煙曲霉Bem46基因涉及由山梨醇引起的滲透壓壓力傳導(dǎo),并且該基因?qū)Υ龠M(jìn)孢子發(fā)芽可能有作用。

    Bem46;煙曲霉;發(fā)芽率;信號(hào)傳導(dǎo)

    煙曲霉是自然界常見(jiàn)的一種絲狀真菌,在正常人群并不會(huì)由于經(jīng)常暴露于煙曲霉而發(fā)生感染。然而近年來(lái)隨著新技術(shù)的開(kāi)展和免疫抑制劑的應(yīng)用,免疫力低下的患者往往由于暴露于煙曲霉而引起侵襲性曲霉病的發(fā)生,其發(fā)病率在臨床呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)且病死率極高,因此探討煙曲霉感染的發(fā)病機(jī)制刻不容緩。煙曲霉致病同多種因素有關(guān),而菌株在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)芽,快速適應(yīng)宿主環(huán)境是致病的重要環(huán)節(jié)[1]。出芽蛋白Bem46是α/β水解酶超家族成員,在進(jìn)化上相對(duì)保守,在模式真菌粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)中出芽蛋白Bem46在其子囊孢子發(fā)芽及菌絲形成的過(guò)程中有重要作用[2]。該基因在常見(jiàn)的致病真菌如白念珠菌、煙曲霉中的作用目前尚不了解,為了進(jìn)一步了解其在煙曲霉致病中的作用,幫助我們深入了解煙曲霉的致病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)可能的新藥物靶點(diǎn),我們對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的研究。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和質(zhì)粒 煙曲霉Ku80作為對(duì)照菌株,煙曲霉轉(zhuǎn)化用宿主菌為Ku80 pyrG-,該菌株為嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷株,在沒(méi)有尿苷和尿嘧啶的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。篩選標(biāo)記pyrG來(lái)源于質(zhì)粒pJW24(由杜克大學(xué)William J. Steinbach教授贈(zèng)送)。

    1.2 培養(yǎng)基 GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1L):20×鹽溶液50 mL,微量元素液1 mL,D-葡萄糖10 g,瓊脂15 g(1.5%),pH值6.5;溶壁酶: Vinoflow FCE (Novozymes公司);Osmotic Media:1.2 mol/L MgSO4, 10 mmol/L sodium phosphate,4 ℃保存;STC溶液:1.2 mol/Lsorbitol, 10 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,在4 ℃保存;PEG-CaCl2溶液:60% PEG, 50 mmol/L CaCl2, 50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5在室溫(25 ℃)保存。0.7%頂層瓊脂培養(yǎng)基(SMM) : 20×鹽溶液 50 mL,微量元素液1 mL,葡萄糖10 g,瓊脂7 g,山梨醇218.6 g,酵母提取物 1g,pH值6.5,加水至1 L,高壓滅菌20 min。

    1.3 生物信息學(xué)分析 在煙曲霉基因組中(www.aspergillusgenome.org)找出與N.crassa同源的Bem46基因開(kāi)放讀碼框及其上下游各約1 000 bp序列,進(jìn)行分析,并與常見(jiàn)致病真菌進(jìn)行同源性比對(duì)。

    1.4 構(gòu)建Bem46基因敲除株

    1.4.1Bem46基因克隆及敲除載體的構(gòu)建 煙曲霉Ku80 pyrG-在過(guò)夜培養(yǎng),收集菌絲;采用冷凍干燥法提取基因組DNA。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Bem46基因5′和3′側(cè)翼序列各約1.0 kb的DNA序列。使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI,SalI,XbaI和BamHI,將相應(yīng)克隆片段連接入質(zhì)粒pJW24,最后得到目的片段產(chǎn)物大小4 869 bp,定量5μg后進(jìn)行煙曲霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。試驗(yàn)中用到的引物見(jiàn)表1。

