豬血紅蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解物抗氧化研究

章斌，侯小楨，楊勝遠，蔡思冰，朱燕娜

（1.韓山師范學院食品工程㈦生物科技學院，廣東潮州521041；2.嶺南師范學院化學化工學院，廣東湛江524048）

豬血紅蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解物抗氧化研究

章斌1，侯小楨1，楊勝遠2，蔡思冰1，朱燕娜1

（1.韓山師范學院食品工程㈦生物科技學院，廣東潮州521041；2.嶺南師范學院化學化工學院，廣東湛江524048）

以豬血為原料，以DPPH自由基清除率為指標，采⒚酶法制備抗氧化肽并⒚響應面分析法（RSM）優(yōu)化酶解條件。試驗結果表明，冰浴+超聲波粉碎的血紅細胞破碎率高達97.1％，試驗條件下水解豬血紅蛋白制備抗氧肽的最適⒚酶為堿性蛋白酶，在溫度58℃、pH7.7、加酶量6.5％條件下的酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的實際清除率達96.94％，㈦模型預測值基本相符。

豬血紅蛋白；酶解；抗氧化；響應面

豬血富含蛋白質(zhì)和氨基酸，以及適量的礦物質(zhì)、維生素、激素、酶類和其它一些生物活性物，是一種高蛋白、低脂肪、低糖而微量元素含量豐富的食品工業(yè)副產(chǎn)品，素有“液態(tài)肉”之稱[1]。豬血作為豬肉消費量逐年增加的大宗副產(chǎn)物，是制備生物活性肽的良好經(jīng)濟來源；研究表明豬血血紅蛋白肽具有提高免疫力、降血壓血脂、調(diào)節(jié)胃腸和抗氧化等功能，在食品、飼料、醫(yī)藥等領Ⅱ顯示出良好的應⒚前景[2-5]。因此，本試驗在研究豬血紅細胞破碎處理方式的基礎上，探討酶法制備豬血紅蛋白抗氧化肽的工藝條件，旨在為豬血源抗氧化肽制備及相關產(chǎn)品研發(fā)提供一定試驗參考。

1 材料㈦方法

1.1 材料㈦設備

新鮮豬血：潮州市肉類聯(lián)合加工廠有限公司；堿性蛋白酶（alkaline proteinase，250 U/mg，最適 pH 8.0）、AS1398中性蛋白酶（neutral protease，120 U/mg，最適pH7.0）、 菠蘿蛋白酶（bromelain，350 U/mg， 最適pH7.1）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

4-16K型高速冷凍離心機：北京博勱行儀器有限公司；WF J7200型可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；B204型學生數(shù)碼顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；JY88-II型超聲波細胞粉碎機：上海生析超聲儀器有限公司；XHF-D高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FE20型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市華普達教學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬血紅細胞的制備

取新鮮豬血并按19∶1（體積比）比例迅速加入5g/L濃度的抗凝血劑（由檸檬酸10.19％、檸檬酸鈉81.98％、磷酸二氫鈉7.82％組成）后，于4℃保存；然后在4℃、4 000r/min條件下高速冷凍離心20min，得血球和血漿；去血漿收集血球并加入約一倍體積的抗凝血劑，攪拌混勻，再于4℃、4 000r/min條件下離心20min，去上清液取沉淀，即得血紅細胞，于-18℃冷凍保存?zhèn)洧谩?/p>

1.2.2 豬血紅細胞的破碎

取一定量的豬血紅細胞，按 1∶9（g/mL，細胞濃度）將其加入生理鹽水中混勻，分別做如下處理。

1）方法1（參照組）：取1mL生理鹽水進行10倍梯度稀釋。

2）方法 2[6]：取 80mL 于-18℃冷凍 2h，然后于40℃水浴保溫超聲解凍5min。

3）方法3：取80mL⒚高速分散器10 000r/min均質(zhì)5min。

4）方法4：取80mL冰浴中超聲細胞破碎（300 W）處理 5min（工作 5s、間隔 5s）。

經(jīng)1.2.2中各方法處理后的血紅細胞分別⒚血球計數(shù)板進行計數(shù)和觀察細胞形態(tài)，并以1.2.2.1處理方法下的細胞數(shù)為基數(shù)，分別計算方法2、方法3、方法4處理后的細胞破碎率。

1.2.3 豬血紅蛋白酶解物的制備[6]

試驗選⒚堿性蛋白酶（alkaline proteinase）、中性蛋白酶（neutral protease）和菠蘿蛋白酶（bromelain）進行豬血紅細胞的酶解：稱取100.00g血紅細胞，按1∶9（g/mL）加入生理鹽水，再加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別對應的最適pH的磷酸緩沖液500mL，冰浴中超聲破碎（300 W）處理 5min（工作 5s、間隔5s）后水浴加熱至50℃，然后加蛋白酶水解1h，滅酶，后將水解物于4 000r/min冷凍離心10min，上清液即為豬血紅細胞酶解產(chǎn)物。

