5種抗生素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量的影響

張彥慧+張文慧+姜智飛+高金偉+竇勇+周文禮+高建忠

摘 要：裸藻是一種重要的資源微藻，富含豐富的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和裸藻糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且裸藻沒(méi)有細(xì)胞壁，其營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)于其他藻類更容易被人體、水產(chǎn)動(dòng)物吸收，因此開(kāi)展裸藻集約化培養(yǎng)及養(yǎng)殖環(huán)境優(yōu)化具有十分重要的意義。為了研究裸藻的無(wú)菌化養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)生態(tài)條件下，研究了不同濃度的5種抗生素（遺傳霉素、氯霉素、青霉素、土霉素和鏈霉素）脅迫對(duì)纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）蛋白含量的影響。結(jié)果表明：低于25 μg/mL的遺傳霉素即可對(duì)裸藻蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生抑制，200 μg/mL的氯霉素一定時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)纖細(xì)裸藻蛋白的合成。

關(guān)鍵詞：抗生素；纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）；蛋白含量；脅迫；響應(yīng)

裸藻（Euglena）已在地球上存在五億年以上，同時(shí)具有動(dòng)物與植物兩種特性，是動(dòng)植物共同的祖先，于17世紀(jì)被荷蘭生物學(xué)家列文虎克發(fā)現(xiàn)并命名。裸藻為淡水性單細(xì)胞生物，處于食物鏈的最底端，生活在陽(yáng)光充足、有機(jī)質(zhì)豐富的水體中，纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）屬于裸藻門、裸藻屬，通過(guò)縱分裂進(jìn)行繁殖，為兼性營(yíng)養(yǎng)型[1]，既可以利用葡萄糖等有機(jī)物生長(zhǎng)[2-4]，又可以進(jìn)行光合作用自己制造營(yíng)養(yǎng)，有效地固定環(huán)境中的CO2[5]。纖細(xì)裸藻含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物營(yíng)養(yǎng)物、玉米黃質(zhì)、葉綠素、黃體素、GABA（γ-氨基丁酸）等59種人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，其中裸藻多糖是裸藻屬特有的成分，可以吸附人體中多余物質(zhì)，如膽固醇、中性脂肪、重金屬、酒精等，并將其排出體外，具有強(qiáng)效抗氧化、抗病毒的作用。

抗生素在調(diào)節(jié)和控制微藻生長(zhǎng)發(fā)育方面的作用及其作用機(jī)理引起了廣大學(xué)者的關(guān)注[6]。纖細(xì)裸藻蛋白含量對(duì)抗生素脅迫的響應(yīng)，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。目前已有學(xué)者研究了UV-B[7-9]、原油[10]、抗生素[11-12]脅迫下以及無(wú)菌[13-14]條件下，微藻的生長(zhǎng)變化規(guī)律。本文在此研究基礎(chǔ)上，選取5種抗生素，實(shí)驗(yàn)室條件下初步探討了5種抗生素脅迫對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量的影響，并分析了可能的作用機(jī)理，以期為纖細(xì)裸藻無(wú)菌體系的建立提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 微藻及培養(yǎng)

纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）由中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)提供。培養(yǎng)基為AF-6培養(yǎng)液配方，使用去離子水配制，121.3 ℃下滅菌20 min后使用。培養(yǎng)溫度：（25±1） ℃，光照：60 μmol·m-2·s-1，光暗比12 L∶12 D。每天搖瓶數(shù)次，以防止纖細(xì)裸藻附壁或下沉。

1.2 抗生素處理

遺傳霉素（Geneticin，G418）、氯霉素（Chloramphenicol，Cm）、青霉素（Penicillin）、土霉素（Oxytetracycline）和鏈霉素（Streptomycin）購(gòu)自索萊寶公司?？股啬敢旱呐渲茀⒄账_姆布魯克等，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器（0.22 μm）抽濾滅菌后使用。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將G418、Cm、Penicillin、Oxytetracycline和Streptomycin母液分別加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的纖細(xì)裸藻培養(yǎng)液中，抗生素的終濃度為0，25，50，75，100和200 μg/mL（G418為0、25、50、75、100和125 μg/mL），實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持抗生素終濃度不變。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