    1.4.2 原生質(zhì)體法構(gòu)建Bem46基因敲除株 Ku80 pyrG-菌懸液2 mL,30 ℃,250 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)(16~20 h)。40mLOsmotic Media中溶解3 g Vinoflow FCE,加入收集的菌絲并混勻,28 ℃,75 r/min搖床培養(yǎng)3~4 h。4 ℃,3 500 r/min離心10 min,吸出離心管夾層的原生質(zhì)體,并加3倍體積的STC混勻,離心。吸出原生質(zhì)體層,用1 mL的STC重懸原生質(zhì)體。取5 μg的融合酶切產(chǎn)物加入到200 μL的原生質(zhì)體中,冰上靜置1 h。將200 μLDNA-原生質(zhì)體放入到1.25 mL的PEG-CaCl2中混勻,室溫(25 ℃)放置20 min,加入4 mLSTC混勻,取400 μL與10 mL SMM頂層培養(yǎng)基混合后鋪板,放置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

    1.5 Bem46基因敲除株驗(yàn)證

    1.5.1 首先使用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證 在GMM液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)化子,并提取基因組DNA。并設(shè)計(jì)相關(guān)引物進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證用引物見(jiàn)表1。1.5.2 通過(guò)Southernblot進(jìn)行驗(yàn)證 設(shè)計(jì)探針,具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。探針設(shè)計(jì)上下游引物序列命名為Bem46-probe-F,Bem46-probe-R 具體序列見(jiàn)表1。

    1.6 Bem46相關(guān)功能研究

    1.6.1 Ku80與ΔBem46在不同生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況對(duì)比。生長(zhǎng)條件分別為:37 ℃時(shí)GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含卡泊芬凈(1 μg/mL和4 μg/mL)和尼可霉素(1 μg/mL)的培養(yǎng)基、含過(guò)氧化氫(1 mmol/L, 2 mmol/L,3 mmol/L)和甲酰胺(10 μmol/L和50 μmol/L)的培養(yǎng)基、含有氯化鈉(1 mol/L)和山梨醇(1.2 mol/L)的培養(yǎng)基,及55 ℃時(shí)GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別將Ku80與ΔBem46孢子10 μL( 1×106個(gè))點(diǎn)種于平皿中央,每日記錄菌落直徑,并拍照。

    1.6.2 孢子發(fā)芽率實(shí)驗(yàn) 分別取100 μL濃度為1×107個(gè)/mL的Ku80及ΔBem46菌懸液,并分別加入到10 mL的GMM液體培養(yǎng)基,在37 ℃以200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床孵育。從腫脹孢子階段(大約4 h)開(kāi)始,每30 min在顯微鏡下觀察一次,并計(jì)數(shù)孢子的發(fā)芽百分率,重復(fù)3次。

    1.6.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 采用SPSS22.0重復(fù)測(cè)量方差分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 在煙曲霉基因組中通過(guò)序列比對(duì)找到了Afu7g04660,1 116 bp個(gè)堿基編碼311個(gè)氨基酸。380-715堿基間編碼水解酶的保守區(qū)域。在細(xì)胞極性,孢子發(fā)芽,以及定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜都有重要的意義。序列比對(duì)見(jiàn)圖1,可知煙曲霉Bem46基因同常見(jiàn)致病菌種的同源基因有較強(qiáng)的同源性。

    2.2 構(gòu)建Bem46基因敲除載體結(jié)構(gòu) 如圖2Bem46全基因使用篩選標(biāo)記pyrG替代。設(shè)計(jì)探針并使用KpnI酶切, Suthernblot驗(yàn)證時(shí)在對(duì)照菌株和ΔBem46產(chǎn)生不同條帶,分別為4.8 kb和2.3 kb。

    2.3 基因敲除株驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化煙曲霉共得到6株轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證主要通過(guò)PCR法和Southernblot進(jìn)行驗(yàn)證。

    表1 試驗(yàn)中使用到的引物Tab.1 Primer were used in the construction of ΔBem46

    圖1 煙曲霉,構(gòu)巢曲霉,白念珠菌和粗糙脈孢霉中 Bem46基因序列同源性比對(duì)Fig.1 Homologous sequence alignment results of Bem46 gene among the A. fumigatus, A. nidulans, Candida albicans and Neurospora crassa

    圖2 構(gòu)建Bem46基因敲除載體示意圖Fig.2 Strategy for deleting Bem46 gene by replacing with pyrG gene by homologous recombination

    2.3.1 驗(yàn)證 根據(jù)Bem46序列設(shè)計(jì)了如下引物擴(kuò)增和驗(yàn)證使用了2對(duì)引物來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證,第1對(duì)引物證明有篩選標(biāo)記的插入,第2對(duì)引物證明基因敲除株同對(duì)照之間的不同。具體實(shí)驗(yàn)用引物見(jiàn)表1。

