基因芯片技術檢測分枝桿菌和異煙肼、利福平耐藥性在結核性膿胸診斷中的應用

林秀華，賴國祥，陳雨燕，鄭 丹，周銀發(fā)，陳曉紅

基因芯片技術檢測分枝桿菌和異煙肼、利福平耐藥性在結核性膿胸診斷中的應用

林秀華1，賴國祥1，陳雨燕3，鄭 丹4，周銀發(fā)5，陳曉紅2

目的探討基因芯片技術檢測分枝桿菌和異煙肼(INH)、利福平(RFP)耐藥性在結核性膿胸診斷中的臨床應用價值。方法收集2011年1月至2015年12月臨床疑似結核性膿胸患者182例的膿液標本，分別應用基因芯片技術和快速培養(yǎng)法進行檢測，比較兩種方法的特異性和敏感性；同時選取36例臨床確診為結核性膿胸患者，且基因芯片法和MGIT培養(yǎng)法均為陽性的標本進行INH、RFP耐藥性檢測。以MGIT培養(yǎng)法的藥敏結果為標準，評價基因芯片法的靈敏度、特異度和符合率。結果182例疑似結核性膿胸患者中，135例臨床確診為結核性膿胸，基因芯片法和快速培養(yǎng)法的特異性均為95.7%(45/47)，靈敏度分別為48.9%(66/135)和26.7%(36/135)，二者比較有統(tǒng)計學差異(χ2=80.5，P<0.05)。基因芯片法檢測RFP耐藥性靈敏度、特異度和符合率均為100%；而檢測INH耐藥性的靈敏度、特異度和符合率分別為50.0%(1/2)和97.1%(33/34)和94.4%。結論基因芯片技術檢測分枝桿菌具有較高的、特異性，可快速鑒別出非結核分枝桿菌，且可有效檢測結核分枝桿菌異煙肼和利福平的耐藥性，對結核性膿胸的早期診斷與治療有重要意義。

基因芯片；分枝桿菌；耐藥性；結核性膿胸

滲出性胸膜炎不及時治療或治療不當，或胸膜下結核病灶向胸膜腔破潰，大量干酪物質(zhì)及結核菌進入胸膜腔，就可發(fā)展為膿胸[1]。這類患者多發(fā)病緩慢，癥狀較輕且無明顯特異性，容易漏診或誤診。若早期診斷，積極治療，療效多數(shù)良好，相反，若未及時診治，則可出現(xiàn)胸膜明顯肥厚、胸廓塌陷等，需行胸膜纖維板剝脫術、胸廓改形術或胸膜肺切除術等，嚴重影響生活質(zhì)量，預后差。結核性膿胸的傳統(tǒng)診斷方法主要是膿液直接涂片找抗酸桿菌，其敏感性不超過5%，特異性也低，無法區(qū)分出非結核分枝桿菌(NTM)。結核菌培養(yǎng)的營養(yǎng)要求較高、生長緩慢、需要菌種鑒定，耗時長、陽性率低，故急需一種敏感、快速且特異性高的新技術應用于臨床。

基因芯片技術，也稱DNA微陣列芯片技術，是近年發(fā)展起來的又一新的分子生物學研究工具。它具有操作簡便、準確、快速、特異性高、信息量大、成本較低等特點。近年來有國外學者將其應用于結核病耐藥基因的研究[2-3]，也可對可疑的臨床標本進行分枝桿菌屬DNA[4-5]的檢測。國內(nèi)也有研究報道：以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為對照，應用DNA芯片技術對134株臨床分離株進行菌種鑒定，結果兩種方法鑒定結果一致和基本一致共112株，吻合率為83.6%[6]，提示DNA芯片檢測技術可以簡便、快速、準確地對大多數(shù)分枝桿菌進行鑒定。為評價基因芯片技術在結核性膿胸中的價值，本文回顧性分析182例疑似結核性膿胸患者的檢測數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2015年12月福建省福州肺科醫(yī)院及南京軍區(qū)福州總醫(yī)院門診就診及住院的疑似結核性膿胸患者182例，其中男性87例，女性95例，年齡20～82歲，平均年齡54.8歲。1.2 疑似結核性膿胸患者入選標準 1)有結核病史、癥狀、體征；2)胸腔穿刺所得膿液稀薄、淡黃色或含有干酪樣物質(zhì)，膿液細胞總數(shù)大于10×109/L，以淋巴細胞為主，蛋白大于40 g/L，比重大于1.020;3)具有助于診斷的X線與B超檢查結果。

