新疆地區(qū)維吾爾族、漢族非小細(xì)胞肺癌患者胞苷脫氨酶基因多態(tài)性對(duì)比分析

王艷娜，費(fèi)晶，程艷芳，孟玲利，王慧，鞏平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

·論著·

新疆地區(qū)維吾爾族、漢族非小細(xì)胞肺癌患者胞苷脫氨酶基因多態(tài)性對(duì)比分析

王艷娜，費(fèi)晶，程艷芳，孟玲利，王慧，鞏平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

目的 分析新疆地區(qū)維吾爾族、漢族非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者胞苷脫氨酶(CDA)基因多態(tài)性。方法 收集晚期NSCLC初治患者120例，其中維吾爾族53例(維族組)、漢族67例(漢族組)，采用直接測(cè)序的方法檢測(cè)兩組CDA A79C、G208A基因多態(tài)性。結(jié)果 兩組CDA A79C、G208A基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)。維族組A79C AA、AC、CC基因型頻率及A、C等位基因頻率分別為75.4%、18.9%、5.7%、84.9%、5.1%，漢族組分別為52.2%、29.9%、17.9%、67.2%、32.8%，兩組比較，P均<0.05；維族組G208A GG、GA基因型頻率和G、A等位基因頻率分別為94.3%、5.7%、97.2%、2.8%，漢族組分別為77.6%、22.4%、88.8%、11.2%，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論 新疆地區(qū)維吾爾族、漢族CDA A79C、G208A這兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性存在種族差異性。

胞苷脫氨酶；胞苷脫氨酶基因；非小細(xì)胞肺癌；基因多態(tài)性

吉西他濱是一種干擾影響細(xì)胞復(fù)制的二氟核苷類抗代謝物抗癌藥，與順鉑聯(lián)合方案已成為局部晚期和轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的標(biāo)準(zhǔn)抗癌一線治療方案[1,2]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，同一病理類型、同一分期的NSCLC患者，在使用含吉西他濱方案治療后療效差異很大，造成這種差異的原因可能與患者自身獨(dú)特的遺傳背景有關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類可遺傳變異中最常見的一種，廣泛且穩(wěn)定的存在于人類基因組中。SNP及其所調(diào)控的基因表達(dá)是腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥并影響藥效的重要因素，而且存在種族差別。胞苷脫氨酶(CDA)是吉西他濱代謝失活的關(guān)鍵酶，其通過脫氨基方式使吉西他濱代謝失活[3]。CDA酶活性的基因改變?cè)诩魉麨I代謝中有重要作用[4]，它編碼3個(gè)單核苷酸[5]，其中A79C與G208A遺傳基因多態(tài)性可影響CDA酶活性。本研究對(duì)新疆地區(qū)維吾爾族、漢族NSCLC患者外周血進(jìn)行基因型檢測(cè)，觀察兩族患者CDA A79C、G208A位點(diǎn)基因型、等位基因是否有民族差異性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年8月～2016年4月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的晚期NSCLC初治患者120例，男55例，女65例；年齡33～77歲，中位年齡63歲；維吾爾族53例(維族組)，漢族67例(漢族組)。病理類型：鱗癌69例，腺癌51例；臨床分期：ⅢB期60例，Ⅳ期60例；ECOG評(píng)分：0～1分84例，2分36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例均經(jīng)病理確診，且均來自新疆地區(qū)維吾爾族、漢族常住人群，相互之間無血緣關(guān)系及異族通婚史。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷不清，嚴(yán)重感染，多器官功能受損，多處以上轉(zhuǎn)移病灶者。