    2.3.2 用PCR及Southernblot驗(yàn)證ΔBem46 圖3a為PCR驗(yàn)證所需引物擴(kuò)增Ku80及ΔBem46引物的相應(yīng)片段大?。粓D3b為使用第1對(duì)引物PCR驗(yàn)證結(jié)果;圖3c為使用第2對(duì)引物PCR驗(yàn)證結(jié)果;圖3d為Southernblot驗(yàn)證結(jié)果。

    由圖3b可見(jiàn)對(duì)照菌株未擴(kuò)增出該基因,而轉(zhuǎn)化子1,2,4,5,6,7均有篩選標(biāo)記擴(kuò)增成功,說(shuō)明轉(zhuǎn)化子中有pyrG成功插入;由圖3c可見(jiàn)只有2號(hào)和4號(hào)擴(kuò)增出大約5.3 kb的片段;根據(jù)煙曲霉Bem46基因敲除構(gòu)建示意圖可見(jiàn)對(duì)基因DNA酶切后進(jìn)行探針標(biāo)記驗(yàn)證,在對(duì)照菌株和煙曲霉Bem46基因敲除株應(yīng)該有2條明顯不同的條帶,在煙曲霉Bem46基因敲除大約可見(jiàn)2.3 kb大小條帶,而在對(duì)照菌株可見(jiàn)約為4.8 kb大小的條帶。由圖3d可見(jiàn)在2號(hào)菌株確實(shí)只有一條大小約為2.3 kb的條帶,而對(duì)照菌株和1、3、5號(hào)基因敲除株均有大小約為4.8 kb的條帶,說(shuō)明只有2號(hào)菌株為正確的基因敲除株。該菌株用來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

    2.4 觀察Bem46基因?qū)熐瓜嚓P(guān)功能的影響:

    2.4.1 對(duì)照菌株與ΔBem46在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況 圖4a為二者在普通GMM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)比較;圖4b為二者在含有卡泊芬凈和尼可霉素2種藥物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)結(jié)果比較;圖4c為在含有不同濃度過(guò)氧化氫培養(yǎng)基上二者菌落直徑生長(zhǎng)速度比較;圖4d為在含有不同濃度甲酰胺培養(yǎng)基上二者生長(zhǎng)速度比較;圖4e為在含有氯化鈉、山梨醇的培養(yǎng)基上和不同溫度條件下二者生長(zhǎng)結(jié)果比較。

    圖3 PCR及Southernblot驗(yàn)證ΔBem46Fig.3 Confirmation of ΔBem46 by PCR and Southernblot

    圖4 Ku80與ΔBem46在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況比較Fig.4 Comparison on the growth diameter of the Ku80 and the ΔBem46 on different medium

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GMM培養(yǎng)基上,Ku80與ΔBem46生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異;在對(duì)抑制真菌細(xì)胞壁藥物敏感試驗(yàn)中可見(jiàn)煙曲霉對(duì)照菌株與Bem46基因敲除株在含有卡泊芬凈和尼可霉素這2種藥物的平皿上生長(zhǎng)無(wú)明顯差異;對(duì)氧化壓力敏感性試驗(yàn)中,對(duì)照菌株與ΔBem46在含有不同濃度過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基、及含有不同濃度甲酰胺的培養(yǎng)基上二者的生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異;對(duì)滲透壓敏感試驗(yàn)和溫度敏感試驗(yàn)中,55 ℃條件下,二者生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異,以氯化鈉介導(dǎo)的滲透壓變化也沒(méi)有對(duì)二者的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生影響,但在以山梨醇介導(dǎo)的滲透壓變化使得二者的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生了差異,即在濃度為1.2 mol/L的山梨醇培養(yǎng)基上,煙曲霉Bem46基因缺陷株明顯較對(duì)照菌株Ku80生長(zhǎng)要快。以上菌落直徑結(jié)果均經(jīng)SPSS22.0軟件分析。

    圖5 Ku80與ΔBem46發(fā)芽率百分率比較Fig.5 Comparison on the germination rate of the Ku80 and the ΔBem46