1.3 結核性膿胸的確診標準 滿足以上疑似結核性膿胸入選標準后加以下任何一點。1)膿液涂片找抗酸桿菌陽性和結核TB-DNA陽性，抗結核治療有效；2)膿液結核菌培養(yǎng)陽性或菌種鑒定檢出結核分枝桿菌符合群。

1.4 儀器與試劑 應用北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定芯片及Lux ScanTM10K/B 微陣列芯片掃描儀等配套儀器進行檢測。應用美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT960結核菌快速培養(yǎng)儀行結核菌培養(yǎng)。

1.5 基因芯片檢測 應用芯片檢測結核分枝桿菌復合群和16種NTM，同時可檢測異煙肼、利福平的耐藥性。

1.5.1 標本處理 吸取混勻的膿液標本400 μL，加入1.5 mL離心管中，加入等量的10%氫氧化鈉，震蕩混勻1～3 min，室溫靜置15 min。

1.5.2 分枝桿菌菌種鑒定及耐藥位點檢測 按基因芯片試劑盒說明書的操作流程順序進行，包括核酸提取、PCR擴增、芯片雜交、芯片洗滌、芯片掃描。

1.6 結核菌快速培養(yǎng)法

1.6.1 膿液標本的收集和處理 嚴格遵守無菌操作規(guī)程，收集膿液于無菌試管內(nèi)供檢查。

1.6.2 培養(yǎng) 吸取約5 mL膿液加入帶有螺旋帽的50 mL離心管中，加入與標本等量的NaOH-枸櫞酸鈉前處理液，蓋緊蓋子，充分漩渦振蕩，直至徹底液化。室溫靜置15～20 min(不超過25 min，以防殺死結核菌)后，將該管放入震蕩器中，整個過程輕微混合。加入PBS(PH6.8)至45 mL，蓋緊蓋子；3 000 g離心15 min，然后棄去上清，留沉淀。加入1～2 mLPBS(PH6.8)，混合均勻，以制備成懸濁液。抽取0. 5mL的沉淀物接種在已加入0.8 mL營養(yǎng)添加劑和抑菌劑的MGIT培養(yǎng)管內(nèi)，掃描MGIT培養(yǎng)管后將其放入BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀孵育檢測。

1.6.3 結果判斷 接種過的MGIT試管放入BACTEC MGIT960儀器的孵育抽屜，保存溫度在37±1 ℃，由儀器自動監(jiān)測。系統(tǒng)報告陽性后取菌液涂片進行抗酸染色，同時經(jīng)菌種鑒定為結核分枝桿菌后報告結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；培養(yǎng)42 d儀器仍報告陰性，肉眼觀察無細菌生長，則為結核分枝桿菌培養(yǎng)陰性。若見NTM生長，則重新培養(yǎng)一次并進行確認后報告NTM培養(yǎng)陽性。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用率描述分類計數(shù)資料，計算基因芯片法行菌種鑒定和耐藥位點檢測的敏感性、特異性,以及結核菌培養(yǎng)法的敏感性和特異性，采用卡方檢驗比較兩種方法在檢測分枝桿菌敏感性、特異性方面的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基因芯片法與快速培養(yǎng)法的檢測結果 對納入分析的182例患者進行統(tǒng)計，經(jīng)臨床確診135例陽性(結核性膿胸)，47例陰性(2例NTM和45例為膿胸)；基因芯片法與快速培養(yǎng)法的兩例假陽性標本均是NTM；以臨床確診為金標準，基因芯片法檢測結核分枝桿菌的特異性與MGIT培養(yǎng)法一致均為95.7%(45/47)，但基因芯片法的敏感性為48.9%(66/135)，MGIT培養(yǎng)法的敏感性為26.7%(36/135)。基因芯片法與MGIT培養(yǎng)法的結核分枝桿菌陽性檢出率有統(tǒng)計學差異(χ2=80.5，P<0.05)。(見表1、表2)

表1 基因芯片法與快速培養(yǎng)法的檢測結果(例)Tab.1 Results of gene chip method and MGIT culture method

表2 基因芯片法與快速培養(yǎng)法卡方檢驗Tab.2 Chi-square test between gene chip method and MGIT culture method