1.2 CDA基因多態(tài)性檢測(cè)方法 所有入選對(duì)象均采集外周血3 mL，置于EDTA管中，-80 ℃冰箱保存。根據(jù)北京天根生物科技有限公司提供的全血基因組DNA試劑盒提取DNA，查閱大量文獻(xiàn)后，根據(jù)參考文獻(xiàn)及軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成并純化。A79C、G2081引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下： A79C：5′-GTAGCTTCCCCTT-CCAGTAGCGTG-3′，5′-CTGCGCCTCTTCCTGTACAT-CT-3′，543 bp ； G208A：5′-GACAGTGCCAGGTTCTTGGG-3′，5′-CTGGCACATAGGAAGTCCAC-3′，300 bp。A79C位點(diǎn)PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃永久保存；G2081A位點(diǎn)PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，70 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃永久保存。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。將上述瓊脂糖凝膠電泳有陽(yáng)性結(jié)果的剩余PCR產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)方法進(jìn)行基因型分布遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，兩民族人群各基因型頻率及等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因測(cè)序結(jié)果 送檢120例NSCLC患者中，A79C基因出現(xiàn)野生純合基因型(AA)、雜合基因型(AC)和突變純合基因型(CC)，G208A基因出現(xiàn)野生純合基因型(GG)、雜合基因型(GA)，未出現(xiàn)突變純合基因型(AA)，見圖1～圖5。

圖1 A79C基因野生純合基因型

圖2 A79C基因雜合突變基因型

圖3 A79C基因純合突變基因型

圖4 G208A基因野生純合基因型

圖5 G208A基因雜合突變基因型

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果 納入人群符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)所選取人群的基因頻率可以代表新疆地區(qū)維吾爾族、漢族人群的基因頻率。

2.3 兩組A79C基因型及等位基因分布比較 結(jié)果見表1。

2.4 兩組G208A基因型及等位基因分布比較 結(jié)果見表2。

表1 兩組A79C基因型及等位基因分布比較

表2 兩組G208A基因型及等位基因分布比較

3 討論

吉西他濱進(jìn)入體內(nèi)后，其在血漿中90%的代謝產(chǎn)物可由CDA通過脫氨基方式降解為無活性產(chǎn)物，進(jìn)而排出體外，因此CDA酶是吉西他濱代謝的關(guān)鍵酶，它位于人類第1號(hào)染色體p35～p36.2上，全長(zhǎng)約31 kb[6]。關(guān)于CDA基因與吉西他濱相關(guān)性研究主要集中在CDA基因多態(tài)性上，CDA基因的多態(tài)性通過影響CDA酶的表達(dá)和結(jié)構(gòu)影響CDA活性，從而影響吉西他濱化療效果[7]。CDA酶活性下降可影響吉西他濱的化療療效，有研究[8]表明A79C基因突變型細(xì)胞可使CDA酶活性下降。意大利的研究組通過一系列研究發(fā)現(xiàn)，A79C中的A等位基因并非C等位基因，可造成脫氨酶活性下降[9]；同樣有研究[10,11]表明，攜帶野生型基因(AA)患者的酶活性較攜帶突變型基因(AC、CC)的患者低。這一結(jié)論在Tibaldi等[12]的研究中也得到證實(shí)。

在不同國(guó)家和地區(qū)，不同人種的A79C、G208A等位基因的突變率也有差異。一項(xiàng)來自多個(gè)國(guó)家支持的藥物基因組學(xué)研究[13]報(bào)道，入組人群均為健康志愿者，在A79C基因位點(diǎn)上，韓國(guó)人突變基因型頻率為28.0%、突變等位基因頻率為15.3%，日本人分別為37.4%、20.4%，華裔美國(guó)人分別為29.0%、15.5%，美國(guó)白種人分別為55.3%、32.7%，非裔美國(guó)人分別為16.0%、8.7%；在G208A基因位點(diǎn)上，韓國(guó)人突變基因型頻率為1.0%、突變等位基因頻率為0.5%，日本人分別為4.5%、2.2%，華裔美國(guó)人、美國(guó)白種人、非裔美國(guó)人均未出現(xiàn)突變基因，且所有研究人群均未出現(xiàn)純合突變基因型。Carpi等[14]對(duì)納入的263例樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)突變等位基因頻率為39.5%；Parmar等[15]的研究顯示，突變等位基因頻率為35%。國(guó)內(nèi)徐佳林等納入152病例，測(cè)得A79C基因位點(diǎn)的突變率為12%，G208A基因位點(diǎn)的突變率為1%。從以上研究可知，不同種族之間基因突變頻率不同，G208A基因突變率較低，且僅存在與亞洲人群中。