    2.4.2 觀察煙曲霉Bem46基因在孢子發(fā)芽中的作用見(jiàn)圖5,經(jīng)SPSS22.0軟件分析,由圖可見(jiàn),在13 h時(shí),對(duì)照株Ku80已經(jīng)完全發(fā)芽,而缺陷株ΔBem46在15 h時(shí)才實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽,缺陷株ΔBem46出芽明顯滯后于對(duì)照株Ku80(F=3536.191,P<0.05)。15 h后二者均全部發(fā)芽。

    3 討 論

    煙曲霉是主要的致病絲狀真菌,尤其在中性粒細(xì)胞減少的患者中感染煙曲霉可以發(fā)展成為侵襲性曲霉病,如果造成播散型感染就可能有較差的預(yù)后[5]。盡管在診斷技術(shù)和抗真菌藥物的研究上取得了很大的進(jìn)步,但是侵襲性曲霉病的發(fā)病和致死率仍然很高,也就顯得對(duì)煙曲霉生理生化性質(zhì)以及其同煙曲霉的致病性,抗真菌藥物敏感性相關(guān)性的一些細(xì)節(jié)研究更有必要[6]。目前對(duì)Bem46蛋白了解有限,只對(duì)模式絲狀真菌N.crassa有所研究,在N.crassa中該基因在子囊孢子發(fā)芽是必須的,且該基因定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[2],在N.crassa該基因編碼的蛋白在細(xì)胞特異性種類(lèi)極性的形成是必不可少的,Bem46基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周,在靠近細(xì)胞膜處形成斑點(diǎn)狀[7-8]。鑒于N.crassa同致病真菌煙曲霉基因同源性較高,是非常好的絲狀真菌的模式菌,我們推測(cè)該基因可能在煙曲霉中有類(lèi)似作用。因而我們構(gòu)建了該基因缺陷株。通過(guò)原生質(zhì)體法我們成功獲得煙曲霉Bem46基因缺陷株ΔBem46,并且觀察了其對(duì)煙曲霉一般生長(zhǎng)性狀的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,我們發(fā)現(xiàn)該基因的缺失對(duì)于煙曲霉的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。煙曲霉細(xì)胞壁的合成是其生長(zhǎng)過(guò)程中重要的一環(huán),如果合成出現(xiàn)異常,則可能為我們提供新的藥物靶點(diǎn)。因此,我們選擇了臨床常用的2種影響細(xì)胞壁合成的藥物卡泊芬凈和尼克霉素Z。卡泊芬凈主要抑制β-1,3葡聚糖合成酶,阻礙葡聚糖的形成,而尼克霉素Z的作用機(jī)制抑制細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成,這2種藥物從不同的方面來(lái)驗(yàn)證該基因是否在煙曲霉細(xì)胞壁形成過(guò)程中發(fā)揮作用,由我們的結(jié)果可見(jiàn)Bem46這個(gè)基因在含有此2種物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度同對(duì)照菌株并沒(méi)有明顯差異,因此我們推測(cè)該基因可能并不參與煙曲霉細(xì)胞壁的合成。以往的研究表明氧化壓力、滲透壓力以及溫度對(duì)于煙曲霉的致病都有重要的意義[9],因此我們進(jìn)一步研究了該基因在氧化壓力、滲透壓力和溫度敏感性中的作用。本研究顯示該基因?qū)τ谶^(guò)氧化氫和甲酰胺產(chǎn)生的氧化壓力和對(duì)照菌株沒(méi)有明顯的差異,也就是對(duì)這兩種物質(zhì)產(chǎn)生的氧化壓力不敏感,可能不參與其產(chǎn)生的氧化壓力的傳導(dǎo)。在滲透壓力的敏感性中,由氯化鈉產(chǎn)生的滲透壓力并未對(duì)二者生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因缺陷株ΔBem46對(duì)山梨醇產(chǎn)生的滲透壓力呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),即相比野生對(duì)照菌株而言其生長(zhǎng)明顯加快,推測(cè)也許Bem46參與了由山梨醇介導(dǎo)的滲透壓力傳導(dǎo)通路,在山梨醇存在的條件下,Bem46基因有抑制生長(zhǎng)的作用。在比較二者孢子發(fā)芽的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),缺陷株實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽的時(shí)間明顯慢與對(duì)照株實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽的時(shí)間,即Bem46基因的缺失導(dǎo)致了其發(fā)芽滯后,而15 h后二者均全部發(fā)芽,表明Bem46基因的缺失并不會(huì)阻止煙曲霉孢子發(fā)芽。所以我們推測(cè),Bem46基因極有可能有促進(jìn)孢子出芽的作用,參與孢子的出芽生長(zhǎng)過(guò)程,但其并不是煙曲霉孢子出芽的決定性基因。

