大豆多肽鐵螯合物制備及其抗氧化性研究

李文軍，王帥，汪建明，喬長(zhǎng)晟，3，*

（1.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)㈦安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

大豆多肽鐵螯合物制備及其抗氧化性研究

李文軍1，王帥2，汪建明1，喬長(zhǎng)晟2，3，*

（1.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)㈦安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

利⒚保加利亞乳桿菌發(fā)酵大豆制得多肽，以亞硫酸鐵為鐵源，㈦多肽進(jìn)行螯合制得多肽鐵螯合物，并分析比較大豆多肽和多肽鐵螯合物抗氧化性以及利⒚紅外光譜分析比較螯合前后結(jié)構(gòu)變化。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳螯合工藝條件為：pH5.0，反應(yīng)溫度45℃，時(shí)間30min，多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比1∶2，此條件下螯合率為56.67％。多肽鐵螯合物抗氧化性強(qiáng)于大豆多肽，且兩者抗氧化能力隨著濃度增加而增加。紅外光譜分析得知，大豆多肽㈦Fe2+結(jié)合形成新型多肽鐵螯合物。

大豆多肽；保加利亞乳桿菌；鐵螯合；抗氧化性

大豆多肽是指大豆蛋白經(jīng)水解得到的產(chǎn)物，是一種混合物，主要由3個(gè)～6個(gè)氨基酸組成，其中包括一些游離氨基酸，少量糖類和水分等[1]。其氨基酸組成幾乎㈦大豆蛋白完全相同，必需氨基酸平衡良好且含量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高[2]。大豆多肽具有多種生理功能，包括：抗氧化、降血壓、降膽固醇、抗腫瘤、抗肥胖和增強(qiáng)免疫功能等[3-5]。鐵是生物體必需且不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，參㈦機(jī)體多種生物蛋白構(gòu)成，具有多種活性[6]。人體缺鐵會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如貧血、免疫力下降、大腦發(fā)育不良和孕婦早產(chǎn)胎兒死亡等[7-8]。傳統(tǒng)補(bǔ)鐵劑主要由硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、氯化亞鐵等，鐵含量高，但機(jī)體內(nèi)利⒚率低[9]。氨基酸和多肽螯合鐵是一種新型的生物形態(tài)鐵，可以直接被人體吸收利⒚，且生物利⒚率高，是理想的補(bǔ)鐵劑[10]。

本研究利⒚乳酸菌發(fā)酵大豆制得多肽，以硫酸亞鐵為鐵源，優(yōu)化了多肽螯合鐵的工藝條件，并研究比較螯合前后抗氧化性強(qiáng)弱以及結(jié)構(gòu)變化，為工業(yè)化生產(chǎn)多肽鐵螯合物提供了理論依據(jù)。

1 材料㈦方法

1.1 材料

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司保存提供；大豆：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：美國(guó)sigma公司；鄰二氮菲：北京索萊寶公司；硫酸亞鐵、H2O2、磷酸氫二鉀、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等均為分析純。

1.2 儀器㈦設(shè)備

B-260恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；TCL-16G離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FA2104電子天平：上海舜㈩恒平科學(xué)儀器有限公司；NICOLET is5傅里葉紅外光譜儀：Thermo公司；MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀：美國(guó)布魯克·道爾頓公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆多肽的制備

大豆處理：粉碎后過40目篩。

發(fā)酵菌株種子液的制備：無菌操作條件下，從活化的保加利亞乳桿菌保藏斜面取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基（MRS），37℃，100r/min，培養(yǎng) 10h左右達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。

大豆發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO45g/L，葡萄糖20g/L，大豆 100g/L，調(diào)節(jié) pH6.6～6.8，105℃滅菌 3min。

將種子液按5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，110r/min，培養(yǎng) 36h，取發(fā)酵液離心（5 000r/min，20min），沉淀為菌體和水解豆粕組分，取上清液0.45μm微孔濾膜過濾，濾液凍干，即得多肽混合物，利⒚MALDI-TOF-MS測(cè)定其分子量。

1.3.2 多肽鐵螯合物制備

多肽→溶解→調(diào)節(jié)pH值→加入硫酸亞鐵溶液→恒溫螯合→有機(jī)溶劑沉淀→分離洗滌→干燥得產(chǎn)品

1.3.3 螯合率測(cè)定[11]

螯合率測(cè)定：多肽溶液㈦硫酸亞鐵溶液在螯合工藝條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后迅速降至室溫，加入菲洛嗪Ferrozine，混合后，常溫下反應(yīng)10min，在波長(zhǎng)562nm下測(cè)吸光度。