纖細(xì)裸藻的初始接種密度為：5×105個(gè)/mL，實(shí)驗(yàn)總體積為1 500 mL（每瓶100 mL，3個(gè)平行，5個(gè)處理組），抗生素處理后，每1 d取一次樣，用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SigmaPlot 10.0整理數(shù)據(jù)及繪制圖形，SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），設(shè)定顯著性水平為P<0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 遺傳霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量變化

裸藻蛋白含量對(duì)遺傳霉素脅迫的響應(yīng)變化較為復(fù)雜（圖1），G418的刺激作用和抑制效應(yīng)交替顯現(xiàn)，無(wú)明顯規(guī)律，且G418的作用未表現(xiàn)濃度依賴的特征。實(shí)驗(yàn)前2天遺傳霉素明顯刺激了裸藻細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，蛋白含量迅速上升，尤其是實(shí)驗(yàn)第2 d各G418處理組蛋白水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。此后裸藻細(xì)胞蛋白含量開(kāi)始回落并呈現(xiàn)起伏變化，從實(shí)驗(yàn)第6天起蛋白水平急劇下降并維持較低水平，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束抗生素處理組裸藻蛋白含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.2 氯霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量變化

在氯霉素作用下，裸藻細(xì)胞的蛋白含量經(jīng)歷了先升高后降低的變化過(guò)程（圖2）。實(shí)驗(yàn)前4 天蛋白水平總體處于上升階段，從第6天開(kāi)始蛋白含量開(kāi)始下降，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氯霉素對(duì)裸藻蛋白合成的影響與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第1天氯霉素濃度與細(xì)胞蛋白含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，此后氯霉素對(duì)蛋白合成的刺激效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，尤其是200 μg/mL組促進(jìn)作用最為明顯。從第5天開(kāi)始低劑量（25 μg/mL）和高劑量（100和200 μg/mL）交替成為促進(jìn)裸藻蛋白合成的最適濃度，這也反映了氯霉素對(duì)微藻作用的復(fù)雜。

2.3 青霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量變化

在青霉素脅迫作用下，裸藻蛋白含量波動(dòng)起伏較大，蛋白水平出現(xiàn)了兩個(gè)峰值（圖3）。實(shí)驗(yàn)前2天青霉素刺激了裸藻細(xì)胞的蛋白合成，在第2天達(dá)到第一個(gè)峰值，第3天蛋白含量有所下降，此后逐漸回升，至實(shí)驗(yàn)第5和6天裸藻蛋白含量達(dá)到第二個(gè)高峰，此后細(xì)胞的蛋白合成逐漸受到抑制，蛋白含量迅速回落，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)裸藻細(xì)胞蛋白含量已經(jīng)低于初始水平。青霉素濃度對(duì)裸藻蛋白的影響無(wú)明顯規(guī)律，劑量依賴特征不顯著。

2.4 土霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量變化

在土霉素作用下，裸藻蛋白含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖4）。實(shí)驗(yàn)前4天裸藻細(xì)胞的蛋白合成受到土霉素刺激，微藻蛋白含量增長(zhǎng)較快，從第5天起裸藻的蛋白合成過(guò)程逐漸受到抗生素抑制，蛋白水平迅速下降，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各處理組裸藻細(xì)胞內(nèi)蛋白含量均低于初始水平。不同的實(shí)驗(yàn)階段，土霉素濃度對(duì)裸藻蛋白合成的影響差異較大，促進(jìn)作用和抑制效應(yīng)交替出現(xiàn)，未呈現(xiàn)規(guī)律性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.5鏈霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白含量變化