    總之,研究通過(guò)構(gòu)建煙曲霉Bem46基因缺陷株,初步了解該基因?qū)熐股L(zhǎng)狀況的影響,提示可以從山梨醇介導(dǎo)的滲透壓傳導(dǎo)通路入手,研究Bem46基因?qū)熐股L(zhǎng)的抑制作用;Bem46基因缺陷使得發(fā)芽速度減慢提示可從參與孢子出芽過(guò)程的基因入手,研究其對(duì)出芽生長(zhǎng)的傳導(dǎo)通路產(chǎn)生的影響;研究也將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn),以期發(fā)現(xiàn)該基因更多更有意義的性狀。

    [1] Abad A, Fernandez-Molina JV, Bikandi J, et al. What makesAspergillusfumigatusa successful pathogen? Genes and molecules involved in invasive aspergillosis[J]. Rev Iberoam Micol, 2010, 27(4): 155-182. DOI:10.1016/j.riam.2010.10.003

    [2] Mercker M, Kollath-Leiss K, Allgaier S, et al. The BEM46-like protein appears to be essential for hyphal development upon ascospore germination inNeurosporacrassaand is targeted to the endoplasmic reticulum[J]. Curr Genet, 2009, 55(2): 151-161.DOI:10.1007/s00294-009-0232-3

    [3] Fan H,Guo JY,Ma SL,et al.Construction and identification of eukaryotic expression plasmids of synthetic TAG gene ofPneumocystisp55 antigen[J].Chin J Zoonoses,2015,31(5):399-402.DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2015.05.002(in Chinese)

    樊華,國(guó)九英,馬素麗.等. 人工合成肺孢子菌p55抗原串聯(lián)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(5):399-402.

    [4] Steinbach WJ, Cramer RA, Jr.Perfect BZ, et al. Calcineurin controls growth, morphology, and pathogenicity inAspergillusfumigatus[J]. Eukaryot Cell, 2006, 5(7): 1091-1103.DOI:10.1128/EC.00139-06

    [5] Segal BH. Aspergillosis[J]. N Engl J Med, 2009, 360(18): 1870-1884.DOI:10.1056/NEJMra0808853

    [6] Erjavec Z, Kluin-Nelemans H, Verweij PE. Trends in invasive fungal infections, with emphasis on invasive aspergillosis[J]. Clin Microbiol Infect, 2009, 15(7): 625-633.DOI:10.1111/j.1469-0691.2009.02929.x

    [7] Martinez-Martinez S, Rodriguez A, Lopez-Maderuelo MD, et al. Blockade of NFAT activation by the second calcineurin binding site[J]. J Biol Chem, 2006, 281(10): 6227-6235.DOI:10.1074/jbc.M513885200

    [8] Kumar A, Kollath-Leiss K, Kempken F. Characterization of bud emergence 46 (BEM46) protein: sequence, structural, phylogenetic and subcellular localization analyses[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 438(3): 526-532.DOI:10.1016/j.bbrc.2013.07.103

    [9] Ma Y, Qiao J, Liu W, et al. The sho1 sensor regulates growth, morphology, and oxidant adaptation inAspergillusfumigatusbut is not essential for development of invasive pulmonary aspergillosis[J]. Infect Immun, 2008, 76(4): 1695-1701.DOI:10.1128/IAI.01507-07

    ConstructionofBem46knockoutstrainandtheroleoftheBem46geneinAspergillusfumigatus

    LI Wen, LI Jia-juan, FENG Wen-li, MA Yan

    (DepartmentofDermatologyandVenereology,theSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