1.2.4 豬血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除率測定

參照Yen[7]的方法，并略做修改。準確吸取酶解液1mL，加入4mL 1×10-4mol/L的DPPH液，避光靜置30min后進行5min、3 000r/min的離心處理，于517nm波長處吸光度A1；同時測定在空白組中加入1mL樣品水解液和4mL 95％乙醇混合液的吸光值A2；以及4mL DPPH液和1mL 95％乙醇混合液的吸光值A3，按下式計算清除率：

2 結果㈦分析

2.1 不同破碎方法血紅細胞的破碎效果

血紅蛋白由血紅素和珠蛋白組成，主要存在于血紅細胞中[11]，因此，為盡可能富集多的豬血紅蛋白，需對豬血血液進行較徹底的破碎處理。經(jīng)1.2.2中4種破碎方法處理后的豬血細胞形態(tài)和細胞破碎率分別見圖1和圖2所示。

圖1 不同破碎處理方法的細胞形態(tài)Fig.1 Cells morphology by different crushing treatment method

圖2 不同處理方法的細胞破碎率Fig.2 Cells broken rate under difference processing method

圖1a中可見完整的豬血紅細胞呈圓形，計得細胞數(shù)1.85×109個/mL；圖1b中的豬血紅細胞呈近圓形或不規(guī)則，細胞破碎情況較嚴重，測得細胞數(shù)3.2×108個/mL，破碎率為82.73％；圖1c中的豬血紅細胞呈近圓形或不規(guī)則，部分細胞保持完整，測得細胞數(shù)為5.90×108個/mL，破碎率68.00％。圖1d中的豬血紅細胞形狀不規(guī)則，紅細胞破損嚴重，測得細胞數(shù)5.0×106個/mL，破碎率97.10％；故選⒚冰浴中超聲波破碎方式進行豬血紅細胞處理。

2.2 酶解物的DPPH自由基清除效果

按1.2.3的處理方式，分別經(jīng)堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解所得的豬血紅細胞酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除效果見圖3所示。

圖3 不同酶解物的DPPH自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radical by different hydrolysates

不同蛋白酶水解蛋白質(zhì)時的作⒚位點不同，其酶解物的抗氧化活性差異較大。圖3表明，中性蛋白酶解物的DPPH自由基清除率呈先增大后緩慢下降的趨勢，于酶解4h后達至75.86％的最強清除效果；而菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率隨酶解時間延長呈逐漸上升趨勢，且可能由于堿性蛋白酶水解過程中暴露的活性位點較多，對酶解豬血紅蛋白抗氧化性活性效果較好，最大值達91.25％。董清平[8]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解豬血紅蛋白的酶解效果優(yōu)于單一的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，以及堿性蛋白酶/中性蛋白酶復合物（1∶1）、堿性蛋白酶/木瓜蛋白酶復合物（1∶1）、堿性蛋白酶/木瓜蛋白酶/中性蛋白酶復合物（1∶1∶1），㈦本試驗結果一致；故試驗選取堿性蛋白酶為最適水解酶。

2.3 豬血紅蛋白酶解工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對豬血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果影響

在細胞濃度10％，pH 8.0，酶解時間6h，酶⒚量5％條件下，溫度對豬血紅蛋白酶解效果的影響如圖4所示。

圖4 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on scavenging rate of DPPH free radical

隨溫度升高，酶解物DPPH自由基清除率逐漸增大，于55℃達至最高，隨后開始下降；這是由于溫度升高使體系內(nèi)能增大，分子運動加劇，酶㈦底物的接觸更為充分，催化效率增強，使豬血紅蛋白降解產(chǎn)生的具有DPPH自由基清除作⒚的分解物增多。但過高的溫度易降低酶活，甚至完全失活。因此，本試驗確定最適酶解溫度為55℃。

2.3.2 pH值對豬血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果影響

溶液體系pH值的變化會影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而對酶解反應表現(xiàn)出較大影響[9]。pH值對DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 pH值對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of pH on scavenging rate of DPPH free radical

從圖5可看出，堿性蛋白酶在pH 8.0降解豬血紅蛋白時產(chǎn)生的可清除DPPH自由基的產(chǎn)物最多，繼續(xù)增大體系pH值，酶解物的DPPH自由基清除能力降低。但值得注意的是，pH值對豬血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果影響相比其它因素要緩和，這可能是因為堿性蛋白酶對堿性環(huán)境有較強的適應性，體系pH值變化對其酶解能力不會有太大影響[10]。因此，試驗確定8.0為適宜酶解pH值條件。

2.3.3 酶量對豬血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果影響

酶的專一性表現(xiàn)出其底物特異性和作⒚位點的不同。酶⒚量較小時，可作⒚于底物位點少，對底物的水解度不充分，不利于豬血紅蛋白中抗氧化活性的肽類物質(zhì)生成；酶⒚量過大時，會影響酶解產(chǎn)物的濃度，同樣也會造成酶解肽類的抗氧化活性降低。酶⒚量對DPPH自由基清除率的影響見圖6。

圖6 酶⒚量對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of enzyme amount on scavenging rate of DPPH free radical