本實(shí)驗(yàn)納入54例維吾爾族和66例漢族NSCLC人群，對(duì)其CDA A79C、G208A基因多態(tài)性進(jìn)行比較分析，比較前已對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，結(jié)果均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示本研究納入的人群可以代表新疆地區(qū)維族和漢族群體，并且兩位點(diǎn)基因突變點(diǎn)都能夠穩(wěn)定遺傳。本研究顯示，維族組A79C AA、AC、CC基因型頻率及A、C等位基因頻率分別為75.4%、18.9%、5.7%、84.9%、5.1%，漢族組分別為52.2%、29.9%、17.9%、67.2%、32.8%，兩組比較，P均<0.05；維族組G208A GG、GA基因型頻率和G、A等位基因頻率分別為94.3%、5.7%、97.2%、2.8%，漢族組分別為77.6%、22.4%、88.8%、11.2%，兩組比較，P均<0.05。因此可得出在新疆維吾爾族、漢族NSCLC患者中，CDA A79C、G208A這兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性存在種族差異性。但本研究維吾爾族和漢族A79C、G208A等位基因突變率與以上文獻(xiàn)報(bào)道突變率不同，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因多態(tài)性可能與種族有關(guān)，但也不排除因樣本量造成偏倚的可能。本研究與徐佳林等研究的中國(guó)人基因突變頻率也略有不同，可能與納入人群有關(guān)，本研究納入人群均為NSCLC患者，徐佳林納入的樣本為健康人群和多種腫瘤患者，研究結(jié)果的不同使我們考慮是否該基因的突變與NSCLC患者之間存在某種關(guān)系，才使A79C、G208A突變率較其他研究的突變率升高，還需進(jìn)一步探討。

因此，對(duì)新疆地區(qū)維吾爾族、漢族人群與CDA A79C、G208A基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)一步確認(rèn)仍需要做大量的工作，在今后的研究中可使用更敏感、特異的等位基因分型技術(shù)，在更多的人群中納入足夠大的樣本進(jìn)行更廣泛深入的研究，可以為新疆地區(qū)維吾爾族、漢族NSCLC患者指導(dǎo)臨床用藥提供更堅(jiān)實(shí)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

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Comparision of CDA gene polymorphism between Xinjiang Uygur and Han NSCLC patients

WANGYanna,FEIJing,CHENGYanfang,MENGLingli,WANGHui,GONGPing

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To analyze the cytidine deaminase (CDA) gene polymorphism in Uygur and Han patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) in Xinjiang Uygur autonomous region. Methods Totally 120 cases of newly diagnosed advanced NSCLC patients, including 53 cases of Uygur (Uygur group) and 67 cases of Han nationality (Han group), were selected to detect the CDA A79C and G208A gene polymorphisms by direct sequencing. Results The frequencies of CDA A79C and G208A genotypes were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium (allP>0.05). The frequencies of A79C AA, AC, CC genotypes and A and C alleles were 75.4%, 18.9%, 5.7%, 84.9%, and 5.1%, respectively in the Uygur group, versus 52.2%, 29.9%, 17.9%, 67.2%, and 32.8% in the Han group (allP<0.05). The frequencies of G208A GG, GA genotypes and G and A alleles were 94.3%, 5.7%, 97.2%, and 2.8%, respectively in the Uygur group, versus 77.6%, 22.4%, 88.8%, and 11.2%, respectively, in the Han group (allP<0.05).Conclusion There are racial differences in the genetic polymorphisms of CDA A79C and G208A between the Uygur and Han nationalities in Xinjiang.

cytidine deaminase; cytidine deaminase gene; gene polymorphism; non-small-cell lung cancer;

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560381)；留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目。

王艷娜(1990-)，女，碩士，主要研究方向?yàn)槟[瘤化療與生物免疫治療。E-mail: 1415232722@qq.com

鞏平(1964-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤化療與生物免疫治療。E-mail: 18999536479@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.001

R734.2

A

1002-266X(2017)31-0001-04

2017-03-07)