芳香化酶（P450arom）在黃鱔性腺、腦組織中的定位

張厚梅+王琳

摘 要：為了揭示芳香化酶與黃鱔（Monopterus albus）性逆轉(zhuǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系和作用機(jī)理，以不同性別黃鱔的性腺和腦組織為試驗(yàn)材料，采用免疫組化方法檢測(cè)芳香化酶在不同性別黃鱔的性腺和腦組織上的定位及其變化趨勢(shì)。免疫組化結(jié)果顯示：在雌性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上，卵膜、胞核和不成熟的卵母細(xì)胞呈陰性；在雌雄間性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在的退化卵母細(xì)胞膜和縱隔上；在雄性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在各級(jí)精母細(xì)胞上。芳香化酶在腦組織中均有分布，并且其染色程度隨著黃鱔由雌性轉(zhuǎn)換為雄性而趨于減弱。這意味著黃鱔性腺和腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程，且與其性別轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；芳香化酶；性逆轉(zhuǎn)

中圖分類號(hào)：S965.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，胚胎的早期，原始性腺是呈中性的，它具有分化為卵巢或精巢的雙向潛能。在魚(yú)類進(jìn)化過(guò)程中，鹽度、pH值、溫度以及外源性激素等均可影響其性別分化的方向。芳香化酶能催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，它是性腺分化的核心酶，芳香化酶可能調(diào)控著性別分化的方向。李廣麗[1]用芳香化酶抑制劑進(jìn)行腹部埋植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清11-酮基睪酮水平顯著提高，且能誘導(dǎo)赤點(diǎn)石斑魚(yú)（Epinephelus arkoya）由雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌?。另外，在性別形成階段，使用芳香化酶抑制劑可以使基因型為雌性的羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）、鮭魚(yú)（Oncorhvnchus tschawytscha）轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄孕坌贼~(yú)[2-3] 。到目前為止，已有斑馬魚(yú)（Barchydanio rerio）、羅非魚(yú)等[4-5]的芳香化酶基因片段被分離和克隆，并研究了該基因與性別分化的關(guān)系。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，芳香化酶與魚(yú)類性別分化密切相關(guān)。黃鱔（Monopterus albus），隸屬于合鰓目、合鰓科，是我國(guó)主要淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品之一。黃鱔從胚胎發(fā)生階段到性成熟階段， 都為雌性， 性成熟以后即可產(chǎn)生卵子， 但在產(chǎn)卵以后， 卵巢慢慢退化消失，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫玻?隨后就可以產(chǎn)生成熟精子，變?yōu)樾坌?，即具有極為罕見(jiàn)的性逆轉(zhuǎn)生理現(xiàn)象。目前，關(guān)于芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細(xì)胞學(xué)分布規(guī)律仍較少研究。

本試驗(yàn)以黃鱔為試驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用免疫組化技術(shù)系統(tǒng)觀察芳香化酶在黃鱔腦組織、性腺上的細(xì)胞學(xué)分布規(guī)律，為進(jìn)一步探討芳香化酶如何調(diào)控動(dòng)物生殖活動(dòng)的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

2016年4-12月份，從安徽省肥西縣境內(nèi)共采購(gòu)活體野生黃鱔128尾，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，隨后分批進(jìn)行解剖，收集黃鱔性腺和腦垂體，試驗(yàn)時(shí)，黃鱔體重為50～180 g，兔抗P450arom 抗體（A7981）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，PV-9000兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物處理 將上述黃鱔處死，迅速分離大腦、性腺等組織，立即投入多聚甲醛（4%）溶液中進(jìn)行固定，倒出固定液，用微流水沖洗組織12 h左右，使用不同濃度酒精順序脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（5 μm）

1.2.2 免疫組織化學(xué)步驟

（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）熱修復(fù)抗原；（3）滅活內(nèi)源性酶；（4）滴加一抗P450arom；（5）按照免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，滴加試劑1、2；（6）DAB 顯色，蒸餾水洗滌；（7）蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.3 顯微鏡觀察 在顯微鏡下觀察拍照，陰性對(duì)照組呈藍(lán)色，陽(yáng)性產(chǎn)物染色呈棕黃色。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香化酶（P450arom）在黃鱔性腺組織中的定位

2.1.1 芳香化酶在雌性黃鱔性腺上的定位

雌性黃鱔性腺上可觀察到大小不一的卵粒，P450arom主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上（圖1B），卵膜、胞核和不成熟的卵母細(xì)胞及對(duì)照組（圖1A、B）呈陰性。

2.1.2 芳香化酶在雌雄間性黃鱔性腺上的定位

雌雄間性黃鱔性腺形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，既可觀察到卵母細(xì)胞，還可觀察到結(jié)締組織縱隔和在縱隔形成的管狀結(jié)構(gòu)的早期精細(xì)管。P450arom主要分布在退化卵母細(xì)胞膜（圖2B）和縱隔（圖 2D）上。