    The aims of this study are to construct theBem46 knockout strain ofAspergillusfumigatus, investigate the effect of theBem46 in the growth and germination, and observe the sensitivity of the oxidative stress, the osmotic stress, the temperature and the response to caspofungin and nikkomycin. TheBem46 gene was identified by sequence alignment inA.fumigatusgenome database. TheBem46 knockout strain was construction by the protoplast. The growth was observed and compared between Ku80 and ΔBem46 on different culture medium, such as GMM, GMM containing hydrogen peroxide, formamide, sodium chloride and sorbitol. The growth diameter was measured under the different temperatures. The germination rate was observed and compared by microscope. Results showed that theBem46 gene, Afu7g04660, contained 1 116 bp bases pair and encoding 311 amino acids. Six transformants were obtained by gene cloning and protoplast method and only one was confirmed by PCR and Southernblot. The ΔBem46 grew significantly faster than the control strain on the medium containing sorbitol. And there were no visible difference between ΔBem46 and Ku80 on the other medium. The germination rate of the ΔBem46 was more retarded than the Ku80 in GMM liquid medium. In conclusion, theBem46 gene plays a role in osmotic stress inA.fumigatusand involved in osmotic pressure induced by sorbitol. And there is no visible effect in oxidative stress. TheBem46 gene has a positive effect on spore germination.

    Bem46;Aspergillusfumigatus; germination rate; signal transduction

    10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.006

    國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.81101233),山西省青年科技研究基金(No.2010021036-2),山西省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(No.2015043),山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.2016-052)聯(lián)合資助

    馬 彥: Email:mayan197522@163.com

    山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科,太原 030001

    Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China(No. 81101233), the Natural Science Foundation for Youth in Shanxi Province (No.2010021036-2), the Research Project of Health and Family Planning Commission of Shanxi Province (No.2015043), and the Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No.2016-052) Corresponding author: Ma Yan, Email: mayan197522@163.com