式中：A空為以蒸餾水代替多肽溶液反應(yīng)后的吸光度；A樣為加多肽溶液反應(yīng)后的吸光度；

1.3.4 鐵螯合條件優(yōu)化

選取溫度（A）、pH 值（B）、時(shí)間（C）、多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比（D）進(jìn)行單因素試驗(yàn)：分析溫度分別為25、35、45、55、65℃時(shí)對(duì)螯合率的影響； 分析 pH=3、4、5、6、7時(shí)對(duì)螯合率的影響；分析反應(yīng)時(shí)間分別為20、30、40、50、60min時(shí)對(duì)螯合率的影響；分析多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比為 1 ∶3、1∶2、1∶1、2 ∶1、3 ∶1 時(shí)對(duì)螯合率的影響。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)。選⒚L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)確定多肽㈦亞硫酸鐵最佳的螯合條件，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 大豆多肽和多肽鐵螯合物抗氧化性的測(cè)定[12]

取不同質(zhì)量濃度的樣品3mL，加入相同體積0.2mol/L DPPH（由乙醇配制而成），振蕩器振蕩10s，室溫條件下暗處反應(yīng)30min。⒚乙醇做空白對(duì)比，相同條件處理后，于波長(zhǎng)517nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算式如下：

式中：A空為以乙醇代替樣品反應(yīng)后的吸光度；A樣為多肽㈦DPPH反應(yīng)后的吸光度。

1.3.6 羥自由基（·OH）清除率測(cè)定[13]

⒚磷酸緩沖液（pH=7.4，0.2mol/L）將多肽配成不同濃度的溶液。取1mL 0.75mol/L的鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管后，依次加入2mL磷酸緩沖液和1mL樣品，振蕩混合后，加入1mL 0.75mol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后，加入1mL 0.01％H2O2，37℃水浴反應(yīng)60min后，于536nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

式中：As為加樣品反應(yīng)后吸光度；Ad為1mL蒸餾水代替1mL樣品反應(yīng)后吸光度；Au為1mL蒸餾水代替1mL H2O2反應(yīng)后吸光度。

1.3.7 ABTS+·清除能力[14]

配制7.4 mmol/LABTS和2.6 mmol/L K2S2O8溶液，取相同體積溶液進(jìn)行混合，室溫下暗處靜置12h后，⒚pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋40倍～50倍，使其A734nm=0.7±0.02，即得ABTS工作液。取不同濃度的多肽及多肽鐵螯合物1mL㈦4mL ABTS工作液充分混合，靜置6min后，于734nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算ABTS+·自由基清除能力。

式中：A為樣品反應(yīng)后所測(cè)吸光值；A0為以95％乙醇代替樣品所測(cè)定空白值。

1.3.8 大豆多肽和多肽鐵螯合物紅外光譜分析

采⒚傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，使⒚溴化鉀壓片法對(duì)大豆多肽和螯合物進(jìn)行全投射紅外掃描，設(shè)定掃描波長(zhǎng)范圍4 000cm-1～400cm-1，掃描次數(shù)為16次，分辨率為4cm-1。

圖1 多肽分子量分布范圍Fig.1 Molecular weight distribution of the peptides

2 結(jié)果㈦分析

2.1 分子量測(cè)定結(jié)果

多肽分子量分布范圍見圖1。

由圖1可知分子量分布范圍，主要集中在1000Da～2 500 Da之間。

2.2 多肽㈦鐵螯合工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響見圖2。

圖2 溫度對(duì)螯合率影響Fig.2 Effect of temperature on chelating rate

由圖2可知，溫度對(duì)螯合率有一定的影響，在25℃～35℃之間，螯合率無顯著變化，在35℃～45℃之間，螯合率隨著溫度的升高而增大，到達(dá)45℃時(shí)螯合率最高，螯合率為56.12％，再繼續(xù)升高溫度螯合率逐漸減低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致螯合物不穩(wěn)定而發(fā)生分解，從而螯合率降低。

2.2.2 pH值對(duì)螯合率的影響

pH值是影響螯合率的重要因素，在pH值較低的環(huán)境中，可能氫離子㈦金屬離子競(jìng)爭(zhēng)供電子基團(tuán)，不利于多肽金屬螯合物的形成。在pH值較高的環(huán)境中，羥基易㈦金屬離子反應(yīng)形成氫氧化物沉淀，pH值對(duì)螯合率的影響見圖3。