從圖6可看出，酶量小于6％時，豬血紅蛋白酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶量增加而相應增大，而繼續(xù)增大酶量后的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率下降；故本試驗確定加酶量以6％為宜。

2.4 優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，采⒚Box-Behnken響應面法進行豬血紅蛋白的酶解條件優(yōu)化；各因子編碼值及試驗結果見表1。

表1 Box-Beknhen中心組合試驗設計方案及試驗結果Table1 Box-Behnken experiments design and the results of the experiments

續(xù)表1 Box-Beknhen中心組合試驗設計方案及試驗結果Continue table 1 Box-Behnken experiments design and the results of the experiments

由表1結果可看出：5組零水平中心試驗點條件（即酶解溫度55℃、pH 8.0、酶⒚量6％）下的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率相對最高，平均值達94.95％，說明經(jīng)堿性蛋白酶降解豬血紅蛋白所得的肽類物質(zhì)有較好的DPPH自由基清除效果。

2.4.1 回歸模型的建立及可靠性檢驗

對表1中的17個試驗點響應值進行回歸擬合，得回歸模型方程：Y＝94.55+6.28X1-0.60X2+2.44X3-3.25X1X2-0.18X1X3-1.06X2X3-5.74X12-3.43X22-3.34X32

上述回歸模型的可靠性可通過方差分析及相關系數(shù)來考察，方差分析如表2所示。

表2 回歸模型方差分析結果Table2 Analysis of variance for regression model

回歸方程中各變量對指標（響應值）影響的顯著性由F檢驗來判定，概率（P）越小，則相應變量的顯著程度越高[20]。表2結果顯示：此模型的P＜0.000 1，響應面回歸模型達到極顯著水平；方程復相關系數(shù)的平方R2為0.986 2，說明回歸效果較好，98.62％的變化能通過該模型解釋。同時，一次項X1、X3，交互項X1X2，二次項X12、X22、X32對酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均有顯著影響；且回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值大小說明試驗中溫度對酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率影響最大，其次是酶量，pH值影響則最小。

2.4.2 酶解條件的優(yōu)化㈦驗證

對回歸模型分析可得到豬血紅蛋白的最佳酶解條件為：酶解溫度58.37℃，pH7.76，加酶量6.42％，此時預測的酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率可達97.32％。為酶解條件優(yōu)化驗證的便利，選擇條件為溫度58℃，pH7.7，加酶量6.5％進行3次試驗，測得酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率為96.94％，㈦預測值97.32％接近，相對誤差為0.39％，說明試驗結果㈦模型擬合良好，適于對豬血紅蛋白的堿性蛋白酶解條件進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結論

1）試驗確定冰浴+超聲波粉碎為豬血紅細胞的最佳破碎方式，其破碎率高達97.1％。

2）以DPPH自由基清除率為指標，確定堿性蛋白酶為豬血紅蛋白抗氧化肽制備的最佳⒚酶；同時，建立一個以清除率為目標值，以時間、酶⒚量和pH為因子的回歸模型：Y＝94.55+6.28X1-0.60X2+2.44X3-3.25 X1X2-0.18X1X3-1.06X2X3-5.74X12-3.43X22-3.34X32。方差分析結果表明該模型可較好闡釋和預測豬血紅蛋白產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解條件的變化規(guī)律。

3）對建立的回歸模型進行驗證試驗并優(yōu)化得到的最佳酶解條件為：溫度58℃，pH7.7，加酶量6.5％，此條件下的DPPH自由基清除率為96.94％。

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Research on Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions of Porcine Hemoglobin and Its Antioxidant Properties

ZHANG Bin1， HOU Xiao-zhen1， YANG Sheng-yuan2， CAI Si-bing1，ZHU Yan-na1
（1.School of Food Engineering and Biotechnology， Hanshan Normal College，Chaozhou 521041， Guangdong，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering， Lingnan Normal University， Zhanjiang 524048，Guangdong， China）

Taking pig blood as raw material and scavenging rate of DPPH free radical as index，antioxidants peptide was prepared with enzymatic hydrolysis method，and the optimal enzymatic hydrolysis conditions were achieved by response surface methodology.Results showed that broken rate of red blood cells could reach 97.1％by treatment of ultrasonication in ice bath，alkaline protease was selected as the better enzyme for preparation of antioxidant peptides from hydrolyzed pig haemoglobin.Under the optimal enzymatic hydrolysis conditions of temperature 58℃，pH 7.7，enzyme concentration 6.5％，the actual scavenging rate of DPPH free radical reached 96.94％，which was consistent with the predicted results.

porcine hemoglobin； enzymatic hydrolysis； antioxidant； response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.020

2017-03-06

廣東省省部產(chǎn)學研結合項目（2013B090600001）；廣東普通高校工程技術開發(fā)中心項目“粵東食品加工㈦安全控制工程技術開發(fā)中心”（GCZX-A1415）

章斌（1981—），男（漢），副教授，碩士，從事食品加工㈦質(zhì)量安全的研究㈦教學工作。