    R378

    :A

    :1002-2694(2017)08-0694-06

    2016-11-14編輯:梁小潔

    猜你喜歡
    原生質(zhì)山梨醇二者
    D-山梨醇醚化過(guò)程的熱力學(xué)計(jì)算與分析
    非均相催化法制備異山梨醇的研究現(xiàn)狀
    石油化工(2021年9期)2021-10-18 02:14:16
    Sweden's Icehotel went all out for its 30th anniversary
    搖曳
    香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化
    食用菌(2017年5期)2017-10-19 03:02:28
    山梨醇類(lèi)成核劑對(duì)改性聚丙烯發(fā)泡性能的影響
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    電擊法介導(dǎo)的人參大片段DNA轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的研究
    原生質(zhì)體紫外誘變選育香菇耐高溫菌株
    山梨醇催化脫水制備異山梨醇的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
    石油化工(2010年3期)2010-09-09 08:53:12
    又粗又爽又猛毛片免费看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线永久观看黄色视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人精品一区二区免费| 成人av在线播放网站| 亚洲国产欧美人成| 日韩免费av在线播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲成人久久爱视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 好男人电影高清在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 午夜免费激情av| 深夜精品福利| 熟女电影av网| 色综合婷婷激情| 老司机福利观看| 亚洲五月婷婷丁香| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲国产欧美人成| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲av五月六月丁香网| 男女视频在线观看网站免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品久久久av美女十八| 在线观看舔阴道视频| 成人18禁在线播放| 久久久色成人| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99久久99久久久精品蜜桃| 最新在线观看一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| 在线观看午夜福利视频| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品av久久久久免费| 长腿黑丝高跟| 美女免费视频网站| 精品国产亚洲在线| 免费在线观看日本一区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 偷拍熟女少妇极品色| 久久中文看片网| 国产av在哪里看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 91老司机精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美黄色片欧美黄色片| 男女午夜视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲av免费在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费观看精品视频网站| 色av中文字幕| 久久久国产成人免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲成人久久性| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 日日夜夜操网爽| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日韩有码中文字幕| 日本 欧美在线| 久久精品综合一区二区三区| 欧美在线黄色| 悠悠久久av| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产成人欧美在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产真实乱freesex| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲自拍偷在线| 激情在线观看视频在线高清| 两个人看的免费小视频| 亚洲国产色片| 偷拍熟女少妇极品色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美最黄视频在线播放免费| 美女高潮的动态| 精品熟女少妇八av免费久了| 十八禁人妻一区二区| 青草久久国产| 一级作爱视频免费观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲七黄色美女视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品久久久久久成人av| 精品久久久久久久久久免费视频| 最新在线观看一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 叶爱在线成人免费视频播放| 日本a在线网址| 午夜精品久久久久久毛片777| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩有码中文字幕| 99国产综合亚洲精品| 国产一区二区在线av高清观看| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久国产欧美日韩av| 成人三级黄色视频| 丁香欧美五月| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲国产看品久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 最新在线观看一区二区三区| 两性夫妻黄色片| av视频在线观看入口| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久人人精品亚洲av| 国产av在哪里看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 18禁国产床啪视频网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 麻豆成人av在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| xxxwww97欧美| 变态另类丝袜制服| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产单亲对白刺激| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲五月天丁香| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩精品青青久久久久久| 在线观看66精品国产| 一级毛片精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美高清成人免费视频www| 白带黄色成豆腐渣| 午夜视频精品福利| av欧美777| 老汉色av国产亚洲站长工具| 长腿黑丝高跟| 久久久国产精品麻豆| 变态另类丝袜制服| 成年女人永久免费观看视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产一区二区激情短视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人三级做爰电影| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产69精品久久久久777片 | 国产激情偷乱视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本一本二区三区精品| 窝窝影院91人妻| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 免费看光身美女| 国产精品久久久久久久电影 | 中文字幕高清在线视频| 色综合婷婷激情| 久久久久久久久免费视频了| 色尼玛亚洲综合影院| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| xxxwww97欧美| 亚洲avbb在线观看| 校园春色视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 丁香六月欧美| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 中文亚洲av片在线观看爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 国产免费男女视频| netflix在线观看网站| 91九色精品人成在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜日韩欧美国产| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美在线黄色| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费高清视频大片| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色片一级片一级黄色片| 久久草成人影院| 国产成人av激情在线播放| 免费看光身美女| 午夜福利18| 丁香欧美五月| 亚洲乱码一区二区免费版| 999久久久国产精品视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本 av在线| 亚洲中文av在线| 成人午夜高清在线视频| 国产精品久久视频播放| 亚洲人成伊人成综合网2020| www.熟女人妻精品国产| 亚洲欧美精品综合久久99| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品国产综合久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产伦精品一区二区三区四那| 在线播放国产精品三级| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日韩黄片免| 热99在线观看视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 午夜精品在线福利| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品国产高清国产av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产精品999在线| 色吧在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜福利视频1000在线观看| 国产69精品久久久久777片 | 小说图片视频综合网站| 日韩免费av在线播放| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| av欧美777| 亚洲性夜色夜夜综合| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级作爱视频免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 级片在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产高清三级在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 三级国产精品欧美在线观看 | 嫁个100分男人电影在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | av国产免费在线观看| av在线天堂中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产综合久久久| ponron亚洲| 国产私拍福利视频在线观看| 黄片大片在线免费观看| 久久久精品大字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久九九精品影院| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 老熟妇仑乱视频hdxx| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| a级毛片在线看网站| 亚洲第一电影网av| 国产毛片a区久久久久| 丁香欧美五月| 一个人免费在线观看电影 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产三级中文精品| 国产主播在线观看一区二区| 美女黄网站色视频| 午夜福利在线观看吧| 校园春色视频在线观看| 99国产精品一区二区三区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产一区在线观看成人免费| 国产伦人伦偷精品视频| 国产日本99.