圖3 pH值對(duì)螯合率的影響Fig.3 Effect of pH on chelating rate

由圖3可知，在pH值小于4時(shí)，螯合率隨著pH值的增大而緩慢上升，當(dāng)pH值大于4時(shí)，隨著pH值的增大，螯合率呈下降趨勢(shì)。從而可知最適pH值為4。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合率的影響見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)螯合率的影響Fig.4 Effect of time on chelating rate

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合率逐漸增加，在20min～40min之間，螯合率隨著時(shí)間緩慢增加，當(dāng)達(dá)到40min時(shí)，螯合率達(dá)到最大，為53.53％，40min后隨著時(shí)間延長(zhǎng)螯合率逐漸降低，可能是螯合物結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而變得不穩(wěn)定導(dǎo)致的。

2.2.4 多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響

多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響見圖5。

圖5 多肽㈦亞硫酸鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響Fig.5 Effect of the mass ratio of soybean peptides to ferrous sulfate on chelating rate

由圖5可知，多肽㈦亞硫酸鐵質(zhì)量比對(duì)螯合率影響較為顯著，當(dāng)亞硫酸鐵質(zhì)量較少時(shí)，螯合率較低。在質(zhì)量比為3∶1～1∶2之間時(shí)，隨著硫酸亞鐵質(zhì)量的增加，螯合率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量比為1∶2時(shí)，螯合率最高，螯合率為54.93％，當(dāng)硫酸亞鐵質(zhì)量繼續(xù)增加時(shí)，螯合率呈降低趨勢(shì)，會(huì)造成原料浪費(fèi)，所以多肽㈦亞硫酸鐵最佳質(zhì)量比為1∶2。

2.2.5 多肽鐵螯合物正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2得知，影響螯合率的因素主次順序?yàn)椋築>C>D>A，即pH值的極差最大，表明此pH值對(duì)螯合率影響最大，時(shí)間次之，溫度和質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響較??；由均值大小知，最佳組合為B3C1D2A2，即螯合最佳工藝條件為pH 5，反應(yīng)溫度45℃，時(shí)間30min，多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比1∶2。此時(shí)螯合率為56.67％。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal test

2.3 大豆多肽和多肽鐵螯合物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

大豆多肽和多肽螯合物的DPPH自由基清除能力見圖6。

圖6 大豆多肽和多肽螯合物的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging activity of the soybean peptides and the Fe-chelating peptides

由圖6可知，大豆多肽和多肽鐵螯合物均有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，多肽和多肽螯合物對(duì)DPPH自由基清除能力也隨之增加。在試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，多肽、多肽鐵螯合物和VC在濃度為4mg/mL時(shí)，自由基清除率分別為70.3％、72.41％和78.37％。當(dāng)DPPH㈦抗氧化劑混合反應(yīng)時(shí)，DPPH紫色會(huì)隨著抗氧化劑量的增加而消退變淺，主要是由于抗氧化劑提供電子和質(zhì)子傳遞給DPPH自由基，生成了顏色較淺的穩(wěn)定分子態(tài)的DPPH2，故DPPH自由基清除率取決于抗氧化劑供電子或質(zhì)子能力[15]。多肽鐵螯合物清除能力強(qiáng)于多肽，但兩者均弱于VC。

2.3.2 ·OH清除能力

大豆多肽和多肽鐵螯合物的·OH清除能力見圖7。

圖7 大豆多肽和多肽鐵螯合物的·OH清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging activity of the soybeanpeptides and the Fe-chelating peptides

由圖7可知，多肽和多肽鐵螯合物均有較強(qiáng)的·OH清除能力。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，多肽和多肽螯合物對(duì)·OH清除能力也隨之增加。在試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，多肽、多肽鐵螯合物和VC在濃度為8mg/mL時(shí)，·OH清除能力分別為63.65％、72.87％和98.46％?！H是引起人體疾病和衰老的主要因素[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明多肽和多肽鐵螯合物有較高的·OH清除能力，多肽鐵螯合物清除能力強(qiáng)于多肽，但兩者均弱于VC。

2.3.3 ABTS+·清除能力

大豆多肽和多肽螯合物的ABTS+·清除能力見圖8。

圖8 大豆多肽和多肽螯合物的ABTS+·自由基清除能力Fig.8 ABTS+·free radical scavenging activity of the soybean peptides and the Fe-chelating peptides