2.2 NTM檢測結果 本組病例共檢出2例非結核分枝桿菌，經(jīng)博奧基因芯片檢測結果為胞內(nèi)分枝桿菌1株，龜/膿腫分枝桿菌1株。

2.3 基因芯片法檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性結果 從確診為結核性膿胸的患者標本中選取36例基因芯片法和MGIT培養(yǎng)法均為陽性的標本進行INH、RFP耐藥性檢測。以MGIT培養(yǎng)法的藥敏結果為標準，基因芯片法檢測RFP耐藥性靈敏度、特異性和符合率均為100%；而檢測INH耐藥性的靈敏度與特異度和符合率分別為50.0%(1/2)和97.1%(33/34)和94.4%。(見表3)

表3 基因芯片法檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性(例)Tab.3 Detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid by gene chip method

3 討 論

基因芯片誕生于1992年，自從將其應用在結核分枝桿菌菌種鑒定方面后[7]，引起了國內(nèi)外眾多學者的研究興趣，近年來逐漸成為結核病診斷的一項新技術。它可以在一張芯片上同時檢測多達數(shù)百個標本，檢測時間短(≤6 h)，所需標本量少，可對痰液、尿液、胸腹水、心包積液、膿液、腦脊液、肺泡灌洗液等多種臨床標本檢測出結核分枝桿菌(復合群)與臨床常見的16個種、群的NTM，主要是應用反向斑點雜交的方法對結核分枝桿菌基因的保守區(qū)域進行檢測，結果由軟件自動判讀，能明顯減少人為因素的影響，可重復性強，便于臨床實驗室開展檢測。而且，基因芯片法靈敏度和特異性高，檢測成本低，對我國結核病的早期診斷、鑒別診斷和治療有重要意義。

本研究將基因芯片技術應用于膿液的檢測，其敏感性高于快速培養(yǎng)法，特異性與培養(yǎng)法無明顯差異。趙連爽等[8]應用基因芯片技術對不同類型的標本進行分枝桿菌菌種鑒定，發(fā)現(xiàn)穿刺膿液的陽性率最高，為33.3%。本研究中分枝桿菌檢出陽性率稍高，考慮可能與上述研究中標本量少(僅6例)，且均非結核性膿胸患者有關。基因芯片法檢測分枝桿菌的陽性率與疾病的范圍、部位、病程、標本含菌量、所留取標本的質(zhì)量、操作過程等因素均有關。張立群等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)標本的液化對檢測結果有較大影響，樣本濃度對結果的影響較小。特別是對于胸水或腹水等蛋白含量高的標本，經(jīng)過高溫滅活處理后呈膠凍狀，對核酸的提取有較大影響。故為了保證結果的敏感性、可重復性，在基因芯片技術的操作過程中必須嚴格進行質(zhì)量控制。

本研究提示：基因芯片法不僅是一種方便、快捷、敏感、特異的檢測手段，而且可鑒別出NTM引起的結核性膿胸。NTM感染引起的膿胸的臨床表現(xiàn)與結核分枝桿菌感染類似，臨床無法區(qū)分，抗酸染色也無法鑒別，且NTM對大多數(shù)一、二線抗結核藥物均耐藥，若不能得到及時診斷和治療，甚至可引起全身播散性疾病[10-12]。近年來，隨著人免疫缺陷病毒感染人數(shù)的不斷增加、激素等各種免疫抑制劑的廣泛應用、NTM鑒定技術的提高、臨床醫(yī)生對NTM病的警惕性增強、醫(yī)源性感染機會增多等，NTM病逐漸增多[13-14]。對于臨床上病史長、中毒癥狀輕，有慢性肺部疾病、規(guī)則抗結核后療效欠佳的結核性膿胸患者，應考慮到NTM播散的可能。

此外，基因芯片法可在7-8 h內(nèi)對膿液進行INH、RFP的耐藥檢測，極大地縮短了檢測時間，滿足了臨床快速檢測的需求。本研究基因芯片法RFP耐藥性檢測結果與MGIT培養(yǎng)法一致，符合率100%，與鄧葉華[15]、歐維正的研究結果一致[16]。RFP的耐藥機制主要是rpoB基因的突變，導致空間構象發(fā)生變化，阻止了與FRP的結合，約95%在所分離的rpoB序列內(nèi)的不同部位存在突變。冉兵等研究表明[17]，基因芯片方法具有較好的診斷價值；以傳統(tǒng)的藥敏法為金標準，基因芯片方法特異度、敏感度，診斷OR值均較高，說明其在結核菌對RFP耐藥檢出率較高，可作為臨床結核分枝桿菌檢測的輔助手段。