2.1.3 芳香化酶在雄性黃鱔性腺上的定位

雄性黃鱔組織切片中可觀察到精母細(xì)胞，且?guī)в泻谏唿c(diǎn)，P450arom主要分布在各級(jí)精母細(xì)胞上，染色較淺（圖3）。

2.2 芳香化酶（P450arom）在黃鱔腦組織中的定位

在黃鱔的腦組織中，芳香化酶主要分布在神經(jīng)細(xì)胞的胞核內(nèi)（圖4 A、B、C）。對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞（圖4 D）。且芳香化酶在雌性（圖4 A）雌雄間性（圖4 B）、雄性（圖4 C）黃鱔的腦組織中的染色越來(lái)越淺。

3 討論

黃鱔屬于硬骨魚(yú)綱，黃鱔亞科，是一種具有天然單向性逆轉(zhuǎn)特性的動(dòng)物。雌性發(fā)育的第一個(gè)周期內(nèi)黃鱔個(gè)體性腺全部表現(xiàn)為雌性特征，性成熟后，卵巢內(nèi)卵細(xì)胞逐漸凋亡，卵巢結(jié)構(gòu)趨于退化，與此同時(shí)雄性生殖細(xì)胞開(kāi)始發(fā)育，通過(guò)雌雄間性發(fā)育過(guò)渡到雄性表征。

目前關(guān)于魚(yú)類性腺分化的機(jī)理目前尚不清楚，現(xiàn)有的研究結(jié)果更多的是傾向于性激素比率假說(shuō)和下丘腦控制學(xué)說(shuō)[6]，認(rèn)為魚(yú)類性腺分化與雄激素/ 雌激素比值的高低密切相關(guān)，而芳香化酶能夠催化睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，所以芳香化酶與魚(yú)類性腺分化可能存在潛在的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化技術(shù)系統(tǒng)研究芳香化酶在黃鱔性腺和腦組織上的分布。

在雌性黃鱔的性腺中，可清晰地看到不同形狀的卵母細(xì)胞，不少卵黃顆粒沉積在細(xì)胞內(nèi)，有的卵黃顆粒充滿整個(gè)卵母細(xì)胞，核也逐漸邊移。同時(shí)，卵巢內(nèi)存在少數(shù)一、二期的卵母細(xì)胞。免疫組化結(jié)果表明，芳香化酶主要分布在成熟卵母細(xì)胞的胞質(zhì)上，不成熟的卵母細(xì)胞、卵泡膜和胞核呈陰性。由此看來(lái)，成熟卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)換雄激素為雌激素的能力大于未成熟的卵母細(xì)胞。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)卵泡體積越大，染色越深，這意味著芳香化酶的活性隨著卵泡體積的增大而增加。

在雌雄間性的黃鱔中，顯微鏡下可見(jiàn)較少的細(xì)小卵細(xì)胞，但幾乎不能發(fā)育成熟，而是逐漸凋亡吸收，同時(shí)可看到曲精小管的雛形。芳香化酶主要分布在退化卵母細(xì)胞膜和縱隔上。其染色較淺，意味著活性減弱，芳香化酶活性減弱直接導(dǎo)致血液中雌二醇水平降低，從而加快了卵母細(xì)胞退化速度，促進(jìn)雄性生殖細(xì)胞增殖。

在雄性黃鱔中，可見(jiàn)未成熟的精巢細(xì)長(zhǎng)，表面有色素斑點(diǎn)，黑色斑點(diǎn)可能是卵母細(xì)胞退化凋亡的痕跡。顯微鏡下可見(jiàn)曲精小管及精子，成熟的黃鱔精巢表面有黑色細(xì)紋，并且存在大量成熟的精子。免疫組化結(jié)果顯示，芳香化酶在黃鱔睪丸中的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，主要分布在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和生精細(xì)胞中。杜啟艷等[7]采用半定量RT-PCR方法研究芳香化酶在泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）各組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)在睪丸中幾乎無(wú)表達(dá)。由此可見(jiàn)，芳香化酶在不同魚(yú)類睪丸中的表達(dá)并不一致。

芳香化酶在腦組織免疫組化結(jié)果表明，它主要分布在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，這意味著它可能直接參與調(diào)節(jié)雌激素的合成，從而影響黃鱔的性別分化。芳香化酶可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上參與調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌[8]。這和其他魚(yú)類P450arom 在腦組織的表達(dá)研究結(jié)果不完全相同[9]。Kishida M使用Northern 雜交發(fā)現(xiàn)P450arom在斑馬魚(yú)的腦沒(méi)有表達(dá)[10]。造成各研究結(jié)果不同可能與所研究魚(yú)的類別、生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)。芳香化酶在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔的腦組織中的染色越來(lái)越淺，這意味著芳香化酶的活性愈來(lái)愈弱，即雌激素的水平愈來(lái)愈低。

由此看來(lái)，黃鱔中芳香化酶的活性與個(gè)體發(fā)育階段和性別密切相關(guān)，這與Anderson E[11]的結(jié)果類似。同時(shí)進(jìn)一步證明了芳香化酶參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過(guò)程，通過(guò)生殖軸對(duì)未分化的性腺產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響腦和性腺的性別分化。目前，對(duì)黃鱔的性逆轉(zhuǎn)發(fā)生的機(jī)制并沒(méi)有徹底研究清楚，有必要對(duì)芳香化酶進(jìn)行進(jìn)一步研究，以闡明黃鱔腦及性腺性別決定和分化的機(jī)制。

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