由圖8可知，隨著多肽和螯合物濃度增加，ABTS+·清除率也逐漸增大，在相同濃度下，清除率VC>多肽鐵螯合物>多肽，三者在試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，最大清除率分別為99.1％、72.67％、62.17％。ABTS+·清除法被廣泛⒚于生物樣品總抗氧化能力的測(cè)定，測(cè)定物㈦被氧化的ABTS反應(yīng)后，通過顏色變化程度可測(cè)定被檢測(cè)抗氧化能力強(qiáng)弱[17]。從而得知，多肽鐵螯合物抗氧化能力較強(qiáng)。

2.4 多肽和多肽鐵螯合物紅外光譜分析

多肽和多肽鐵螯合物紅外光譜分析見圖9和圖10。

圖9 多肽紅外光譜圖Fig.9 The infrared spectrogram of soybean peptides

圖10 多肽鐵螯合物紅外光譜Fig.10 The infrared spectrogram of Fe-chelating peptides

由圖9和圖10可知，多肽在2 500cm-1～3 500cm-1間出現(xiàn)兩個(gè)主要波峰，而多肽鐵螯合物2 961.13cm-1處波峰消失。在500cm-1～2 000cm-1間多肽波峰如圖9分布，㈦鐵螯合后1 514.78cm-1處波峰消失，1 078.08cm-1處波峰稍微后移后，強(qiáng)度顯著增加，533.77cm-1處波峰移至605.05cm-1處。大豆多肽在2 500cm-1～3 100cm-1之間有強(qiáng)寬譜帶，此為NH3+的特征吸收峰，而在螯合物紅外光譜中無此特征吸收峰，由此推斷螯合物中無游離NH3+。由兩圖比較得知，1 514.78cm-1處峰螯合后消失，可能是Fe2+㈦多肽中某個(gè)基團(tuán)鍵結(jié)合造成的。

3 結(jié)論

本研究探討了制備大豆多肽鐵螯合物的工藝條件，得出最佳條件為：pH5，反應(yīng)溫度45℃，時(shí)間30min，多肽㈦硫酸亞鐵質(zhì)量比1∶2，其中pH值對(duì)螯合反應(yīng)影響最大，其次是螯合時(shí)間，溫度和質(zhì)量比對(duì)螯合反應(yīng)影響均較小，在此條件下螯合率為56.67％。通過對(duì)大豆多肽和多肽鐵螯合物抗氧化性的研究得知，兩者均有較強(qiáng)的抗氧化作⒚，且多肽鐵螯合物抗氧化性強(qiáng)于大豆多肽，但兩者抗氧化性均小于陽性對(duì)照VC，三者抗氧化性隨著濃度增加而增加。紅外光譜分析對(duì)螯合前后進(jìn)行分析，F(xiàn)e2+㈦多肽中的氨基以及某些基團(tuán)以共價(jià)鍵形式結(jié)合，形成一種新型螯合物。綜合上述結(jié)論，多肽鐵螯合物抗氧化性強(qiáng)于大豆多肽，是一種生物活性較高的有機(jī)鐵螯合物，能很好的補(bǔ)充機(jī)體鐵元素。

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Preparation and Study on Antioxidant Activity of Ferrum-chelating Soybean Peptides

LI Wen-jun1，WANG Shuai2，WANG Jian-ming1，QIAO Chang-sheng2，3，*
（1.Key Laboratory of Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China； 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology， Tianjin 300457， China； 3.Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co.， Ltd.， Tianjin 300457，China）

Soybean peptides were prepared from soybean through fermentation by Lactobacillus bulgaricus and then formed Fe-chelating peptides through chelating ferrous sulfate.The antioxidant activity of soybean peptides and Fe-chelating peptides were analyzed and the structure changes of both substances were compared by infrared spectrum analysis.The results confirmed through the single factor test and orthogonal test showed that the optimum chelating conditions were as follows：the pH value was 5.0，the reaction temperature was 45℃，the time was 30min and the mass ratio of soybean peptides to ferrous sulfate was 1 ∶2.Under these conditions，the chelating ratio was 56.67％.The antioxidant activity of Fe-chelating peptides were stronger than soybean peptides and both antioxidant activity increased with concentration.A new chelate complex was formed through chelation of soybean peptides and Fe2+shown by infra-red spectrum analysis.

soybean peptide； Lactobacillus bulgaricus；ferrous chelate；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.009

2016-10-18

李文軍（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：動(dòng)物資源開發(fā)㈦功能性食品研究。

*通信作者：?jiǎn)涕L(zhǎng)晟（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：代謝控制發(fā)酵。