不過，以快速培養(yǎng)法為金標準，基因芯片法對INH耐藥性檢出的特異度高，靈敏度較低?，F(xiàn)有的研究證實INH的耐藥涉及多個基因的多個位點突變，該芯片僅能檢測KatG和inhA兩個位點，而KatG和InhA基因位點突變引起的INH耐藥只占總INH耐藥的70%[18]。同時，也由于結核分枝桿菌對INH耐藥性存在地域性差異，不同地區(qū)檢測結果不一致，有待將來在全國范圍內(nèi)進行大規(guī)模檢測，明確各地區(qū)INH相關耐藥基因的具體特征，制定出適合各個地區(qū)的基因芯片。

綜上所述，基因芯片法不僅可以及時明確診斷，而且可以早期快速獲得菌株的耐藥性，在我國結核病高患病率高耐藥率高死亡率的國情下對結核性膿胸的診治具有重要的意義。

[1] Yan BY,Duanmu HJ.Tuberculosis[M].Beijing：Beijing Publishing House，2003:576-587.(in Chinese)

嚴碧涯，端木宏謹.結核病學[M].北京:北京出版社，2003：576-587.

[2] Bravo LT, Tuohy MJ, Ang C, et al. Pyrosequencing for rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin, isoniazid, and fluoroquinolones[J]. Clin Microbiol, 2009, 47(12): 3985-3990.DOI: 10.1128/JCM.01229-09

[3] Pietzka AT, Indra A, Stoger A, et al. Rapid identification of multigrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolate by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis[J]. J Antimicrob Chemother, 2009, 63: 1121-1127.DOI: 10.1093/jac/dkp124

[4] Ahmad S, Mokaddas E. Recent advances in the diagnosis and treatment of multidrug-resistant tuberculosis[J]. Respir Med, 2009, 103(12): 1777-1790.DOI: 10.1016/j.rmed.2009.07.010

[5] Zhu L, Jiang G, Wang S, et al. Biochip system for rapid and accurate identification of mycobacterial species from isolates and sputum[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(10): 3654-3660.DOI: 10.1128/JCM.00158-10

[6] Huang MX,Wang L,Zhang LS,et al.Rapid identification ofMycobacteriumspecies by DNA chip[J].Chin J Zoonoses,2010,26(6)：555-557.(in Chinese)

黃明翔,王琳,張麗水,等．DNA芯片鑒定分枝桿菌的研究[J]．中國人獸共患病學報，2010，26(6)：555-557.

[7] Gingeras TR, Ghandour G, Wang E, et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of genericMycobacteriumDNA arrays[J]. Genome Res, 1998, 8(5): 435-448.DOI:10.1101/gr.8.5.435

[8] Zhao LS，Dai D，Chen X，et al.Diagnostic value of gene chip in identification of mycobacterium and detection of drug ‐resistant genes[J].Lab Med Clin，2014,11 (12):1595-1598.(in Chinese)

趙連爽，代娣，陳昕,等.基因芯片在分枝桿菌菌種鑒定及結核耐藥基因檢測的診斷價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2014,11(12):1595-1598.

[9] Zhang LQ,Wang YX，Yao CY,et al.High specificity gene chip methods for detection ofMycobacteriumtuberculosis:a clinical evaluation[J]. Chin J Nosocomiol，2010,20 (11) :1505-1508.(in Chinese)

張立群，王云霞，姚春艷，等.高特異性基因芯片法檢測結核分枝桿菌的臨床應用評價[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2010,20(11):1505-1508.

[10] Jia FZ,Li LJ.Infectious disease[M].Nanjing:Jiangsu Science and Technology Press, 2010: 545-550．(in Chinese)

賈輔忠，李蘭娟．感染病學[M]．南京：江蘇科學技術出版社，2010:545-550．

[11] Tang SJ,Gao W.Clinical tuberculosis[M].Beijing:People’s Health Publishing House,2011:700-709．(in Chinese)

唐神結，高文.臨床結核病學[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011:700-709．

[12] Taiwo B, Glassroth J. Nontuberculous mycobacterial lung diseases[J]. Infect Dis Clin North Am, 2010, 24: 769-789.DOI: 10.1016/j.idc.2010.04.008

[13] Ma Y.Focus on diagnosis and treatment of non-tuberculous mycobacteria lung disease[J].Chin J Tuberc Respir Dis,2011,34:566-568．(in Chinese)

馬玙.關注非結核分枝桿菌肺病的診斷與治療[J].中華結核和呼吸雜志,2011,34:566-568．

[14] Ma Y,Wang J.Pay attention to the identification of non-tuberculosis mycobacteria and pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Pulm Med,20l0,15:301-302．

[15] Deng YH,Xiang YG,Ma XH,et al.Identification of drug-resistance gene type inMycobacteriumtuberculosisby gene chip in Hunan province[J].Int J Lab Med,2015,36(22):3223-3226.(in Chinese)

鄧葉華，向延根，馬小華，等.基因芯片法用于檢測長沙地區(qū)結核分枝桿菌耐藥性研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2015,36(22):3223-3226.