在鏈霉素作用下，纖細(xì)裸藻的蛋白含量起伏變化較大（圖5）。實(shí)驗(yàn)前3天鏈霉素處理組裸藻蛋白水平呈上升趨勢(shì)，此后蛋白含量經(jīng)歷了較大起伏，從第7天起逐漸下降并維持較低水平。實(shí)驗(yàn)前3天鏈霉素對(duì)裸藻蛋白合成主要起抑制作用，各抗生素處理組蛋白水平均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），此后鏈霉素對(duì)裸藻蛋白合成的作用呈現(xiàn)促進(jìn)和抑制交替出現(xiàn)的情況，未顯示明顯規(guī)律。

3 討論

G418是一種氨基糖苷類抗生素，通過(guò)干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核細(xì)胞產(chǎn)生毒性。有研究[15]指出NptⅡ（Neomycin phosphotransferase-Ⅱ）基因編碼產(chǎn)物能夠通過(guò)酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生素失活而降低毒性，但是一般微藻細(xì)胞NptⅡ基因表達(dá)產(chǎn)物本底值極少，因此許多微藻對(duì)G418脅迫十分敏感。周文禮等[16]證實(shí)，較低劑量的G418即可顯著降低小球藻、金藻、新月菱形藻的葉綠素a含量，而本研究也發(fā)現(xiàn)，裸藻蛋白含量對(duì)遺傳霉素脅迫的響應(yīng)變化較為復(fù)雜，G418的刺激作用和抑制效應(yīng)交替顯現(xiàn)，無(wú)明顯規(guī)律，且G418的作用未表現(xiàn)濃度依賴的特征。鏈霉素也同屬氨基糖苷類抗生素家族，其作用機(jī)理與G418十分接近。在本研究中受到鏈霉素脅迫時(shí)，纖細(xì)裸藻蛋白含量起伏變化較大。以上結(jié)果也進(jìn)一步印證了G418和鏈霉素不適合作為建立微藻無(wú)菌系所使用的抗生素。

氯霉素是從委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中分離提取的廣譜抗生素，對(duì)許多需氧革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌、厭氧的菌質(zhì)體都有抑制作用[7]。不同微藻對(duì)氯霉素的脅迫敏感性有顯著差異，有人發(fā)現(xiàn)亞心形扁藻對(duì)25 μg/mL的氯霉素敏感[17]，而200 μg/mL的劑量才能顯著抑制小球藻生長(zhǎng)[18]，本研究中，實(shí)驗(yàn)2～4天氯霉素對(duì)蛋白合成的刺激效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，尤其是200 μg/mL組促進(jìn)作用最為明顯。在不同時(shí)間點(diǎn)25～200 μg/mL的氯霉素對(duì)纖細(xì)裸藻蛋白合成存在促進(jìn)和抑制交替顯現(xiàn)的混合效應(yīng)，這可能與裸藻特殊的生理構(gòu)造與代謝特征有關(guān)。

青霉素通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合，阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁合成從而發(fā)揮殺菌作用。有研究指出低濃度青霉素一方面可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)核酸與蛋白合成來(lái)提高葉綠素水平，另一方面能借助降低細(xì)胞中葉綠素酶活力來(lái)抑制葉綠素降解，從而提高細(xì)胞葉綠素含量[19]，而本研究發(fā)現(xiàn)在青霉素脅迫作用下，裸藻蛋白含量波動(dòng)起伏較大，青霉素濃度對(duì)裸藻蛋白的影響無(wú)明顯規(guī)律，劑量依賴特征不顯著。其原因可能與裸藻沒(méi)有細(xì)胞壁從而使青霉素?zé)o作用位點(diǎn)有關(guān)。本研究證實(shí)在土霉素作用下，裸藻生長(zhǎng)和大分子合成受到抑制，實(shí)驗(yàn)后期蛋白含量大幅下降，這可能與土霉素可以誘導(dǎo)微藻細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，對(duì)細(xì)胞造成不同程度的氧化損傷，從而發(fā)揮其生物毒性有關(guān)，這也證明了土霉素不適合作為作為建立微藻無(wú)菌系所使用的抗生素。