免费观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久久午夜电影| 香蕉国产在线看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 看免费av毛片| 日本黄色视频三级网站网址| avwww免费| 一夜夜www| 亚洲avbb在线观看| 手机成人av网站| 午夜免费成人在线视频| 97超视频在线观看视频| 毛片女人毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 狂野欧美激情性xxxx| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 嫩草影视91久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产成人影院久久av| 欧美3d第一页| 国产精品久久电影中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜免费成人在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲美女黄片视频| 国产精品 国内视频| 男女那种视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 九九热线精品视视频播放| 熟女人妻精品中文字幕| 中文字幕av在线有码专区| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 成人三级做爰电影| 无限看片的www在线观看| 搡老岳熟女国产| 亚洲av电影在线进入| 国产真实乱freesex| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色 视频免费看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 90打野战视频偷拍视频| 欧美色视频一区免费| 一级毛片精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成在线人永久免费视频| 色视频www国产| 岛国在线观看网站| 午夜a级毛片| 国产精品 国内视频| 日韩欧美国产在线观看| 日韩欧美 国产精品| 久久中文字幕人妻熟女| 很黄的视频免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产激情久久老熟女| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久久国产精品麻豆| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色综合婷婷激情| 91av网一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩欧美 国产精品| 久久中文字幕一级| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产1区2区3区精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久亚洲真实| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 精品久久久久久久毛片微露脸| 操出白浆在线播放| 日日夜夜操网爽| 网址你懂的国产日韩在线| 色噜噜av男人的天堂激情| a级毛片在线看网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜成年电影在线免费观看| 不卡av一区二区三区| 国产精品影院久久| 九九热线精品视视频播放| 国产美女午夜福利| 国产伦精品一区二区三区四那| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 操出白浆在线播放| 亚洲国产欧美网| 五月伊人婷婷丁香| 一级作爱视频免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 两个人的视频大全免费| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 搞女人的毛片| 在线观看一区二区三区| a在线观看视频网站| xxx96com| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩欧美免费精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲色图av天堂| 国产三级黄色录像| 欧美极品一区二区三区四区| 精品不卡国产一区二区三区| 成人特级av手机在线观看| 国产av一区在线观看免费| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲一区二区三区不卡视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 日日干狠狠操夜夜爽| 一级毛片女人18水好多| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲七黄色美女视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产乱人视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜日韩欧美国产| 免费看a级黄色片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 国产69精品久久久久777片 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久这里只有精品19| 手机成人av网站| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九在线视频观看精品| 十八禁网站免费在线| 亚洲精品456在线播放app | 色哟哟哟哟哟哟| 日本免费a在线| 国内精品久久久久精免费| 在线视频色国产色| tocl精华| 欧美日韩精品网址| 亚洲18禁久久av| 色av中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 超碰成人久久| 国产三级黄色录像| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91av网站免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 色在线成人网| 一本一本综合久久| 亚洲色图av天堂| 日韩欧美免费精品| 色综合婷婷激情| 精品国产美女av久久久久小说| tocl精华| 成人国产综合亚洲| 久久久国产精品麻豆| 99久久成人亚洲精品观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 免费看日本二区| 97碰自拍视频| 免费观看的影片在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 日本三级黄在线观看| 日韩欧美精品v在线| 熟女人妻精品中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 久久中文字幕人妻熟女| 免费观看精品视频网站| 亚洲五月天丁香| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲无线在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 好男人电影高清在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 国产午夜精品久久久久久| 国产高清videossex| 久久久国产欧美日韩av| 成人av在线播放网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99国产综合亚洲精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 可以在线观看的亚洲视频| 国产视频一区二区在线看| 欧美在线一区亚洲| 成人永久免费在线观看视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 1024香蕉在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 无人区码免费观看不卡| 国产三级中文精品| tocl精华| 国产午夜福利久久久久久| 久久精品91无色码中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线永久观看黄色视频| 最新在线观看一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美乱妇无乱码| 三级国产精品欧美在线观看 | 中出人妻视频一区二区| 午夜福利在线在线| 久9热在线精品视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜福利欧美成人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品野战在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99久国产av精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色 视频免费看| 欧美乱妇无乱码| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人精品久久二区二区91| 99精品在免费线老司机午夜| 久久99热这里只有精品18| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品久久久av美女十八| 欧美色欧美亚洲另类二区| 男人舔奶头视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 身体一侧抽搐| 成年人黄色毛片网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 桃红色精品国产亚洲av| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品久久国产高清桃花| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久久久精品吃奶| 成人国产综合亚洲| 亚洲国产精品成人综合色| 成人国产综合亚洲| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩精品网址| 天天躁日日操中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女cb高潮喷水在线观看 | 男女之事视频高清在线观看| 国产午夜精品论理片| 久久中文字幕人妻熟女| 一本综合久久免费| 嫩草影院精品99| 国产午夜精品论理片| 午夜亚洲福利在线播放| 特级一级黄色大片| 嫩草影院入口| 小说图片视频综合网站| 美女cb高潮喷水在线观看 | 黄频高清免费视频| www日本在线高清视频| 亚洲av熟女| 亚洲色图av天堂| a级毛片在线看网站| 精品不卡国产一区二区三区| 成人无遮挡网站| 女同久久另类99精品国产91| 毛片女人毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品久久久av美女十八| 91麻豆av在线| 热99在线观看视频| 中文字幕最新亚洲高清| 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕高清在线视频|