[16] Ou WZ,Chen ZH,Chen J,et al.Determination of resistance genes Kat G and inh A inMycobacteriumtuberculosisisolates from Guizhou Province by gene chip[J]. Chin J Zoonoses,2015,31(7):655-658.DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.013(in Chinese)

歐維正，陳崢宏，陳靜,等. 基因芯片技術檢測貴州省結核分枝桿菌耐藥基因KatG和inhA[J].中國人獸共患病學報，2015,31(7):655-658.

[17] Ran B，Cai L.Diagnostic accuracy of gene chip in identifying rifampicin resistanceMycobacteriumtuberculosis:a Meta-analysis[J].Chin J Antituberc，2015,37(1):56-65.

[18] Zhang CL,Zhao LN,Ren H.Application of gene chip technology to detect the four kinds of TB research of drug sensitive test[J].Harbin Medical J,2015,35(3):182-184.

Chen Xiao-hong, Email: cxhong6886@126.com

GenechiptechnologyfordetectingmycobacteriaandMycobacteriumtuberculosisresistanceofisoniazidandrifampinintheapplicationoftuberculousempyema

LIN Xiu-hua1, LAI Guo-xiang1, CHEN Yu-yan3, ZHENG Dan4, ZHOU Yin-fa5, CHEN Xiao-hong2

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,FuzhouGeneralHospitalaffiliatedtoFujianMedicaluniversity,Fuzhou,350025，China；2.DepartmentofTuberculosis,FuzhoupulmonaryhospitalaffiliatedtoFujianMedicaluniversity,Fuzhou350008，China；3.Thethirdpeople'shospitalaffiliatedtoFujianuniversityoftraditionalChinesemedicine,Fuzhou350108，China；4.DepartmentofClinicallaboratory,FuzhoupulmonaryhospitalaffiliatedtoFujianMedicaluniversity,Fuzhou350008，China；5.Fujianprovincialcenterfordiseasecontrolandprevention,Fuzhou350008，China)

To evaluate the clinical value of gene chip technology (GCT) in detecting the mycoba-cteria, isoniazid and rifampin resistance of patients diagnosed tuberculous empyema.The 182 patients who met the inclusion criteria were enrolled to this study from January 2011 to December 2015, whose pus mycobacterial species were detected by GCT and MGIT, the simultaneous and sensitivity of them were compared. Meanwhile, 36 patients diagnosed tuberculous empyema were selected to detect isoniazid and rifampin resistance.The simultaneous and sensitivity of GCT were evaluated base on the standard of MGIT. The 135 patients were diagnosed by tuberculous empyema. The specificity of GCT was same to MGIT (95.7%), the the sensitivity was 48.9%(66/135)in GCT,26.7% in MGIT, there was significant difference between them (χ2=80.5，P<0.05).The sensitivity, specificity and coincidence rate of GCT in rifampin resistance were 100%,the sensitivity, specificityand coincidence rate in INH were 50.0%(1/2),97.1%(33/34) and 94.4%. Gene chip technology for detection of mycobacteria has high sensitivity and specificity, which can identify non-tuberculous mycobacteria quickly. And it can also effectively detect the resistance ofMycobacteriumtuberculosisto isoniazid and rifampicin.It has important significance in early diagnosis and treatment of tuberculous empyema.

gene chip;Mycobacterium; resistance; tuberculous empyema

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.011

福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會青年科研課題(No.2014-1-74)

陳曉紅，Email: cxhong6886@126.com

1.福建醫(yī)科大學福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學院呼吸與危重癥醫(yī)學科，福州 350025； 2.福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福州肺科醫(yī)院結核科，福州 350008； 3.福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院，福州 350108； 4.福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福州肺科醫(yī)院檢驗科，福州 350008； 5.福建省疾病預防控制中心，福州 350001

Supported by the Youth Research Project of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission (No.2014-1-74)

R378.9

：A

：1002-2694(2017)08-0720-04

2016-12-09編輯：張智芳