4 結(jié)論

纖細(xì)裸藻對(duì)遺傳霉素G418、鏈霉素和土霉素的敏感性較強(qiáng)，G418、土霉素和鏈霉素不適合作為建立裸藻無(wú)菌系所使用的抗生素。

200 μg/mL的氯霉素一定時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)纖細(xì)裸藻蛋白的合成，氯霉素可以作為裸藻無(wú)菌系建立的備選抗生素。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ahmadinejad N，Dagan T，Martin W.Genome history in the symbiotic hybrid Euglena gracilis[J].Gene，2007，402（1–2）：35-39

[2] Takeyama H，Kanamaru A，Yoshino Y，et al.Production of antioxidant vitamins，β‐carotene，vitamin C，and vitamin E，by two‐step culture of Euglena gracilis Z[J].Biotechnology & Bioengineering，1997，53（2）：185-190

[3] Afiukwa C A，Ogbonna J C.Effects of mixed substrates on growth and vitamin production by Euglena gracilis[J].African Journal of Biotechnology，2007，6（22）：2612-2615.

[4] Ogbonna J C.Microbiological production of tocopherols： current state and prospects[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（2）：217

[5] Pulz O，Gross W.Valuable products from biotechnology of microalgae[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65（6）：635-648

[6] Metcalfe D D，Astwood J D，Townsend R，et al.Assessment of the allergenic potential of foods derived from genetically engineered crop plants[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1996，36 Suppl（Supp 001）：S165

[7] 周立明，孟祥紅，肖慧，等.3種多環(huán)芳烴和UV-B輻射對(duì)3種赤潮微藻生長(zhǎng)的作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2006，52（6）：773-777

[8] Yu J， Tang X， Zhang P， et al. Effects of CO2 enrichment on photosynthesis， lipid peroxidation and activities of antioxidative enzymes of Platymonas subcordiformis subjected to UV-B radiation stress[J]. Acta Botanica Sinica， 2004， 46（6）：682-690.

[9] 周文禮.小球藻（Chlorella vulgaris）與共棲異養(yǎng)細(xì)菌相互作用及其對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)[D].中國(guó)海洋大學(xué)，2008

[10] 馬帥，曲良，李曉紅，等.四種溢油分散劑對(duì)青島大扁藻和小新月菱形藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響[J].生態(tài)科學(xué)，2015，34（6）：9-15

[11] 麻曉霞，馬麗萍，石勛祥，等.微藻對(duì)常用抗生素敏感性的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012，40（1）：83-86

[12] 周文禮，王悠，肖慧，等.不同海洋餌料微藻對(duì)抗生素的敏感性差異分析[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2007，53（2）：249-254

[13] Sena L，Rojas D，Montiel E，et al.A strategy to obtain axenic cultures of Arthrospira spp.cyanobacteria[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（5）：1045-1053

[14] 林偉.幾種海洋微藻的無(wú)菌化培養(yǎng)[J].海洋科學(xué)，2000，24（10）：4-6

[15] Vassortbruneau C，Lesagedescauses M C，Martel J L，et al.CAT III chloramphenicol resistance in Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida isolated from calves[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，1996，38（2）：205

[16] 周文禮，王悠，肖慧，等.三種海洋微藻葉綠素a含量對(duì)抗生素脅迫的響應(yīng)變化[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，37（6）：957-960

[17] 屈建航.5種綠藻對(duì)幾種常用抗生素的敏感性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（2）：111-113

[18] Zhou W，Wang Y，Xiao H，et al.Sensitivity of Several Marine Microalga to Antibiotics[J].Journal of Wuhan University，2007，53（2）：249-254

[19] 劉萍，丁義峰，齊付國(guó)，等.醫(yī)用抗生素對(duì)高等植物的作用研究現(xiàn)狀[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然版），2004，32（2）：66-70